Summary
Aqui apresentamos um protocolo para o isolamento de BMMs de ratos SD, chamado de método de adesão secundária.
Abstract
Com uma diminuição da densidade mineral óssea, os ossos são mais propensos a fraturar, afetando negativamente a qualidade de vida do paciente. O crescimento e o desenvolvimento dos ossos são regulados principalmente por osteoblastos e osteoclartos. Tem sido amplamente aceito que os osteoclatos são derivados de células monócito-macrófagos de medula óssea (MMC). BMMs e outras células-tronco hematopoiéticas estão localizados na cavidade da medula óssea. Portanto, isolar BMs estáveis de diferentes populações de células heterogêneas é um grande desafio. Aqui apresentamos um protocolo para o isolamento de BMMs de ratos SD, chamado de método de adesão secundária. Foram coletadas células aderentes cultivadas por 24-48 h na cultura primária. A análise citométrica de fluxo mostrou que aproximadamente 37,94% das células eram CD11b/c+ (antígeno da superfície monocito-macrófago). A coloração de fosfattase de ácido resistente ao tartarato (TRAP) e a análise da mancha ocidental demonstraram que os BMMs poderiam se diferenciar em osteoclartos in vitro. Os achados acima sugeriram que as células de adesão secundárias poderiam ser consideradas como um modelo celular adequado para a pesquisa de diferenciação de osteoclatos.
Introduction
Foi relatado que as células de linhagem monocito-macrófago existentes na medula óssea podem se diferenciar em monócitos sanguíneos e macrófagosteciduais 1,2. As células acima, que podem se diferenciar em osteoclastas para equilibrar o crescimento e o desenvolvimento ósseo, são comumente utilizadas como modelo celular para induzir osteos in vivo 3,4. A medula óssea é um tecido especial que contém vários tipos diferentes de células, que incluem, mas não se limitam apenas a células-tronco mesenquimais de medula óssea, células monócito-macrófagos de medula óssea (MMMs), células-tronco hematopoiéticas, células endoteliais e células imunes. De fato, vários estudos anteriores sugeriram que as células aderentes que saíram correndo da cavidade da medula óssea do osso longo poderiam se diferenciar em osteoblastos, osteoclatos, condrócitos ou adipócitos 5,6,7,8. Embora diferentes métodos de isolamento e cultura tenham sido usados para produzir diferentes populações celulares homogêneas, ainda há grandes desafios em isolar e cultivar BMMs de uma variedade de tipos de células diferentes.
Vários métodos foram desenvolvidos para extrair macrófagos mononucleares de medula óssea (BMSCs). No entanto, a maioria desses métodos são complexos 9,10,11. Por exemplo, a centrifugação de gradiente de densidade requer um kit especializado e a operação é demorada e complicada. Este método é adequado para o isolamento de BMMs de amostras de sangue de alto volume, mas não a partir de amostras de medula óssea 9,12,13. Além disso, extrair amostras de tecido usando digestão de colagem é um procedimento complexo e demorado; este método não é recomendado para o isolamento de BMMs a partir de amostras de medula óssea14,15. Além disso, embora a separação do fluxo possa resultar em populações de monócitos/macrófagos altamente purificados, requer tamanhos amostrais muito grandes e requisitos elevados de instrumentos e equipamentos10,16. Além disso, o método de enriquecimento de microesferas é extremamente caro e não é viável em um laboratório geral17.
Portanto, no presente estudo foi proposto um método conveniente, rápido e barato para o isolamento de macrófagos mononucleares da medula óssea. As células de medula óssea aderidas para diferentes pontos de tempo foram utilizadas para isolar os BMMs utilizando um método secundário de adesão. Os BMMs extraídos com o método acima poderiam induzir a formação de osteoclatos in vitro, fornecendo assim um modelo celular simples e conveniente para o estudo futuro da osteoporose in vitro.
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Protocol
Todos os experimentos deste estudo foram realizados de acordo com as diretrizes de experimento animal do Centro de Pesquisa Animal do Laboratório da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang (Aprovação Nº: IACUC-20181029-11).
1. Extração celular
- Coloque os ratos Sprague-Dawley (ratos SD, 1-10 dias de idade, masculino ou feminino) nas gaiolas de eutanásia preenchidas com CO2 a uma taxa equilibrada de 30%-70% de volume de contêiner/minuto. Depois que os ratos perdem a consciência (20-60 min), eutanize o rato por luxação cervical para garantir uma morte indolor.
- Mergulhe os ratos em 75% de álcool por 10 minutos para desinfecção.
- Remova cuidadosamente todos os membros do rato com tesouras e fórceps, aspire com PBS usando uma pipeta e lave o sangue aderindo aos membros.
- Adicione 5 mL de solução de penicilina/estreptomicina em 500 mL de DMEM e misture bem. Pegue um tubo de centrífuga estéril de 50 mL, adicione 5 mL de FBS e 45 mL de meio DMEM e misture bem para obter um DMEM de 10% FBS contendo 1% de solução de penicilina/estreptomicina. Adicione 2 mL do meio de cultura acima em um tubo de 5 mL.
- Transfira os ossos do membro para o tubo de 5 mL. Use uma tesoura para cortar os ossos do membro no tubo em pequenos pedaços (1-3 mm) e misture o homogeneado para suspender novamente as células de medula óssea no meio da cultura. Fique por 5 minutos até que os fragmentos de tecido se instalem na parte inferior do tubo.
- Adicione 10 mL de 10% FBS DMEM em um prato de cultura de 100 mm, e depois transfira o supernasce para o prato de cultura. Ao aspirar o supernante, evite transferir os detritos teciduais para o prato de cultura.
- Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por aproximadamente 24 h. Após esse período de incubação, a maioria das células-tronco mesenquimais aderirá à parede de pratos da cultura e crescerá lentamente, enquanto a maioria dos BMMs ainda será suspensa no meio da cultura.
- Transfira a suspensão celular no prato de cultura de 100 mm para um novo frascode 25 cm 2 e continue a cultivar as células a 37 °C e 5% de CO2 por mais 24 h. Os BMMs aderirão à parede de frascos a 24-48 h de cultura. Remova o meio antigo cuidadosamente e substitua-o por meio fresco após os BMMs terem aderido à parede do frasco.
- Subcultura quando as células do frasco atingiram 80%-90% de confluência.
NOTA: Todas as células foram cultivadas a 37 °C e 5% de CO2. Durante a cultura, a morfologia celular foi gradualmente unificada. As células eram grandes, de forma irregular, de crescimento radial e presas ao frasco em uma forma de disco, onde múltiplos núcleos podiam ser observados.
2. Mancha FACS da célula
- Digestão de trippsina usando 1-2 mL de trippsina comercial a 37 °C e 5% DE CO2 por 5 min e conte células aderentes secundárias para garantir uma contagem final de células de 100.000/amostra (células de contagem com hemocitômetro Neubauer).
- Divida as células em três grupos (500 μL de PBS contém 100.000 células): (1) o grupo de controle em branco contendo células não manchadas; (2) o grupo controle do isótipo; e (3) o grupo experimental (coloração CD11b/c).
- Incubar anticorpos primários (sem anticorpos para o grupo controle em branco; controle isótipo anti-CD11 para o grupo controle do isótipo, 0,6 μL de anticorpo/amostra, 1 μg/amostra; anti-CD11b/c para o grupo experimental, 1 μL de anticorpo/amostra, 1 μg/amostra) no gelo por 30 minutos.
- Centrifugar a 300-350 x g por 5 min, descartar o supernaspeuta e resuspensar as células com 500 μL de PBS. Repita o procedimento acima uma vez para garantir que os anticorpos primários desvinculados sejam lavados.
- Incubar o anticorpo secundário correspondente (sem anticorpo para o grupo de controle em branco; IgG anti-coelho de cabra para o controle do isótipo e os grupos experimentais, 0,25 μL anticorpo/amostra, 1:2.000) no gelo no escuro por 30 minutos.
- Centrifugar a 300-350 x g por 5 min, descartar o supernaspeuta e resuspensar as células com 500 μL de PBS. Repita o procedimento acima uma vez para garantir que os anticorpos desvinculados sejam lavados.
- Detecte as células positivas do CD11b/c por citometria de fluxo (10.000 células/amostra) e analise os dados por software (por exemplo, FlowJo 7.5).
NOTA: Para obter o percentual final das células CD11b/c+, utilizou-se a seguinte fórmula: Percentual de células CD11b/ c + no grupo experimental - a porcentagem de células CD11 + no grupo de controle de isótipo.
3. Manchas wright-giemsa
- Sementes as células secundárias aderentes que foram passagemdas três vezes para folhas de escalada decélulas de 35 mm 2 (1 × 106 células/bem) e cultura a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
- Descarte o meio de cultura e lave três vezes com PBS.
- Adicione a solução de corante Wright-Giemsa (0,5 mL-0,8 mL) à folha de escalada celular por 1 min.
- Misture o corante com água destilada (0,5 mL-0,8 mL) com um cotonete e suporte por 10 minutos.
- Lave a solução de corante com água destilada e depois seque por 1-3 min. Observe sob um microscópio.
4. Coloração de armadilha
- Sementes as células secundárias aderentes que foram passagemdas três vezes para folhas de escalada decélulas de 35 mm 2 (1 × 106 células/bem) e cultura a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
- Substitua o médio antigo pelo meio de indução de 10% FBS DMEM ou osteoclante complementado por 50 ng/mL receptor de ligante de fator nuclear-κB (RANKL) e 30 ng/mL de fator estimulante de colônia macifágica (M-CSF), e cultura a 37 °C e 5% CO2 por mais 7 dias.
- Manche as células com o kit de coloração TRAP de acordo com o protocolo do fabricante e observe sob um microscópio.
NOTA: As células TRAP-positivas foram definidas como osteoclastas, que eram roxas sob um microscópio leve. O número de células TRAP-positive foi medido usando o software ImageJ.
5. Mancha ocidental
- Sementes as células secundárias aderentes que foram passagem três vezes em folhas de escalada decélulas de 35 mm 2 (1 × 106 células/bem) e cultura por 24 h.
- Substitua o médio antigo por um MMEM de 10% fresco ou meio de indução de osteoclato (50 ng/mL de RANKL e 30 ng/mL de M-CSF) e cultura por mais 7 dias a 37 °C e 5% de CO2.
- Extrair proteínas celulares totais com tampão RIPA, separar por 10% de SDS-PAGE e transferir para membranas de flúor de polivinida 18,19.
- Bloqueie com 5% de pó de leite desnatado (25 mL) por 2h e lave três vezes, por 10 minutos cada vez, com TBS-Tween 20 (TBST).
- Incubar anticorpos primários a 4 °C durante a noite (anticorpo/banda diluído anti-β, anti-TRAP e anti-catepsina K; todos os anticorpos primários foram diluídos 1:1.000, 10 mL de anticorpo/banda diluído), e lavaram três vezes com TBST.
- Incubar o anticorpo secundário (anti-coelho de cabra IgG, diluição de 1:2.000, anticorpo/banda diluído de 10 mL) à temperatura ambiente por 2 h, e lavar três vezes com TBST. Visualize as bandas de proteínas usando uma solução em desenvolvimento.
NOTA: Os níveis de expressão das proteínas acima foram normalizados para β-actina.
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Representative Results
A população de células aderentes secundárias era estável e uniforme. Com a proliferação contínua das células, a maioria das células tornou-se maior, com forma irregular e cresceu em um disco aderente radial (Figura 2C,D). A citometria de fluxo mostrou que a porcentagem de células expressando CD11b/c, um marcador molecular na superfície das células de linhagem monocito-macrófago, foi de aproximadamente 37,94% (Figura 2A,B). Para verificar ainda que as células positivas CD11b/c eram células de linhagem monocito-macrófago, a diferenciação das células aderentes secundárias em osteoclatos foi induzida após o tratamento celular com RANKL e M-CSF. Os resultados de coloração do TRAP mostraram que, em comparação com o grupo controle, o número de grânulos roxo-vermelho intracelular foi significativamente aumentado em células induzidas com RANKL e M-CSF (Figura 2E,F). Além disso, os níveis de expressão das proteínas específicas do osteoclato TRAP e cathepsina K foram significativamente aumentados (Figura 2G,H).
Figura 1: Fluxograma do método secundário de extração celular aderente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: (A-B) Após três gerações de cultura estável de células aderentes secundárias, as células positivas cd11b/c foram detectadas por citometria de fluxo. (C-D) A morfologia das células aderentes secundárias após três gerações é mostrada (C para luz branca, D para coloração wright-giemsa). (E-F) A coloração TRAP foi utilizada para detectar o efeito de RANKL e M-CSF na formação osteoclasta (E para controle; F para RANKL e M-CSF). (G-H) As células foram tratadas com RANKL e M-CSF por 7 dias e os níveis de expressão de TRAP e cathepsin K foram determinados pela análise de manchas ocidentais. Os dados são expressos como a média ± SD de três experimentos independentes. P < 0,001 contra o grupo de controle. TRAP, fosfatase ácida resistente ao tartarato; RANKL, ativador receptor de ligante fator nuclear-κB; M-CSF, fator estimulante da colônia de macrófagos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Método para extrair macrófagos Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Os osteoclatos são um dos tipos celulares mais significativos envolvidos na ocorrência e desenvolvimento de doenças ósseas, bem como um dos principais objetos da pesquisa dedoenças ósseas 20. Monócitos/macrófagos podem se diferenciar em osteoclatos. Como os macrófagos mononucleares (células RAW264.7) são muito caros para comprar e são facilmente ativados durante a cultura, é difícil realizar experimentos de diferenciação in vitro usando esta linha celular. Embora vários métodos tenham sido desenvolvidos para extrair monócitos/macrófagos da medula óssea, incluindo centrifugação de gradiente de densidade, digestão de colagenase, enriquecimento de microesferas e citometria de fluxo (Tabela 1), esses métodos são demorados, enquanto requerem altos volumes de amostra e equipamentos caros. Portanto, o presente estudo teve como objetivo propor um método simples e rápido para extrair monocitáceis/macrófagos de amostras de medula óssea.
Existem muitas populações de células na medula óssea, incluindo BMSCs, células endoteliais e células imunes, além de MMC. Como todos sabemos que os BMSCs podem se diferenciar em osteoblastos, e esse processo afetará a diferenciação dos BMMs em osteoclastos21. BMMs uniformes e estáveis são fatores significativos para induzir a diferenciação de osteoclato in vitro, por isso é particularmente importante considerar esses fatores limitantes ao isolar e extrair BMMs. Ao mesmo tempo, a capacidade dos BMMs de se diferenciar em osteoclastos também enfraquecerá durante a passagem contínua. Portanto, é desafiador isolar os BMMs da medula óssea e induzi-los com sucesso em osteoclastos.
Descobrimos que há diferenças no tempo de adesão das células aderentes na medula óssea. Mais especificamente, os BMSCs basicamente aderiram à parede de pratos de cultura durante 0-24 h de cultura, enquanto os BMMs começam a aderir à parede de pratos de cultura depois de 24 horas. Com base no achado acima, o método de adesão secundária foi selecionado para isolar os BMMs. Os ratos SD sugadores (idade, 1-10 dias de idade) foram selecionados para extrair BMMs, uma vez que os BMMs de ratos jovens apresentam uma capacidade de diferenciação mais forte. As células de medula óssea dos ratos SD foram coletadas, e após o cultivo por 24h, a suspensão da célula foi transferida e cultivada por mais 24h. As células aderentes secundárias coletadas continham um grande número de BMMs. Após a cultura, as células secundárias aderentes foram gradualmente purificadas e tornaram-se estáveis e uniformes. Os resultados da citometria de fluxo demonstraram que o percentual de células positivas de CD11b/c atingiu aproximadamente 37,94%. Além disso, a coloração do TRAP e a análise da mancha ocidental mostraram que os BMMs extraídos poderiam se diferenciar em osteoclastos. Este achado foi consistente com um estudo anterior também sugerindo que os BMMs extraídos pelo método secundário de adesão poderiam ser diferenciados com sucesso em osteoclastos22.
O método secundário de adesão pode ser usado para extrair simplesmente e rapidamente macrófagos mononucleares da medula óssea, sem exigir equipamentos de laboratório de alta tecnologia. Ao mesmo tempo, este método é adequado para isolar células de uma pequena amostra de medula óssea, superando assim as dificuldades complicadas e demoradas observadas nos métodos anteriores comumente utilizados para extrair macrófagos mononucleares. No geral, os BMMs extraídos pelo método secundário de adesão poderiam ser diferenciados com sucesso em osteoclastas in vitro, fornecendo assim um modelo celular estável para o estudo in vitro de osteoclartos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural da Província de Zhejiang (não conceder. LY19H060001) e o Projeto de Plano de Ciência e Tecnologia da Medicina Tradicional Chinesa de Zhejiang (nº 2022ZB093).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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