Wir präsentieren ein Protokoll für die Ex-vivo-Kultivierung von menschlichem ventrikulärem Myokardgewebe. Es ermöglicht eine detaillierte Analyse der Kontraktionskraft und Kinetik sowie die Anwendung von Vor- und Nachlast, um die in vivo physiologische Umgebung genauer nachzuahmen.
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Methodenartikel
Aufbereitung von menschlichem Myokardgewebe für die Langzeitkultivierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Kultivierung von Kardiomyozyten hat eine Vielzahl von Entwicklungen erlebt, die von der zweidimensionalen (2D) Zellkultivierung bis hin zu iPSC-abgeleiteten Organoiden reichen. Im Jahr 2019 wurde eine Ex-vivo-Methode zur Kultivierung von Myokardscheiben aus menschlichen Herzproben demonstriert, während man sich dem In-vivo-Zustand der Myokardkontraktion näherte. Diese Proben stammen hauptsächlich aus Herztransplantationen oder der Platzierung von linksventrikulären Unterstützungsgeräten. Mit einem Vibratom und einem speziell entwickelten Kultivierungssystem werden 300 μm dicke Scheiben zwischen einen festen und einen Federdraht gelegt, was eine stabile und reproduzierbare Kultivierung über mehrere Wochen ermöglicht. Während des Anbaus werden die Scheiben entsprechend den individuellen Einstellungen kontinuierlich stimuliert. Kontraktionen können in Echtzeit angezeigt und aufgezeichnet werden, und pharmakologische Mittel können leicht angewendet werden. Benutzerdefinierte Stimulationsprotokolle können geplant und durchgeführt werden, um wichtige Kontraktionsparameter wie Post-Pause-Potenzierung, Stimulationsschwelle, Kraft-Frequenz-Beziehung und Feuerfestperiode zu bewerten. Darüber hinaus ermöglicht das System eine variable Vor- und Nachlasteinstellung für eine physiologischere Kultivierung.
Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, wie eine erfolgreiche Langzeitkultivierung von humanen linksventrikulären Myokardschnitten unter Verwendung einer kommerziellen biomimetischen Kultivierungslösung erzeugt werden kann.
Einleitung
In den letzten zehn Jahren hat die In-vitro-Kultivierung von Myokardzellen große Fortschritte gemacht, die von 2D- und dreidimensionalen (3D) Techniken bis hin zur Verwendung von Organoiden und induzierten pluripotenten Stammzellen reichen, die in kardiale Myozytendifferenziert sind 1,2,3. Ex-vivo- und primäre Zellkultivierungen haben sich als sehr wertvoll erwiesen, insbesondere für genetische Studien und die Arzneimittelentwicklung 4,5,6. Die Verwendung von menschlichem Gewebe verbessert den translationalen Wert der Ergebnisse. Die langfristige 3D-Kultivierung von Myokardgewebe mit intakter Geometrie ist jedoch nicht gut etabliert. Die intakte Geometrie ist ein Schlüsselmerkmal für die Nachahmung von In-vivo-Bedingungen, da die richtige Herzfunktion, die Kommunikation zwischen verschiedenen Zellen sowie Zell-Matrix-Interaktionen Voraussetzungen sind. Die Kultivierung des Myokardgewebes durchlief verschiedene Entwicklungsphasen. Die Erfolgsrate und Stabilität der Ex-vivo-Myokardgewebekultivierung waren anfangs recht gering, aber jüngste Ansätze haben vielversprechende Ergebnisse erbracht 7,8,9,10,11.
Unter diesen waren Fischer et al. die ersten, die zeigten, dass die Lebensfähigkeit und kontraktile Leistungsfähigkeit des menschlichen Myokardgewebes in der Ex-vivo-Zellproduktion für viele Wochen aufrechterhalten werden kann7. Ihre Technik basierte auf dünnen Gewebeschnitten, die aus explantiertem menschlichem Myokard geschnitten wurden, die in neu entwickelten Kultivierungskammern montiert wurden, die definierte biomechanische Bedingungen und kontinuierliche elektrische Stimulation lieferten. Diese Kultivierungsmethode ähnelt stark der In-vivo-Funktion von Myokardgewebe und wurde von mehreren unabhängigen Forschungsgruppen 2,12,13,14,15 reproduziert. Wichtig ist, dass die von Fischer et al. verwendeten Kammern auch eine kontinuierliche Registrierung der entwickelten Kräfte für bis zu 4 Monate ermöglichten und somit beispiellose Möglichkeiten für die physiologische und pharmakologische Forschung an intaktem menschlichem Myokarderöffneten 7.
Ähnliche Techniken wurden unabhängig voneinander von anderen Gruppen entwickelt und auf Human-, Ratten-, Schweine- und Kaninchenmyokardangewendet 7,10,11. Pitoulis et al. entwickelten anschließend eine physiologischere Methode, die die normale Kraft-Längen-Beziehung während eines Kontraktionszyklus reproduziert, aber für die Hochdurchsatzanalyse weniger geeignet ist16. Daher kann der allgemeine Ansatz des biomimetischen Anbaus als ein weiterer Schritt zur Reduktion, Verfeinerung und Ersetzung (3R) von Tierversuchen angesehen werden.
Die Ausschöpfung dieses Potenzials erfordert jedoch standardisierte Verfahren, High-Content-Analysen und einen hohen Durchsatz. Wir stellen eine Technik vor, die das automatisierte Schneiden von lebendem menschlichem Myokard mit der In-vitro-Wartung in einem biomimetischen Kultivierungssystem kombiniert, das kommerziell verfügbar geworden ist (siehe Materialtabelle). Mit dem vorgeschlagenen Ansatz ist die Anzahl der einzelnen Scheiben, die aus einer einzigen transmuralen Myokardprobe erzeugt werden können, nur durch die Verarbeitungszeit begrenzt. Eine Probe von ausreichender Größe und Qualität (3 cm x 3 cm) liefert oft 20-40 Gewebescheiben, die bequem mit einem automatisierten Vibratom geschnitten werden. Diese Scheiben können in zum System gehörende Kultivierungskammern gelegt werden. Die Kammern ermöglichen eine elektrische Stimulation, deren Parameter moduliert werden können (z. B. Pulsdauer, Polarität, Rate und Strom), sowie die Einstellung von Vor- und Nachlast unter Verwendung von Federdrähten in den Kammern. Die Kontraktion jeder Scheibe wird durch die Bewegung eines kleinen Magneten, der an einem Federdraht befestigt ist, registriert und als interpretierbarer Graph angezeigt. Daten können jederzeit erfasst und mit frei verfügbarer Software analysiert werden. Abgesehen vom konstanten Baseline-Pacing können geplante Protokolle durchgeführt werden, um ihre Feuerfestperiode, die Stimulationsschwelle, die Post-Pause-Potenzierung und die Kraft-Frequenz-Beziehung funktionell zu bewerten.
Diese langfristige biomimetische Kultivierung mehrerer Myokardscheiben aus einem individuellen Herzen ebnet den Weg für zukünftige Ex-vivo-Forschung in menschlichem und tierischem Gewebe und erleichtert das Screening auf therapeutische und kardiotoxische Arzneimittelwirkungen in der kardiovaskulären Medizin. Es wurde bereits auf verschiedene experimentelle Ansätze 2,12,13,15 angewendet. Hier geben wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Aufbereitung von menschlichem Gewebe und liefern Lösungen für häufig auftretende Kultivierungsprobleme.
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Protokoll
Die Gewebeentnahme für die hier beschriebenen Experimente wurde von den Institutional Review Boards der Universität München und der Ruhr-Universität Bochum genehmigt. Die Studien wurden gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Die Patienten gaben vor der Gewebeentnahme ihre schriftliche Einwilligung.
1. Gewebeentnahme
- Erhalten Sie menschliches Gewebe von Patienten, die sich einer Herztransplantation oder Herzoperation unterziehen.
- Bevor Sie das Gewebe beschaffen, bereiten Sie 2 l kardioplegiöse Lösung vor (im Folgenden als Schneidepuffer bezeichnet (Tabelle 1)).
- Nachdem Sie eine 4 cm x 4 cm große transmurale linksventrikuläre (LV) Biopsie erhalten haben, legen Sie das Gewebe sofort (innerhalb von 5 Minuten nach der Exzision) in ein verschließbares steriles Einwegbecherglas aus Kunststoff, das etwa 70 ml kalten (4 ° C) Schneidepuffer enthält. Bei 4 °C aufbewahren.
HINWEIS: Der in diesem Protokoll verwendete Schneidepuffer ermöglicht eine Kühllagerung (4 °C) des Gewebes für bis zu 36 h. Dies ermöglicht den Kalttransport des Gewebes aus Kliniken, die nicht in der Nähe des Labors liegen. Die Transportzeiten ≤ 24 h haben sich jedoch als optimal erwiesen.
2. Zubereitung von Agarose und Vibratom
- Stellen Sie sicher, dass ausreichende Anbaukammern vorbereitet und sterilisiert sind (Abbildung 1A).
- Tauchen Sie die Kammern und Graphitelektroden in 1 l einer 10% igen Isopropanollösung und rühren Sie über Nacht. Am folgenden Tag werden die Kammern für 3 min in eine 100% ige Isopropanollösung überführt und die Graphitelektroden bei 120 °C für 10 min autoklaviert.
- Lassen Sie die Kammern und Graphitelektroden unter einer Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen.
- Befestigen Sie eine Leiterplatte an jeder der Kammern entsprechend den verfügbaren Positionen auf der Wippe. Platzieren Sie zwei Graphitelektroden gemäß den Anweisungen des Herstellers an der Leiterplatte.
- Legen Sie einen 35 mm langen Petrischalendeckel auf die Oberseite der Kammer, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Richten Sie das Myodish-Kultivierungssystem (siehe Materialtabelle) in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 ein, indem Sie das System an einen Computer anschließen (Abbildung 1B).
- Bereiten Sie die 4% schmelzarme Agarose in Schneidepuffer (ohne Glukose; Tabelle 2). Die Agarose kann 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.
- Am Tag des Experiments schmelzen Sie ein Stammvolumen Agaroselösung mit einem Wasserbad, das auf 80 ° C eingestellt ist. Je nach Menge dauert das Schmelzen ca. 30 min.
- Wenn die Agarose flüssig ist, ziehen Sie 8 ml flüssige Agarose in eine 10-ml-Spritze mit zusätzlichen 2 ml Luft. Schließen Sie die Spritze mit einer sterilen Kappe und legen Sie sie 20 min lang kopfüber in ein 37 ° C warmes Wasserbad, um eine Erstarrung der Agarose zu verhindern und ihre Temperatur auszugleichen, um eine Hyperthermiebeschädigung der Probe zu vermeiden.
- Falls vorhanden, schalten Sie die Wasserkühlung des Vibratoms mindestens 30 Minuten vor dem Schneiden des Gewebes ein, um eine ausreichende Kühlleistung zu gewährleisten. Stellen Sie die Temperatur des Wasserkreislaufs auf 4 °C ein.
HINWEIS: Die hier verwendete Schneidschale und Kühlplatte enthielten beide einen eingebauten Wasserkreislauf. Dies wird dringend zur Kühlung und zur Verringerung der Kontaminationsrisiken empfohlen. Es ist jedoch auch möglich, Eis als Kühltechnik zu verwenden. Außerdem muss das Wasserkühlgerät an dieser Stelle des Protokolls nicht an die Schneidschale und/oder Kühlplatte des Vibratoms angeschlossen werden. - Reinigen Sie die Schneideschale und die Probenplatte des Vibratoms, indem Sie alle Oberflächen mindestens 3 min lang mit 100% Isopropanol spülen.
HINWEIS: Je nach verwendetem Vibratomsystem kann der Vibratomaufbau abweichen. Informationen über die Setup- und Klingenkalibrierungsmethoden finden Sie im Handbuch des Vibratoms, das im Labor vorhanden ist. - Füllen Sie das Schneidefach bis zu 90% -95% mit Schneidepuffer. Im derzeit verwendeten Setup entspricht dies ca. 400 ml. Verbinden Sie den Schlauch des Wasserkühlgeräts mit den Ventilen auf der Schneidschale und der Kühlplatte des Vibratoms.
- Desinfizieren Sie alle Werkzeuge, die für die Zubereitung benötigt werden, indem Sie sie für 5 s in eine 100% ige Isopropanollösung tauchen. Entfernen Sie die Werkzeuge aus der Isopropanollösung und trocknen Sie sie unter der Laminar-Flow-Haube an der Luft.
3. Beschneiden und Einbetten der Proben
- Die Gewebeprobe in eine 100 mm große Petrischale geben, die mit Kaltschneidepuffer gefüllt ist. Halten Sie die Schale auf einem Kühlteller bei 4 °C (an Kühler angeschlossen oder auf Eis gelegt).
- Entfernen Sie endokardiale Trabekula, indem Sie das Endokard mit einer Pinzette halten und mit einer Schere ca. 3 mm Endokardgewebe abschneiden. Entfernen Sie auf die gleiche Weise überschüssiges Fettgewebe unter dem Epikard, falls vorhanden.
- Fixieren Sie die geschnittene Gewebeprobe, endokardial mit der Seite nach oben, an einem 2 cm x 2 cm großen Gummipflaster mit vier 0,9 mm x 70 mm 20 G Nadeln, die in einer quadratischen Position (0,9 cm x 0,9 cm; Abbildung 1C, D). Stellen Sie sicher, dass die diagonale Kante jeder Nadelspitze nach innen zeigt. Dies verbessert die Fixierung und verhindert Schäden am Myokard.
ACHTUNG: Die Ausrichtung des oben genannten Quadrats sollte orthogonal zur erwarteten vorherrschenden Myofaserrichtung sein. - Schneiden Sie das gesamte überschüssige Gewebe außerhalb des Vier-Nadel-Quadrats mit einem Skalpell ab. Wenn die Größe der Originalprobe es zulässt, verwenden Sie während dieser Zubereitung zwei Myokardgewebeproben aus derselben Rohprobe.
- Legen Sie die beschnittene Probe mit einer Pinzette auf ein steriles Stück Gewebe, um überschüssigen Schneidepuffer zu entfernen, der auf der Probe verbleibt. Um ein Austrocknen der Probe zu verhindern, halten Sie die Probe nicht länger als 10 s auf dem Gewebe.
- Legen Sie die Probe(n) in eine 35 mm große Petrischale, so dass die Klinge senkrecht zur Ausrichtung der Kardiomyozyten schneidet und das Epikard nach unten zeigt. Wenn die Zubereitung zwei Proben enthält, stellen Sie sicher, dass die Proben zentriert sind und sich nicht berühren.
- Nehmen Sie die Agarosespritze aus dem Wasserbad und tauchen Sie die Probe(n) in Agarose. (Abbildung 2A). Lassen Sie die Agarose 5 min auf einer Kühlplatte erstarren. Die Probe(n) muss/müssen in Kontakt mit der Petrischale bleiben, wodurch sichergestellt wird, dass die Schnittebene parallel zur vorherrschenden Myokardfaserrichtung verläuft.
ACHTUNG: Entleeren Sie die Spritze nicht vollständig, um Luftblasen zu vermeiden. Achten Sie auf die Menge an Agarose, die beim Eintauchen der Proben in der Spritze verbleibt. Bei Luftblasen in der Schale mit den Proben ziehen Sie die Luftblasen vorsichtig zurück in die Spritze.
4. Legen Sie die Proben auf das Schneidefach
- Entfernen Sie die erstarrte Agarose, die die Probe(n) enthält, mit einem Spatel oder einem ähnlichen Werkzeug aus der 35-mm-Petrischale, indem Sie sie zwischen der Probe und der Seite der Petrischale verkeilen. Schneiden Sie einen Teil der Agarose mit einem Skalpell ab, während Sie die Proben bedeckt halten.
ACHTUNG: Entfernen Sie nicht zu viel von der Agarose. Auf den langen und kurzen Seiten in der X/Z-Ebene sollten mindestens 5 mm Agarose übrig bleiben.
HINWEIS: Die Schritte 4.2-4.4 müssen in schneller Folge (d. h. maximal 5 s) ausgeführt werden. Haben Sie alle erforderlichen Werkzeuge in Reichweite, bevor Sie beginnen. Nach der Platzierung ist keine Neupositionierung der Probe möglich. Versuchen Sie, die Exposition des Klebstoffs gegenüber Luft und Feuchtigkeit zu begrenzen. Der Kontakt mit Luft oder Flüssigkeiten verfestigt den Klebstoff und macht ihn unbrauchbar. - Platzieren und verteilen Sie mit einer Pipette 60 μL Kleber in und um die Mitte der Schneidplattform.
- Legen Sie die epikardiale Seite der in Agarose enthaltenen Probe mit einer Pinzette auf die verklebte Fläche. Nicht neu positionieren. Die endokardiale Seite der Probe muss in der Agarose sichtbar sein. Lassen Sie den Kleber für 1 min erstarren. Drücken Sie die Agarose, die die Probe enthält, vorsichtig von oben mit einem stumpfen Werkzeug (z. B. Pinzette) und verhindern Sie, dass in die Agarose eingeschnitten oder beschädigt wird.
- Legen Sie die Probenplattform an die vorgesehene Position in der Schneideschale des Vibratoms, gefüllt mit Schneidepuffer.
5. Starten des Vibratoms
- Stellen Sie die Schwingungsamplitude auf 1 mm und die anfängliche Schnittgeschwindigkeit auf 0,07 mm/s ein. Stellen Sie die Dicke der Scheibe auf 300 μm ein, um die Scheiben zu schneiden.
- Solange die Klinge nur die Agarose schneidet, erhöhen Sie die Schnittgeschwindigkeit auf ihr Maximum, das in diesem Fall 1,50 mm/s beträgt. Sobald das Vibratom beginnt, das Gewebe zu schneiden, verringern Sie die Geschwindigkeit sofort auf 0,07 mm/s.
HINWEIS: Wenn das Gewebe nicht glatt geschnitten wird, z. B. wenn sich große fibrotische Bereiche in der Probe befinden, kann es hilfreich sein, die Schnittamplitude auf bis zu 1,5 mm zu erhöhen und die Schnittgeschwindigkeit auf 0,04 mm/s zu reduzieren.
6. Medium- und Inkubatorvorbereitung während des Schneidevorgangs
- Füllen Sie jede Kultivierungskammer mit 2,4 ml vollständigem Kultivierungsmedium (Tabelle 3).
- Stellen Sie die mit Medium gefüllten Anbaukammern auf das Anbausystem im Inkubator-Set bei 37 °C, 5% CO 2, 21% O2 und einer Luftfeuchtigkeit von 80%. Äquivalent des Mediums für mindestens 20 min.
- Verbinden Sie das Anbausystem mit einem Computer und starten Sie das entsprechende Softwareprogramm.
- Stellen Sie die Wippgeschwindigkeit auf 60 U / min ein und stellen Sie die Stimulationsparameter (Stimulationsimpulse und Frequenz) vor. Stellen Sie für menschliche Herzschnitte die Standardstimulation auf biphasische Impulse mit 50 mA Strom ein, die jeweils aus 3 ms positivem Strom, einer Pause von 1 ms und einem Impuls von 3 ms invertiertem Strom bestehen, bei einer Schrittfrequenz von 30 Schlägen pro Minute (BPM).
HINWEIS: In gut erhaltenen Geweben liegt die typische Stimulationsschwelle bei etwa 15 mA. Um eine zuverlässige Stimulation zu gewährleisten und eine mögliche Erhöhung der Stimulationsschwelle zu berücksichtigen, wird empfohlen, den Strom auf einen Wert einzustellen, der die Stimulationsschwelle um das Zwei- bis Dreifache überschreitet. - Überprüfen Sie die Elektrodenanzeigen der Software, um sicherzustellen, dass die Elektroden der Kultivierungskammern korrekt funktionieren.
HINWEIS: Es besteht Handlungsbedarf, wenn die Kanalanzeige in der Anbausoftware rot wird. In diesem Fall sind die bipolaren Impulsladungen nicht ausgeglichen.
7. Vorbereiten der Scheiben
HINWEIS: Anfängliche subendokardiale Scheiben sind in der Regel nicht für die Gewebekultivierung geeignet und müssen aufgrund einer ungleichmäßigen Morphologie verworfen werden. Nach den ersten fünf bis 10 Scheiben verbessern sich Slice-Textur und Morphologie. Die ideale Scheibe ist mindestens 1 cm x 1 cm groß, hat keine oder nur begrenzte fibrotische Flecken, ist nicht fragmentiert und hat eine homogene Faserausrichtung (Abbildung 2B, D). Interstitielle Fibrose, die sich zwischen den Myokytenfasern befindet, ist oft im versagenden menschlichen Myokard vorhanden. Überraschenderweise ist dies kein negativer Prädiktor für den Anbauerfolg.
- Gießen Sie eine ausreichende Menge an Kaltschneidepuffer in einen 5 cm langen Petrischalendeckel, um sicherzustellen, dass die Scheiben nicht austrocknen. Legen Sie die Scheiben in den Deckel der Petrischale, der den kalten Schneidepuffer enthält.
- Trennen Sie die Agarose mit einer Pinzette vom Gewebe. Verhindern Sie, dass Sie das Gewebe berühren. Behandeln Sie das Gewebe vorsichtig, da jede Schädigung des Gewebes die Erfolgsrate der Kultivierung verringert.
- Bestimmen Sie die Richtung der Myokardfasern durch genaue Inspektion gegen eine Lichtquelle. Dies ist von Bedeutung, wenn die Kunststoffdreiecke in Schritt 7.6 am Gewebe befestigt werden.
HINWEIS: Die Schritte 7.4 und 7.5 müssen innerhalb von 5 s kurz hintereinander ausgeführt werden. - Befestigen Sie zwei Kunststoffdreiecke mit Klebstoff an einer Probe, um das Gewebe in den Kultivierungskammern zu verankern.
- Legen Sie 1 μL Kleber auf einen sterilen Petrischalendeckel. Verwenden Sie eine hakenförmige Pinzette, um eines der autoklavierten Kunststoffdreiecke aufzunehmen. Tauchen Sie schnell die Vorderkante des Dreiecks in den Kleber und kleben Sie das Dreieck senkrecht zur Kardiomyozytenausrichtung auf die Probe. Wiederholen Sie den Vorgang für das andere Dreieck.
- Schneiden Sie Gewebe, das die Dreiecksbreite überschreitet, mit einem Skalpell ab (Abbildung 2C). Legen Sie die Scheibe mit den beiden montierten Dreiecken zurück in den Schneidepuffer der Schneideschale.
HINWEIS: Wiederholen Sie die Schritte 7.2 bis 7.5, bis genügend Scheiben vorbereitet sind, um die Anbaukammern zu füllen. Wir empfehlen, ein paar zusätzliche Scheiben vorzubereiten, um den Ersatz von Scheiben mit schlechter Kontraktion zu ermöglichen.
8. Mounten der Slices
HINWEIS: Die Nachlast wird durch die Steifigkeit des Federdrahtes in den Kultivierungskammern bestimmt. Je nach Dicke des Federdrahtes stehen drei verschiedene Typen zur Verfügung.
- Nehmen Sie eine mediengefüllte Kultivierungskammer aus dem Inkubator. Wählen Sie eine der vorbereiteten Scheiben aus und führen Sie sie in die Kammer ein, indem Sie ein Dreieck mit jedem Stift verbinden.
- Passen Sie den Abstand zwischen den Montagestiften entsprechend der Stichprobengröße an. Stellen Sie sicher, dass die Probe in ein Medium eingetaucht ist. Stellen Sie die Kammer wieder in die dafür vorgesehene Steckdose des Anbausystems im Inkubator.
ACHTUNG: Überdehnen Sie das Gewebe nicht und biegen Sie den Federdraht nicht zu sehr! - Stellen Sie die Vorspannung nach dem Platzieren der Schale auf die Wippe ein.
- Verringern Sie die Vorspannung, indem Sie die Einstellschraube gegen den Uhrzeigersinn drehen. Tun Sie dies, bis sich die Baseline des entsprechenden Diagramms auf dem Computerbildschirm nicht mehr ändert.
- Erhöhen Sie vorsichtig die Vorspannung (d.h. erhöhen Sie die Spannung), indem Sie die Einstellschraube im Uhrzeigersinn drehen. Fahren Sie für die Kammern mit der höchsten Steifigkeit fort, bis die entsprechende Basislinie in der Grafik um 1000-1200 Einheiten gestiegen ist, was 1 mN Vorspannung entspricht.
HINWEIS: Die genaue Einstellung hängt von der individuellen Federkonstante einer Kultivierungskammer ab, die durch Kalibrierung vor einem Experiment gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt werden kann. Die Aufzeichnungssoftware ermöglicht die Berücksichtigung der einzelnen Kammerkalibrierung, so dass Kräfte gleichmäßig in μN dargestellt werden. Es wird empfohlen, die elektrische Stimulation von Beginn der Kultivierung an anzuwenden. Daher ist es gut möglich, dass sich der Slice während der Vorspanneinstellung zusammenzieht. Konzentrieren Sie sich in diesem Fall auf die diastolische Baseline, um die Vorlast zu bewerten.
9. Wechsel des Mediums
- Bereiten Sie das Kulturmedium gemäß der Rezeptur in Tabelle 3 vor. Kurz vor der Verwendung des Mediums 50 μL β-Mercaptoethanol (50 mM) in ein 50-ml-Röhrchen geben. Bei 4 °C lagern.
- Einmal alle 2 Tage teilweise das Kulturmedium austauschen. Erfrischen Sie das Medium alle 2 Tage, wenn eine langfristige Kultivierung der Myokardscheiben gewünscht ist.
- Das frische Medium in einem Wasserbad oder Heißluftinkubator bei 37 °C für 30-45 min vorwärmen. Entfernen Sie eine Kultivierungskammer aus dem Inkubator und stellen Sie sie unter eine Laminar-Flow-Haube.
VORSICHT: Es ist wichtig, die Kammer sowie das Medium bei 37 ° C (> 35 ° C) warm zu halten, um Hyperkontrakturen aufgrund niedriger Temperaturen zu vermeiden. Weniger ausgeprägte Schäden können als Anstieg der diastolischen Spannung innerhalb weniger Stunden nach dem mittleren Austausch vorliegen. Dies scheint sich zu erholen, aber wiederholter Stress kann zu einer akkumulierenden Verschlechterung führen. - Entfernen Sie das Medium aus der Kultivierungskammer, so dass etwa 0,8 ml in der Kammer verbleiben. 1,6 ml frisches Medium in dieselbe Kammer geben. Das Gesamtvolumen des Mediums sollte etwa 2,4 ml pro Kammer betragen.
- Legen Sie die Abdeckung der Kammer zurück und stellen Sie die Kultivierungskammer wieder in ihre jeweilige Position.
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Ergebnisse
Die Kontraktion der Myokardscheiben wurde nach dem Einsetzen der Kultivierungskammer in den entsprechenden Anschluss auf dem Computerbildschirm angezeigt (Abbildung 3). Die Kontraktion der menschlichen Myokardscheiben begann sofort nach der Stimulation. Die Scheiben wurden für 5-10 min hyperkontrahiert. Dies war sichtbar als eine Zunahme der diastolischen Kräfte, verursacht durch eine tonische Kontraktur von beschädigten Gewebefraktionen. Dieser Prozess wurde innerhalb von 1-1,5 h in untersc...
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Diskussion
In der Vergangenheit hat die kardiovaskuläre Forschung große Fortschritte bei der Kultivierung von Kardiomyozyten gemacht. Die 3D-Kultivierung von Kardiomyozyten mit intakter Geometrie ist jedoch noch nicht gut etabliert. Im Vergleich zu früheren Protokollen, die für die Ex-vivo-Kultivierung von Myokardgewebe angewendet wurden, ähnelt das hier beschriebene Protokoll der In-vivo-Umgebung des Gewebes genauer. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung von Pre- und Afterload eine biomimetischere Umgebung. Wir...
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Offenlegungen
JH, PS, DM und KL haben nichts offenzulegen. AD und TS sind Gesellschafter der InVitroSys GmbH, die das Myodish-Kultivierungssystem bereitstellt.
Danksagungen
Die Forschung wurde durch die DZHK-Zuschüsse 81Z0600207 (JH, PS und DM) und 81X2600253 (AD und TS) gefördert.
Die Autoren danken Claudia Fahney, Mei-Ping Wu und Matthias Semisch für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung der Aufbauten sowie für die regelmäßige Aufrechterhaltung der Gewebekultivierung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Chemicals | |||
| Agarose Niedriger Schmelzpunkt | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butandion-Monoxim) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptin | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-Supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipin | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / Streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| LaborgeräteFlow-Schrank | |||
| Thermo Scientific | KS15 | ||
| Frigomix Wasserpumpe und Kühlung + BBraun Thermomix BM | BBraun | Hausgemachte Kombination aus Kühl- und Heizlösung. | |
| Inkubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish Kultursystem | InVitroSys GmbH MyoDish | 1 | Myodish Kultursystem |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Wasserbad 37 Grad | Haake | SWB25 | |
| Wasserbad 80 Grad | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL Einwegbecher aus Kunststoff | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtrationseinheit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Nadeln 0,9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Kunststoffdreiecke | Hausgemachter | ||
| Razor Derby Premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Rasierer Gillette Silber Blau | Gillette | 7393560010170 | |
| Skalpell Einwegfeder | 02.001.30.020 | ||
| Spritze 10 mL Luer-Spitze BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Gewebekulturschale 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Gewebekulturschale 3,5 cm | Falcon | 353001 | |
| Röhrchen 50 mL | Falcon | Artikel-Nr.: 352070 |
Referenzen
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