Detektion und Quantifizierung von tunnelnden Nanoröhren mittels 3D-Volumenansichtsbildern

Deepak Kunhi Valappil; Abinaya Raghavan; Sangeeta Nath

doi:10.3791/63992

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Methodenartikel

Detektion und Quantifizierung von tunnelnden Nanoröhren mittels 3D-Volumenansichtsbildern

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DOI:

10.3791/63992

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31. August 2022

Deepak Kunhi Valappil^*¹ , Abinaya Raghavan^*¹ , Sangeeta Nath¹

¹Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, India

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Tunnelnde Nanoröhren (TNTs) sind in erster Linie offene F-Aktin-Membran-Nanoröhren, die benachbarte Zellen verbinden und die interzelluläre Kommunikation erleichtern. Das bemerkenswerte Merkmal, das TNTs von anderen Zellvorsprüngen unterscheidet, ist die schwebende Natur der Nanoröhrchen zwischen den Zellen. Hier charakterisieren wir TNTs, indem wir eine 3D-Volumenansicht von konfokalen Z-Stack-Bildern erstellen.

Zusammenfassung

Jüngste Entdeckungen haben gezeigt, dass Zellen einen direkten, langreichweitigen interzellulären Transfer über Aktinmembrankanäle im Nanobereich durchführen, nämlich "tunnelnde Nanoröhren" (TNTs). TNTs sind definiert als offene, lipid-doppelschichtige Membranverlängerungen, die die Kontinuität zwischen benachbarten Zellen mit Durchmessern zwischen 50 nm und 1 μm vermitteln. TNTs wurden zunächst in neuronalen Zellen nachgewiesen, aber aufeinanderfolgende Studien haben die Existenz von TNTs in verschiedenen Zelltypen und Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen, Virusinfektionen und Krebs gezeigt. Mehrere Studien haben sich auf geschlossene, elektrisch gekoppelte Membran-Nanostrukturen zwischen benachbarten Zellen als TNTs oder TNT-ähnliche Strukturen bezogen.

Die Aufklärung der Ultrastruktur in Bezug auf die Membrankontinuität am Endpunkt ist technisch anspruchsvoll. Darüber hinaus sind Studien zur Zell-Zell-Kommunikation aufgrund des Fehlens spezifischer Marker eine Herausforderung hinsichtlich der Charakterisierung von TNTs mit herkömmlichen Methoden. TNTs werden in erster Linie als F-Aktin-basierte, offene Membranvorsprünge definiert. Eine wesentliche Einschränkung ist jedoch, dass F-Aktin in allen Arten von Vorsprüngen vorhanden ist, was es schwierig macht, TNTs von anderen Vorsprüngen zu unterscheiden. Eine der bemerkenswerten Eigenschaften von F-Aktin-basierten TNTs ist, dass diese Strukturen zwischen zwei Zellen schweben, ohne das Substrat zu berühren. Daher können unterschiedliche F-Aktin-gefärbte TNTs bequem von anderen Vorsprüngen wie Filopodien und Neuriten unterschieden werden, basierend auf ihrem Schweben zwischen den Zellen.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Internalisierung von oligomerem Amyloid-β_1-42(oAβ) über Aktin-abhängige Endozytose die aktivierte p21-aktivierte Kinase-1 (PAK1) stimuliert, die die Bildung von F-Aktin-haltigen TNTs vermittelt, die mit Phospho-PAK1 zwischen SH-SY5Y-neuronalen Zellen koexprimiert werden. Dieses Protokoll beschreibt eine 3D-Volumenanalysemethode zur Identifizierung und Charakterisierung von TNTs aus den aufgenommenen z-Stack-Bildern von F-Actin- und Phospho-PAK1-immungefärbten Membranvorsprüngen in oAβ-behandelten neuronalen Zellen. Darüber hinaus unterscheiden sich TNTs von der Entwicklung von Neuriten und neuronalen Auswüchsen auf Basis von F-Aktin- und β-III-Tubulin-immungefärbten Membranleitungen.

Einleitung

Tunneling Nanotubes (TNTs) sind F-Aktin-basierte, hauptsächlich offene Membrankanäle und spielen eine wichtige Rolle beim interzellulären Transfer von Fracht und Organellen¹. Das einzigartige Merkmal von TNTs ist, dass sie benachbarte Zellen ohne Kontakt mit dem Substrat verbinden; Sie sind über 10-300 μm lang und ihre Durchmesser variieren zwischen 50 nm und 1 μm ^2,3. TNTs sind vorübergehende Strukturen, und ihre Lebensdauer dauert zwischen einigen Minuten und mehreren Stunden. TNTs wurden erstmals in PC12-Nervenzellen nachgewiesen¹; Später zeigten zahlreiche St....