Summary
El presente protocolo describe una inyección de dos puntos de lisofosfatidilcolina a través de un marco estereotáxico para generar un modelo de desmielinización estable y reproducible en ratones.
Abstract
La señalización de lisofosfolípidos mediada por receptores contribuye a la fisiopatología de diversas enfermedades neurológicas, especialmente la esclerosis múltiple (EM). La lisofosfatidilcolina (LPC) es un lisofosfolípido endógeno asociado con la inflamación, y podría inducir un daño rápido con toxicidad a los lípidos de mielina, lo que lleva a la desmielinización focal. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la inyección estereotáctica de LPC de dos puntos que podría causar directamente una desmielinización severa y replicar la lesión experimental de desmielinización de forma rápida y estable en ratones mediante procedimiento quirúrgico. Por lo tanto, este modelo es altamente relevante para las enfermedades de desmielinización, especialmente la EM, y puede contribuir al avance relacionado de la investigación clínicamente relevante. Además, se utilizaron métodos de inmunofluorescencia y tinción azul rápida Luxol para representar el curso temporal de la desmielinización en el cuerpo calloso de ratones inyectados con LPC. Además, se utilizó el método conductual para evaluar la función cognitiva de los ratones después del modelado. En general, la inyección de dos puntos de lisofosfatidilcolina a través de un marco estereotáxico es un método estable y reproducible para generar un modelo de desmielinización en ratones para su posterior estudio.
Introduction
La señalización de lisofosfolípidos mediada por receptores implica diversos procesos fisiológicos de casi todos los sistemas de órganos1. En el sistema nervioso central (SNC), esta señalización juega un papel crítico en las patogenicidades de enfermedades neurológicas autoinmunes como la esclerosis múltiple (EM). La esclerosis múltiple es un trastorno crónico inmunomediado caracterizado por desmielinización patológica y respuesta inflamatoria, causando disfunción neurológica y deterioro cognitivo 2,3. Después de continuas recaídas y remisiones durante la enfermedad temprana, la mayoría de los pacientes eventualmente progresan a la etapa secundaria-progresiva, lo que podría causar daños irreversibles en el cerebro y la discapacidad resultante4. Se cree que el sello patológico del curso secundario-progresivo son las placas desmielinizantes causadas por lesiones inflamatorias5. Los tratamientos existentes para la EM pueden reducir significativamente el riesgo de recaída. Sin embargo, todavía no existe una terapia efectiva para el daño desmielinizante a largo plazo causado por la EMprogresiva 6. Por lo tanto, se requiere un modelo estable y fácilmente reproducible para estudiar terapias preclínicas que se centren en la degeneración de la materia blanca.
La desmielinización y la remielinización son dos procesos patológicos principales en el desarrollo de la esclerosis múltiple. La desmielinización es la pérdida de vaina de mielina alrededor de los axones inducida por la microglía con fenotipos proinflamatorios7, y conduce a una conducción lenta de los impulsos nerviosos y resulta en la pérdida de neuronas y trastornos neurológicos. La remielinización es una respuesta de reparación endógena mediada por oligodendrocitos, donde los trastornos podrían conducir a la neurodegeneración y al deterioro cognitivo8. La respuesta inflamatoria es crucial para todo el proceso, afectando tanto el grado de daño como la reparación de la mielina.
Por lo tanto, un modelo animal estable de desmielinización inflamatoria persistente es significativo para una mayor exploración de estrategias terapéuticas para la EM. Debido a la complejidad de la EM, se han establecido varios tipos de modelos animales para imitar lesiones desmielinizantes in vivo, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), modelos tóxico-desmielinizantes, cuprizona (CPZ) y lisofosfatidilcolina (LPC)9 . LPC es un lisofosfolípido endógeno asociado con la inflamación, y podría inducir un daño rápido con toxicidad a los lípidos de mielina, lo que lleva a la desmielinización focal. Sobre la base de informes previos einvestigaciones 10,11, se proporciona un protocolo detallado de inyección de dos puntos con algunas modificaciones. Generalmente, el modelo clásico de inyección de LPC de un punto solo produce desmielinización local en el sitio de inyección y a menudo se acompaña de remielinización espontánea12,13. Sin embargo, el modelo LPC de inyección de dos puntos puede demostrar que el LPC puede inducir directamente la desmielinización en el cuerpo calloso del ratón y causar una desmielinización más duradera con poca regeneración de mielina.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité del Instituto de Cuidado Animal del Colegio Médico Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, China. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos y hembras adultos C57BL/6 (tipo salvaje, WT; 20-25 g; 8-10 semanas de edad). Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales). Los ratones fueron alojados en una instalación animal específica libre de patógenos (SPF) con agua y alimentos suministrados ad libitum. Se mantuvieron en un período alterno de 12 h de ciclo de luz y oscuridad en las condiciones estándar de temperatura de 22 ° C y humedad relativa de 55% -60%.
1. Preparación de la solución de LPC
- Disolver 25 mg de polvo de LPC (ver Tabla de Materiales) con 250 μL de cloroformo y solución mixta de metanol (1:1) para hacer una solución de LPC al 10% y transferirla a un tubo de centrífuga de 500 μL.
NOTA: Si el LPC no está completamente disuelto, coloque el tubo de la centrífuga en un limpiador ultrasónico y ultrasonice a 40 kHz durante ~ 1 h para obtener una solución uniforme. - Divida la solución en 3 μL/tubo y guárdela a -80 °C.
NOTA: La solución se puede almacenar durante ~ 2 años. - Antes de la cirugía, diluya la solución (paso 1.2.) con 27 μL de solución de NaCl al 0,9% y mantenga la solución en un baño de agua a temperatura constante a 37 °C.
NOTA: Prepare la solución justo antes de comenzar la inyección.
2. Preparación quirúrgica
- Use una aguja de 32 G, 2 pulgadas para conectarla a una jeringa de 5 μL (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que la jeringa de microlitro no esté obstruida. Retire 5 μL de solución de LPC para la preparación de la inyección.
- Anestesiar al ratón en una cámara de inducción conectada a un vaporizador de isoflurano con 3% de isoflurano mezclado con 100% de oxígeno a una velocidad de aproximadamente 0,3 L/min.
- Confirme la profundidad de la anestesia por la falta de reflejo de pellizco en el dedo del pie mientras la respiración es suave.
- Afeitar la cabeza del ratón entre las orejas con una afeitadora eléctrica. Aplique gotas lubricantes para los ojos para prevenir la sequedad corneal durante el procedimiento.
- Luego, coloque el mouse en un marco estereotáxico (consulte la Tabla de materiales) con el lado dorsal hacia arriba y asegure la cabeza con un cono nasal y una pinza dental. Mantenga la anestesia con 1.2% -1.6% de isoflurano a través de su nariz.
NOTA: La concentración de isoflurano se puede ajustar de acuerdo con el estado respiratorio de los ratones.
3. Procedimiento quirúrgico
NOTA: Los animales se colocan en una almohadilla térmica durante todos los procedimientos.
- Fije el ratón al aparato estereotáxico con barras auriculares bilaterales. Asegúrese de que las barras para los oídos estén niveladas y que la cabeza esté horizontal y estable.
- Desinfecte la piel de la cabeza limpiándola varias veces con yodóforo seguido de alcohol en movimiento circular. Luego use un bisturí para cortar una pequeña incisión de aproximadamente 1,5 cm a lo largo de la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo.
- Limpie el cráneo con un hisopo de algodón sumergido en peróxido de hidrógeno al 1% hasta que la bregma, la lambda y la fontanela posterior queden expuestas. Coloque la jeringa en el aparato estereotáxico.
NOTA: Use peróxido de hidrógeno con cuidado y evite tocar los tejidos circundantes. - Asegurar el posicionamiento horizontal de la cabeza del animal (tanto delantera como trasera e izquierda y derecha).
- Ajuste la perilla del eje Z del marco estereotáxico para que la punta de la aguja y el cráneo se toquen sin doblarse, luego mida la coordenada del eje Z. Compruebe las coordenadas Z de bregma y fontanela posterior.
- Ajuste la barra de la oreja para que la diferencia entre las coordenadas Z de bregma y fontanela posterior no sea más de 0,02 mm. Luego, siga el mismo método para medir las coordenadas Z de las posiciones correspondientes en los lados izquierdo y derecho de la línea media. Ajuste la barra del oído para asegurarse de que la izquierda y la derecha estén al mismo nivel.
- Localice el cuerpo calloso. Establezca el origen XYZ en bregma.
NOTA: El primer sitio de inyección es de 1,0 mm lateral al bregma, 2,4 mm de profundidad y 1,1 mm anterior. El segundo sitio de inyección es de 1,0 mm lateral al bregma, 2,1 mm de profundidad y 0,6 mm anterior. Por ejemplo, la coordenada del bregma es (0,0,0). Mida la coordenada Z de la ubicación correspondiente marcada como (-1, 1.1, X) y (-1, 0.6, Y). Se puede determinar que la coordenada del primer sitio de inyección del cuerpo calloso es (-1, 1.1, −[X + 2.4]), y el segundo sitio de inyección es (-1, 0.6, −[Y + 2.1]). - Una vez que se determine el sitio de inyección, haga una marca con un marcador estéril en el cráneo y registre las coordenadas.
- Perfore suavemente el sitio marcado con un taladro de cráneo (consulte la Tabla de materiales). Tenga cuidado de evitar cualquier sangrado.
- Mueva lentamente la aguja a las coordenadas dadas y comience la inyección. Para inducir la desmielinización del cuerpo calloso, inyecte 2 μL de solución de LPC (paso 1.) en cada sitio de inyección (paso 3.5.) a una velocidad de 0.4 μL/min.
- Después de la inyección, mantenga la aguja en cada sitio durante 10 minutos adicionales.
NOTA: Asegúrese de que el intervalo de dos inyecciones no sea superior a 20 min. - Sutura la piel con una sutura 4-0 y espere a que el animal se despierte dentro de los 10 minutos. Administrar analgésicos postoperatorios de acuerdo con las regulaciones institucionales de cuidado de animales.
NOTA: El tiempo recomendado para la eutanasia se puede determinar de acuerdo con el propósito del experimento.
4. Extracción de muestras para la desmielinización focal
NOTA: Para obtener detalles sobre este paso, consulte el informe publicado anteriormente14.
- Disolver el colorante rojo neutro (ver Tabla de Materiales) en una solución al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- horas antes de sacrificar a los ratones (para más detalles, ver referencia previa10), inyectar 500 μL de colorante rojo neutro al 1% en PBS mediante inyección intraperitoneal para cada ratón.
- Realizar perfusión cardíaca12 con 30 mL de PBS al 0,1% preenfriado a 4 °C.
- Cortar el cerebro en 1 mm con un molde cerebral (ver Tabla de Materiales).
- Visualice la lesión teñida de rojo neutro bajo el microscopio y disocie la lesión.
NOTA: Retire la mayor cantidad posible de tejido normal circundante para mejorar la precisión del análisis posterior. El tejido de la lesión se puede examinar con RT-PCR, microscopía electrónica y análisis de western blot.
5. Tinción histológica e inmunofluorescencia
- Para la tinción histológica y la inmunofluorescencia12, después de la perfusión cardíaca (paso 4.3.), retire el cerebro10, fije en PFA al 4% durante la noche (a 4 ° C) y deshidrate completamente en sacarosa al 30%.
- Cortar en secciones cerebrales coronales de 20 mm con una cortadora congelada10 a temperatura constante (-20 °C).
- Use las rodajas para la tinción Luxol fast blue (LFB), la inmunofluorescencia y la mancha occidental10.
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Representative Results
La inyección de dos puntos del LPC resultó en una desmielinización más duradera
LpC conduce principalmente a un daño rápido con toxicidad a la mielina y escisión de la integridad del axón15. El día de la inyección se consideró como el día 0. Los ratones se mantuvieron durante un período de 10-28 días (10 dpi y 28 dpi). La tinción Luxol fast blue (LFB)10 se utilizó para evaluar el área de desmielinización en ratones en estos puntos temporales. En el modelo de inyección de dos puntos, hubo una desmielinización significativa en los 10 dpi en comparación con el grupo simulado, lo que demuestra que la inyección localizada de LPC puede desmielinizar con éxito el cuerpo calloso. Todavía existe un grado relativamente alto de desmielinización a 28 dpi, lo que indica una desmielinización persistente y estable debido a la inyección de LPC de dos puntos (Figura 1D-E).
Para evaluar más a fondo la pérdida de la vaina de mielina, se seleccionó 10 días como un punto de tiempo clave cuando la desmielinización es relativamente evidente. A través de la tinción por inmunofluorescencia de la proteína básica de mielina degradada (dMBP), se observó un aumento notable de dMBP en el grupo inyectado con LPC a 10 dpi (Figura 1F), lo que representa la pérdida de mielina en el cuerpo calloso. Asimismo, se utilizó la proteína del tejido de la lesión obtenida (paso 4.) para analizar la expresión de MBP por western blot. Después del modelado de acuerdo con el protocolo, MBP mostró una pérdida significativa (Figura 1G). Estos resultados fueron consistentes con el LFB y la tinción de inmunofluorescencia.
La morfología de la mielina en el cuerpo calloso 10 días después de la inyección de LPC se observó con el microscopio electrónico (el tejido de la lesión se extrajo de acuerdo con el paso 4. La desmielinización obvia verifica el éxito del modelado (Figura 2).
La inyección de LPC de dos puntos influyó en la regeneración de mielina
La diferenciación y maduración de los oligodendrocitos (OMG) desempeñan un papel crucial en la reparación de la vaina de mielina en la EM. La regeneración de la mielina se produce principalmente al diferenciar las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) en oligodendrocitos mielinizantes. Por lo tanto, el proceso de reparación de mielina se verá influenciado una vez que se bloquee la diferenciación de los OPC en OMG. Gst-π es el marcador de maduración de la diferenciación OPC16. Después de 10 días de inyección de LPC, se puede ver por inmunofluorescencia que el Gst-π disminuido en comparación con el grupo simulado (Figura 3A). Al mismo tiempo, la capacidad de proliferación de los oligodendrocitos puede reflejarse en la proporción de Ki67 (proliferan los oligodendrocitos) y Olig2 (células totales del linaje de oligodendrocitos)17,18. La mayor relación de colocalización Ki67/Olig2+ representa una mayor proliferación de oligodendrocitos después de 10 ppp (Figura 3B). Estas imágenes sugieren que el área de la lesión intenta repararse a través de la maduración y proliferación de OPC después de la inyección de LPC.
La inyección de LPC de dos puntos perjudicó la memoria espacial de los ratones
Para analizar la capacidad de memoria espacial de la inyección de LPC en ratones, se utilizó el laberinto de agua de Morris (WMM)19 y no mostró diferencias en la velocidad de natación entre los ratones simulados y los inyectados con LPC. Sin embargo, cuando la plataforma se eliminó en el laberinto de agua de Morris, la latencia para encontrar la plataforma oculta se redujo (deterioro del aprendizaje espacial) y el tiempo pasado en el cuadrante objetivo aumentó (retención de memoria deteriorada) (Figura 4). Los resultados sugieren que la memoria espacial de ratones desmielinizados se ve significativamente afectada en el modelo de inyección de LPC de dos puntos. El número de animales utilizados en diferentes experimentos se enumera en la Tabla 1. Cada ratón recibió entrenamiento a partir del día 2 o el día 20.
Figura 1: Inyección de dos puntos de la desmielinización inducida por LPC. (A) Representación de los sitios de inyección (1,0 mm lateral, 2,4 mm de profundidad y 1,1 mm anterior). (B) Representación de los sitios de inyección (1,0 mm lateral, 2,1 mm de profundidad y 0,6 mm anterior). C) Ilustración de los puntos temporales de detección. (D) Detección de las lesiones de la sustancia blanca mediante tinción LFB. Tinción de LFB a los 10 días después de la inyección (dpi) y 28 dpi, mostrando desmielinización persistente del cuerpo calloso (barra de escala = 200 μm). (E) Cuantificación del área de desmielinización en diferentes puntos temporales. Los datos se representan como media ± SD, ANOVA unidireccional seguido de las pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. ****p < 0,0001, n = 6 por grupo. (F) Imágenes representativas de inmunotinción dMBP en el cuerpo calloso (barra de escala = 100 μm). En comparación con la farsa, que casi no tenía dMBP, se podía ver dMBP obvio después de la inyección de LPC. (G) Análisis de Western blot de la expresión MBP. MBP mostró una pérdida significativa después de la inyección de LPC. β-actina se utilizó como control de carga para medir la expresión basal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Las imágenes de microscopía electrónica confirman la ultraestructura mielinizada en el cuerpo calloso de la farsa en comparación con la desmielinizada en los ratones inyectados con LPC (barra de escala = 1 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La inyección de dos puntos influyó en la maduración y proliferación de los OPC. (A) Imágenes representativas de GST-π en el cuerpo calloso de ratones simulados e inyectados con LPC (barra de escala = 20 μm). El rojo significa GST-π. (B) Imágenes representativas de la colocalización de Olig2 y Ki67 (barra de escala = 20 μm). El rojo significa Ki67, y el verde significa Olig2. Las imágenes fueron capturadas utilizando un sistema de microscopía confocal con líneas láser de 488 nm y 594 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Deterioro de la memoria espacial inducido por la inyección de LPC. (A) Imágenes representativas de la trayectoria de natación de los ratones en cada grupo en presencia de la plataforma (fase de aprendizaje). (B) Imágenes representativas de las trayectorias de natación de los ratones en cada grupo después de retirar la plataforma (fase de memoria). El número de animales utilizados se enumera en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Grupo | Fingir | Grupo LPC |
| Tinción LFB | 6 | 12 (10 ppp, 6; 28 ppp, 6) |
| Microscopía electrónica | 4 | 4 |
| Si | 6 | 6 |
| Western Blot | 4 | 4 |
| Laberinto de agua de Morrris | 12 | 12 |
Tabla 1: El número de animales utilizados para las diferentes pruebas.
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Discussion
La EM, una enfermedad desmielinizante crónica del SNC, es una de las causas más comunes de disfunción neurológica en adultos jóvenes20. Clínicamente, aproximadamente el 60%-80% de los pacientes con EM experimentan el ciclo de recaídas y remisiones antes de desarrollar una EM secundaria-progresiva21,22, y eventualmente conduce a deficiencias acumulativas del movimiento y déficits cognitivos a lo largo del tiempo23. Actualmente, ningún modelo experimental único cubre toda la variedad de características clínicas, patológicas o inmunológicas de la enfermedad24. Para simular el proceso patológico y la patogénesis de la EM en diferentes etapas, existen tres modelos animales desmielinizantes comunes con sus ventajas y limitaciones, incluido el modelo EAE, la CPZ de animales de alimentación y los modelos de desmielinización inducida por LPC.
En ratones, la EAE es inducida por una respuesta inmune después de la inyección de antígenos de mielina, lo que resulta en la activación microglial y la infiltración de linfocitos T y B perivasculares, y el daño de mielina que lo acompaña a menudo se asocia con la recurrencia de la enfermedad20,25. Simula mejor las características del período de recaída-remisión de la EM. Sin embargo, también tiene varias limitaciones. Por ejemplo, eaE es principalmente una enfermedad que afecta a la sustancia blanca de la médula espinal, mientras que la EM causa principalmente desmielinización de la corteza cerebral, y la ubicación y el momento de las lesiones son aleatorios, lo que dificulta la obtención de lesiones con precisión19.
CPZ y LPC son las sustancias más utilizadas para inducir modelos tóxico-desmielinizantes. Todos ellos son capaces de causar desmielinización del SNC después de la administración. En el modelo CPZ, alimentar a ratones jóvenes con cuprizona quelante de cobre resultó en la muerte de oligodendrocitos y la posterior desmielinización reversible. Después de la retirada de la cuprizona, se desencadenó un proceso espontáneo de remielinización en 4 días26,27. CpZ resulta principalmente en una desmielinización extensa, mientras que la inyección de LPC se inclina hacia la desmielinización focal. Debido a la toxina y la respuesta inflamatoria, la clásica inyección de un punto de LPC desencadena una forma rápida y altamente reproducible de desmielinización28.
Sin embargo, ninguno de los modelos anteriores puede imitar adecuadamente el proceso patológico de la EM progresiva caracterizada por una desmielinización persistente. Por lo tanto, el presente protocolo propone un modelo para una inyección de dos puntos de LPC directamente en el cuerpo calloso para inducir la desmielinización a largo plazo. Los pasos críticos en el protocolo incluyen el ajuste horizontal de la cabeza del animal y la localización de las coordenadas de inyección. En el paso 3.5., uno debe asegurarse de ajustar primero el nivel de bregma y fontanela posterior y luego ajustar los niveles izquierdo y derecho. Al mismo tiempo, debe tenerse en cuenta que, después de ajustar los niveles izquierdo y derecho, el punto cero debe reposicionarse antes de las operaciones posteriores. Este paso es crucial porque está directamente relacionado con la precisión del posicionamiento. En el paso 3.6., al determinar las coordenadas del eje Z, se debe asegurarse de que el extremo de la aguja y el cráneo permanezcan en contacto exacto, y el investigador pueda observar si la aguja está doblada. En el paso 3.10., la aguja permanece en su lugar durante 10 minutos para evitar que el medicamento salga del pasaje de la aguja.
El presente protocolo tiene algunas limitaciones. Al igual que otros modelos desmielinizantes inducidos por toxicidad, carece del modelado de procesos inmunológicos. En segundo lugar, aunque el modelo de inyección de dos puntos puede mantener la desmielinización durante un tiempo relativamente largo, todavía se acompaña inevitablemente de un ligero grado de regeneración de mielina a medida que la enfermedad progresa a una etapa posterior. Puede que no sea un modelo más adecuado para simular la esclerosis múltiple progresiva secundaria que la encefalomielitis autoinmune experimental inducida por glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG)29,30. El modelo clásico de inyección de LPC de un punto produce solo desmielinización inflamatoria localizada acompañada de remielinización espontánea. Investigaciones anteriores han demostrado que la infiltración de células T, células B y macrófagos después de la inyección de LPC es un factor clave en la reparación de la mielina15. Sin embargo, en comparación con el modelo de inyección clásico, el modelo LPC de inyección de dos puntos induce una rápida desmielinización focal del cuerpo calloso y mantiene el grado de desmielinización durante un período más largo con poca remielinización.
Debido a la complejidad de la EM, las diferentes etapas de la enfermedad requieren diferentes modelos para ser mejor descritos. La inyección de dos puntos de LPC a través de un marco estereotáxico es un modelo de ratón experimental estable, eficiente y reproducible. Este modelo puede conducir a la desmielinización a largo plazo, acompañada de una menor reparación de la mielina con el tiempo. Eso significa que el modelo de inyección de dos puntos se puede utilizar no solo para estudiar enfermedades de desmielinización, sino también para estudiar intervenciones de reparación de mielina. Además, este modelo puede evaluar fácil y rápidamente la desmielinización después de la intervención a través de métodos de inmunofluorescencia e histológicos, y la disfunción cognitiva de la EM puede reflejarse en la memoria espacial deteriorada de ratones desmielinizados en la prueba de comportamiento. En conclusión, este modelo de desmielinización estable podría facilitar estudios patológicos y preclínicos tanto sobre la progresión secundaria de la EM como sobre la EM remitente-recurrente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones: 82071380, 81873743).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
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