Wir präsentieren ein Protokoll für die Ex-vivo-Kultivierung von menschlichem ventrikulärem Myokardgewebe. Es ermöglicht eine detaillierte Analyse der Kontraktionskraft und Kinetik sowie die Anwendung von Vor- und Nachlast, um die in vivo physiologische Umgebung genauer nachzuahmen.
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Methodenartikel
Aufbereitung von menschlichem Myokardgewebe für die Langzeitkultivierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Kultivierung von Kardiomyozyten hat eine Vielzahl von Entwicklungen erlebt, die von der zweidimensionalen (2D) Zellkultivierung bis hin zu iPSC-abgeleiteten Organoiden reichen. Im Jahr 2019 wurde eine Ex-vivo-Methode zur Kultivierung von Myokardscheiben aus menschlichen Herzproben demonstriert, während man sich dem In-vivo-Zustand der Myokardkontraktion näherte. Diese Proben stammen hauptsächlich aus Herztransplantationen oder der Platzierung von linksventrikulären Unterstützungsgeräten. Mit einem Vibratom und einem speziell entwickelten Kultivierungssystem werden 300 μm dicke Scheiben zwischen einen festen und einen Federdraht gelegt, was eine stabile und reproduzierbare Kultivierung über mehrere Wochen ermöglicht. Während des Anbaus werden die Scheiben entsprechend den individuellen Einstellungen kontinuierlich stimuliert. Kontraktionen können in Echtzeit angezeigt und aufgezeichnet werden, und pharmakologische Mittel können leicht angewendet werden. Benutzerdefinierte Stimulationsprotokolle können geplant und durchgeführt werden, um wichtige Kontraktionsparameter wie Post-Pause-Potenzierung, Stimulationsschwelle, Kraft-Frequenz-Beziehung und Feuerfestperiode zu bewerten. Darüber hinaus ermöglicht das System eine variable Vor- und Nachlasteinstellung für eine physiologischere Kultivierung.
Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, wie eine erfolgreiche Langzeitkultivierung von humanen linksventrikulären Myokardschnitten unter Verwendung einer kommerziellen biomimetischen Kultivierungslösung erzeugt werden kann.
Einleitung
In den letzten zehn Jahren hat die In-vitro-Kultivierung von Myokardzellen große Fortschritte gemacht, die von 2D- und dreidimensionalen (3D) Techniken bis hin zur Verwendung von Organoiden und induzierten pluripotenten Stammzellen reichen, die in kardiale Myozytendifferenziert sind 1,2,3. Ex-vivo- und primäre Zellkultivierungen haben sich als sehr wertvoll erwiesen, insbesondere für genetische Studien und die Arzneimittelentwicklung 4,5,6. Die Verwendung von mensch....
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Protokoll
Die Gewebeentnahme für die hier beschriebenen Experimente wurde von den Institutional Review Boards der Universität München und der Ruhr-Universität Bochum genehmigt. Die Studien wurden gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Die Patienten gaben vor der Gewebeentnahme ihre schriftliche Einwilligung.
1. Gewebeentnahme
- Erhalten Sie menschliches Gewebe von Patienten, die sich einer Herztransplantation oder Herzoperation unterziehen.
- Bevor Sie das Gewebe beschaffen, bereiten Sie 2 l kardioplegiöse Lösung vor (im Folgenden als Schneidepuffer bezeichnet (Tabelle 1)).
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Ergebnisse
Die Kontraktion der Myokardscheiben wurde nach dem Einsetzen der Kultivierungskammer in den entsprechenden Anschluss auf dem Computerbildschirm angezeigt (Abbildung 3). Die Kontraktion der menschlichen Myokardscheiben begann sofort nach der Stimulation. Die Scheiben wurden für 5-10 min hyperkontrahiert. Dies war sichtbar als eine Zunahme der diastolischen Kräfte, verursacht durch eine tonische Kontraktur von beschädigten Gewebefraktionen. Dieser Prozess wurde innerhalb von 1-1,5 h in untersc.......
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Diskussion
In der Vergangenheit hat die kardiovaskuläre Forschung große Fortschritte bei der Kultivierung von Kardiomyozyten gemacht. Die 3D-Kultivierung von Kardiomyozyten mit intakter Geometrie ist jedoch noch nicht gut etabliert. Im Vergleich zu früheren Protokollen, die für die Ex-vivo-Kultivierung von Myokardgewebe angewendet wurden, ähnelt das hier beschriebene Protokoll der In-vivo-Umgebung des Gewebes genauer. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung von Pre- und Afterload eine biomimetischere Umgebung. Wir.......
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Offenlegungen
JH, PS, DM und KL haben nichts offenzulegen. AD und TS sind Gesellschafter der InVitroSys GmbH, die das Myodish-Kultivierungssystem bereitstellt.
Danksagungen
Die Forschung wurde durch die DZHK-Zuschüsse 81Z0600207 (JH, PS und DM) und 81X2600253 (AD und TS) gefördert.
Die Autoren danken Claudia Fahney, Mei-Ping Wu und Matthias Semisch für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung der Aufbauten sowie für die regelmäßige Aufrechterhaltung der Gewebekultivierung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Chemicals | |||
| Agarose Niedriger Schmelzpunkt | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butandion-Monoxim) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptin | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-Supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipin | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / Streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| LaborgeräteFlow-Schrank | |||
| Thermo Scientific | KS15 | ||
| Frigomix Wasserpumpe und Kühlung + BBraun Thermomix BM | BBraun | Hausgemachte Kombination aus Kühl- und Heizlösung. | |
| Inkubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish Kultursystem | InVitroSys GmbH MyoDish | 1 | Myodish Kultursystem |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Wasserbad 37 Grad | Haake | SWB25 | |
| Wasserbad 80 Grad | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL Einwegbecher aus Kunststoff | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtrationseinheit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Nadeln 0,9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Kunststoffdreiecke | Hausgemachter | ||
| Razor Derby Premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Rasierer Gillette Silber Blau | Gillette | 7393560010170 | |
| Skalpell Einwegfeder | 02.001.30.020 | ||
| Spritze 10 mL Luer-Spitze BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Gewebekulturschale 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Gewebekulturschale 3,5 cm | Falcon | 353001 | |
| Röhrchen 50 mL | Falcon | Artikel-Nr.: 352070 |
Referenzen
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781(2020).
- Lu, K., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
