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Tomografia por Emissão de Pósitrons Cardíacos de Alta Resolução/Tomografia Computadorizada para Animais de Pequeno Porte

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64066
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 3, 1, 1
1CNR Institute of Clinical Physiology, 2Sant’Anna School of Advanced Studies, 3Fondazione Regione Toscana/CNR “G. Monasterio”

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo de imagem experimental para a quantificação da função cardíaca e morfologia utilizando tomografia por emissão de pósitrons de alta resolução/tomografia computadorizada para animais de pequeno porte. Tanto camundongos quanto ratos são considerados, discutindo os diferentes requisitos de agentes de contraste da tomografia computadorizada para as duas espécies.

Abstract

A tomografia por emissão de pósitrons (PET) e a tomografia computadorizada (TC) estão entre as técnicas de diagnóstico por imagem mais empregadas, e ambas servem na compreensão da função cardíaca e do metabolismo. Na pesquisa pré-clínica, são empregados scanners dedicados com alta sensibilidade e alta resolução espaço-temporal, projetados para lidar com os exigentes requisitos tecnológicos impostos pelo pequeno tamanho do coração e taxas cardíacas muito altas de camundongos e ratos. Neste trabalho, um protocolo bimodal de imagem PET/CT cardíaca para modelos experimentais de doenças cardíacas em camundongos e/ou ratos é descrito, desde o preparo animal e aquisição e reconstrução de imagens até o processamento e visualização de imagens.

Em particular, o examede 18 fluordesoxiglicose marcada com F ([18F]FDG)-PET permite a medição e visualização do metabolismo da glicose nos diferentes segmentos do ventrículo esquerdo (VE). Os mapas polares são ferramentas convenientes para exibir essas informações. A parte de TC consiste em uma reconstrução 3D com resolução temporal de todo o coração (TC-4D) por meio de gating retrospectivo sem eletrocardiografia (ECG), permitindo a avaliação morfofuncional do VE e a posterior quantificação dos parâmetros mais importantes da função cardíaca, como fração de ejeção (FE) e volume sistólico (SV). Usando um scanner PET/CT integrado, este protocolo pode ser executado dentro da mesma indução anestésica sem a necessidade de reposicionar o animal entre diferentes scanners. Assim, a PET/CT pode ser vista como uma ferramenta abrangente para a avaliação morfofuncional e metabólica do coração em vários modelos animais de pequeno porte de doenças cardíacas.

Introduction

Modelos de pequenos animais são de extrema importância para o avanço da compreensão das doenças cardiovasculares 1,2. As ferramentas de diagnóstico por imagem não invasivas revolucionaram a maneira como olhamos para a função cardíaca nas últimas décadas, tanto em ambientes clínicos quanto pré-clínicos. No que diz respeito a pequenos modelos animais de doenças cardíacas, ferramentas de imagem específicas foram desenvolvidas com resolução espaço-temporal muito alta. Assim, tais instrumentos podem corresponder à necessidade de quantificação precisa dos parâmetros metabólicos e cinéticos miocárdicos relevantes nos corações muito pequenos e muito rápidos de camundongos e ratos em modelos específicos de doenças, como insuficiência cardíaca (IC)3 ou infarto do miocárdio (IM)4. Várias modalidades estão disponíveis para este fim, cada uma com seus próprios pontos fortes e fracos. A ultrassonografia (US) é a modalidade mais utilizada devido à sua grande flexibilidade, resolução temporal muito alta e custo relativamente baixo. A adoção da US de imagem cardíaca em animais de pequeno porte aumentou consideravelmente desde o advento de sistemas que utilizam sondas com frequência ultra-alta5,6, com resoluções espaciais abaixo de 50 μm.

Entre as principais desvantagens da US para imagens cardíacas totalmente 3D está a necessidade de varreduras lineares ao longo do eixo cardíaco, montando a sonda em um estágio de tradução motorizada para criar uma pilha completa de imagens dinâmicas de modo B de todo o coração7. Eventualmente, este procedimento dá origem (após um registro espacial e temporal preciso das imagens adquiridas em cada posição de sonda) a uma imagem 4D com diferentes resoluções espaciais entre as direções no plano e fora do plano. O mesmo problema de resolução espacial não uniforme ocorre na RM cardíaca (RMC),8 que ainda representa o padrão-ouro na imagem funcional do coração. A imagem 3D isotrópica real pode ser obtida por meio da tomografia computadorizada (TC) e da tomografia por emissão de pósitrons (PET)9. O PET fornece uma ferramenta muito sensível em termos de sinal de imagem por quantidade de sonda injetada (na faixa nanomolar), embora sofra de uma resolução espacial reduzida em comparação com a TC, RM ou US. A principal vantagem da PET é a sua capacidade de exibir os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à fisiopatologia do órgão. Por exemplo, uma tomografia por emissão de pósitrons (PET) após a injeção de [18F]FDG permite a reconstrução de um mapa 3D do metabolismo da glicose no corpo. Ao combinar isso com a aquisição de dados dinâmicos (ou seja, resolvidos no tempo), a modelagem cinética traçadora pode ser utilizada para calcular mapas paramétricos das taxas metabólicas de captação de glicose (MRGlu), o que fornecerá informações importantes sobre a viabilidade miocárdica10.

A TC requer volumes significativos de agentes de contraste externos (AC) em altas concentrações (até 400 mg de iodo por mL) para fornecer um aprimoramento mensurável dos componentes teciduais relevantes (por exemplo, sangue versus músculo), mas se destaca na resolução espacial e temporal, especialmente ao usar scanners de micro-TC de última geração projetados para imagens de pequenos animais. 11 Um modelo típico de doença no qual a PET/TC cardíaca pode ser aplicada é a avaliação experimental do infarto do miocárdio e da insuficiência cardíaca e a resposta relacionada à terapia. Uma forma comum de induzir o IAM em animais de pequeno porte é por ligadura cirúrgica da artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE)12,13 e, em seguida, avaliando-se longitudinalmente a progressão da doença e o remodelamento cardíaco nos dias subsequentes4. No entanto, a avaliação morfofuncional quantitativa do coração em pequenos animais é amplamente aplicável também para outros modelos de doenças, como a avaliação do efeito do envelhecimento sobre a função cardíaca14 ou a expressão alterada do receptor em modelos de obesidade15. O protocolo de imagem apresentado não se restringe a nenhum modelo de doença e, portanto, pode ser de maior interesse em diversos contextos de pesquisa pré-clínica com pequenos roedores.

Neste trabalho, apresentamos um protocolo experimental de início a fim para imagens cardíacas utilizando PET/CT integrado a pequenos animais. Embora o protocolo apresentado seja projetado para um scanner integrado bimodal específico, as partes PET e CT do procedimento descrito podem ser realizadas de forma independente em scanners separados de diferentes fabricantes. No scanner PET/CT em uso, a sequência de operações é organizada em um fluxo de trabalho pré-programado. As principais ramificações de cada fluxo de trabalho são um ou mais protocolos de aquisição; cada protocolo de aquisição pode ter uma ou mais ramificações para protocolos de pré-processamento específicos e, por sua vez, cada protocolo de pré-processamento pode ter uma ou mais ramificações para protocolos de reconstrução específicos. Tanto a preparação do animal no leito de imagem quanto a preparação dos agentes externos a serem injetados durante os procedimentos de imagem são descritas. Após a conclusão do procedimento de aquisição de imagens, são fornecidos procedimentos de exemplo para análise quantitativa de imagens com base em ferramentas de software comumente disponíveis. O protocolo principal é projetado especificamente para modelos de mouse; embora o camundongo continue sendo a espécie mais utilizada neste campo, também mostramos uma adaptação do protocolo para imagens de ratos ao final do protocolo principal. Resultados representativos são mostrados para camundongos e ratos, demonstrando o tipo de saída que pode ser esperada com os procedimentos descritos. Uma discussão aprofundada é feita no final deste artigo para enfatizar os prós e contras da técnica, pontos críticos, bem como como diferentes radiotraçadores PET poderiam ser usados com quase nenhuma modificação nas etapas preparatórias e de aquisição/reconstrução.

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Protocol

As experiências com animais foram realizadas de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório das Diretrizes Internacionais sobre Manuseio de Animais de Laboratório, exigidas pela Diretiva Europeia (Diretiva 86/609/CEE de 1986 e Diretiva 2010/63/UE) e leis italianas (D.Lgs. 26/2014).

1. Configuração dos protocolos de imagem PET/CT e fluxo de trabalho

NOTA: O protocolo aqui apresentado destina-se especificamente a imagens cardíacas de modelos de ratinhos. Trabalhar com ratos pode implicar algumas modificações no protocolo real, principalmente por causa do tamanho maior do animal (cerca de 10x mais pesado). As modificações para a imagem de ratos são especificamente mencionadas nas etapas; se nenhuma modificação for mencionada, as mesmas etapas para imagens de camundongos podem ser usadas para ratos.

  1. Abra a interface gráfica do usuário (GUI) do scanner PET/CT (consulte Tabela de Materiais) e criar um conjunto de novos protocolos (incluindo parâmetros para aquisição de dados, pré-processamento e reconstrução de imagens): (i) a PET scan dinâmico, ii) a tomografia computadorizada (TC) de baixa dose para correção de atenuação (O CTAC) sem contraste e (iii) a cinco-tomografia computadorizada com contraste.
    NOTA: A criação de novos protocolos (ou seja, instruções de software específicas para o tomógrafo) para as fases de aquisição, pré-processamento e reconstrução é um processo simples; em caso de problema, o usuário pode encontrar informações mais detalhadas no manual do usuário da GUI.
    1. Para a PET scan, abra a guia Protocolo do scanner (GUI) e crie três novos protocolos (para aquisição, pré-processamento e reconstrução) com os seguintes parâmetros:
      1. Para o protocolo de aquisição : definir 3.600 s de tempo total de varredura e posição da cama de solteiro. Salve esse protocolo com um nome apropriado para importação subsequente no fluxo de trabalho. Faça o mesmo também para todos os próximos protocolos nos pontos a seguir.
      2. Para o protocolo de pré-processamento para mouse: selecione uma janela de energia (EW) de 250-750 keV e habilite as seguintes correções: decaimento radioativo, coincidências aleatórias e tempo morto. Defina o protocolo de enquadramento (ou seja, divisão dinâmica dos dados brutos) da seguinte forma: 8 x 5 s, 8 x 10 s, 3 x 40 s, 2 x 60 s, 2 x 120 s, 10 x 300 s (= 3.600 s). Para ratos, selecione uma janela de energia (EW) de 350-750 keV, usando o mesmo enquadramento que para o protocolo de rato.
      3. Para o protocolo de reconstrução: selecione o algoritmo de Maximização de Expectativa de Subconjunto Ordenado 3D (3D-OSEM-MC) de alta qualidade, baseado em Monte Carlo, com 8 subconjuntos e 8 iterações, com normalização, correção quantitativa e correção de atenuação de TC habilitada.
    2. Para a tomografia computadorizada de baixa dose para correção de atenuação (CTAC), use os seguintes parâmetros:
      1. Para o protocolo de aquisição : quadro único, posição do leito individual, varredura completa; configurações do tubo: 80 kV, baixa corrente (baixa dose); 576 visualizações em 360°, com 34 ms de tempo de exposição por visão (tempo de varredura de 20 s); tipo de rotação: contínuo, modo de sensibilidade: alta sensibilidade.
      2. Para o protocolo de pré-processamento: tamanho de voxel de 240 μm, FOV transversal: Rato, FOV axial: 100%.
      3. Para o protocolo de reconstrução : janela de filtro: liso, tamanho do voxel: padrão , ativar o endurecimento do feixe e a pré-correção do anel, desativar a correção do pós-correção do artefato do anel.
    3. Para a tomografia computadorizada controlada com contraste, crie três novos protocolos (para aquisição, pré-processamento e reconstrução) com as seguintes configurações:
      1. Para o protocolo de aquisição para mouse: definir quadro único, posição da cama de solteiro, varredura completa; configurações do tubo: 65 kV, corrente total (baixo ruído); 8.000 visualizações em 360°, com 15 ms de tempo de exposição por visualização (tempo de varredura de 120 s); tipo de rotação: contínuo, modo de sensibilidade: alta sensibilidade. Para ratos, defina os parâmetros do protocolo de aquisição da seguinte forma: tensão do tubo de 80 kV, 16.000 visualizações em 360°, com tempo de exposição de 12 ms por visualização (tempo de varredura de 192 s).
      2. Para o protocolo de pré-processamento para mouse: selecione 120 μm de tamanho de voxel; Campo de visão transversal (FOV): Mouse; FOV axial: 50%. Para ratos, selecione um tamanho de voxel de 240 μm; Campo de visão transversal (FOV): Rato; FOV axial: 50%.
      3. Para o protocolo de reconstrução: janelas de filtro: liso, tamanho do voxel: padrão; ativar o endurecimento do feixe e a pré-correção do anel, desativar a correção do poste do artefato do anel.
    4. Abra a guia Fluxo de trabalho na GUI e crie um novo fluxo de trabalho , adicionando os protocolos recém-criados: etapas 1.1.1.1-1.1.1.3 para PET, etapas 1.1.2.1. -1.1.2.3. para CTAC e etapas 1.1.3.1. -1.1.3.3. para TC fechado, na ordem dada. Em ambos os casos, certifique-se de que os protocolos estão aninhados com a seguinte ordem: Aquisição | Pré-processamento | Reconstrução.
      NOTA: Quadros dinâmicos de PET com durações <5 s para melhor capturar o pico da função de entrada arterial no início da PET scan são possíveis, mas não são recomendados, pois isso pode levar a imagens barulhentas com precisão quantitativa reduzida. Na etapa 1.1.2.2, utilizamos o tamanho "Rato" para o FOV transversal. Isso é comumente usado para ratos e camundongos no CTAC.

2. Preparação animal para imagens PET/CT

NOTA: Para o presente protocolo, todos os animais foram mantidos em jejum durante a noite.

  1. Anestesiar o camundongo com isoflurano de 3%-4% (v/v) em uma câmara de indução inicialmente e, em seguida, manter com isoflurano a 1%-2% (v/v).
  2. Pesar o rato e medir a glicemia basal para monitorizar o estado do animal. Para tirar a amostra de sangue necessária, use uma tesoura afiada e faça um pequeno corte na ponta da cauda, em seguida, massageie suavemente a cauda para coletar uma gota de sangue (~ 1 μL) diretamente na tira de teste.
  3. Proceder à inserção de um acesso venoso ao nível da veia caudal utilizando uma borboleta 29 G para ratinho e 24 G para rato.
    1. Para realizar a técnica de canulação, use aquecimento simultâneo (normalmente, sob uma lâmpada de aquecimento) e desinfecção do ponto onde a agulha é inserida para vasodilatação da veia. Após a canulação, fixe a borboleta com uma fita de seda na cauda para mantê-la no lugar durante o procedimento.
      NOTA: O jejum é necessário para estudos [18F]FDG. Diferentes marcadores podem envolver diferentes preparações animais, mas uma discussão aprofundada sobre este tópico está fora do escopo do presente protocolo. No que diz respeito ao [18F]FDG, evitar o jejum leva a uma biodistribuição de traçadores muito diferente16.
  4. Ligue o sistema de anestesia (isoflurano 1%-2%, 0,8 L/min O 2 para rato e 1-1,2 L/min para rato) ligado ao scanner PET-CT e transfira o rato para a cama.
  5. Coloque o rato na posição supina, de cabeça em primeiro lugar, no leito do scanner do tomógrafo PET-CT, colocando o nariz na máscara do nariz para anestesia e bloqueando suavemente a cabeça do rato à máscara com fita adesiva.
  6. Fixe os membros superiores e inferiores do rato no leito do scanner para evitar quaisquer movimentos involuntários durante os procedimentos de imagem, o que pode levar a artefatos de movimento.
  7. Monitore a temperatura corporal e a taxa de respiração usando uma sonda retal e um travesseiro de respiração, respectivamente.

3. Preparação da dose do traçador PET

  1. Para camundongos, retire 10 MBq de [18F]FDG em um volume de 100-150 μL com uma seringa de insulina (1 mL). Para ratos, obtenha uma dose mais elevada de 15 MBq em 0,20-0,25 ml.
    NOTA: Evite uma atividade mais alta, pois o scanner PET discutido neste protocolo tem sensibilidade muito alta e requer apenas uma quantidade modesta de atividade para obter imagens de alta qualidade.
  2. Se a concentração original do marcador no frasco para injetáveis for demasiado elevada, utilize solução fisiológica (0,9% p/v NaCl) para diluir a dose do marcador para uma concentração de 50-100 MBq/ml.
  3. Use o calibrador de dose PET para medir a atividade real na seringa. Anote a atividade de pré-injeção e o tempo de medição, pois esses valores serão usados posteriormente usando módulos de entrada específicos da GUI do scanner PET.

4. Preparação do agente de contraste por TC

  1. Retirar 0,2 ml por 20 g de peso de rato de agente de contraste em emulsão lipídica iodada para uma seringa de 1 ml. Limitar o volume de injeção a 0,5 ml de AC para ratinhos mais pesados. Se estiver a utilizar iomeprol, defina a taxa de injeção para ratinhos para 10 ml/h (~0,17 ml/min) e limite o volume de injeção a 0,5 ml.
    1. Para ratos, retire 2,3-3 ml de iomeprol, diluído a uma concentração de 200 mg/ml, numa seringa de 5 ml.
      NOTA: Se a emulsão lipídica de pequenos animais CA não estiver disponível, o iomeprol com injeção contínua por meio de uma bomba de seringa pode ser usado, conforme discutido abaixo.
    2. Ligue a seringa à bomba da seringa e ajuste a bomba para o tamanho e diâmetro reais da seringa.
    3. Ligue a seringa ao tubo e à agulha da AC e encha previamente a tubagem com a AC.
    4. Defina a taxa de injeção para 24 ml/h (= 0,4 ml/min), limitando a injeção a um volume máximo de 2 ml.
      NOTA: O uso de CA de pool sanguíneo à base de emulsão lipídica iodada também é possível em ratos, apesar do custo relativamente alto deste procedimento devido ao maior volume de uma única injeção. Se essa opção for preferida (por exemplo, para simplificar o protocolo evitando a bomba de seringa), o seguinte procedimento pode ser empregado:
  2. Retirar 7,5 ml por kg de peso corporal de agente de contraste em emulsão lipídica iodada numa seringa de 5 ml. Limite o volume de injeção a 2 mL de CA também para ratos mais pesados.

5. Alinhamento dos animais e operações preliminares antes da obtenção de imagens

  1. Após a imobilização do animal no leito de imagem, crie um novo estudo sobre a GUI do tomógrafo. Adicione um identificador de nome de estudo no módulo Nome do estudo e selecione o fluxo de trabalho de imagem salvo anteriormente no menu suspenso.
  2. Selecione a parte anatômica adequada com informações sobre Animais/Espécimes | Parte anatômica | Posicionamento cardíaco e animal por informações sobre animais/espécimes | Posicionamento | Supina/Cabeça primeiro. Anote o peso do animal em gramas para o módulo correspondente: Informações sobre animais/espécimes | Peso animal.
    NOTA: Todas as outras informações nesta seção são opcionais, mas é útil fornecer o máximo possível das informações solicitadas para encontrá-las no cabeçalho DICOM das imagens de reconstrução, facilitando assim a consulta de dados subsequente.
  3. Selecione o radionuclídeo nas informações do PET Scan | F18 para estudos de [18 F]FDG e outros 18compostos marcados com F; modificar se outros rastreadores (por exemplo, [13N]NH3) forem usados. Escreva também o nome do marcador nas informações do PET Scan | Módulo de nome do rastreador como este nome será relatado no cabeçalho DICOM após a conclusão da reconstrução da imagem.
    NOTA: As informações sobre o tempo, a atividade e o volume da injeção do traçador são obrigatórias, mas podem ser fornecidas posteriormente durante a aquisição do PET.
  4. Nas informações da tomografia computadorizada, escreva todas as informações disponíveis sobre o agente de contraste.
    Observação : todas essas informações são opcionais, mas podem facilitar a consulta de dados subsequente, se fornecidas.
  5. Pressione Executar varredura e aguarde que outra aba da GUI seja aberta, permitindo o posicionamento do animal e a especificação de outras opções de digitalização.
  6. Selecione o tipo de calibração de TC em calibração de TC | Use a calibração de TC padrão.
  7. Na seção Preparação do estudo , selecione cada protocolo de varredura no menu suspenso e marque a caixa de seleção Aguarde a confirmação do usuário antes dessa verificação .
    NOTA: Esta etapa é muito importante, pois colocará o scanner em espera aguardando a entrada do usuário antes de iniciar a fase de aquisição correspondente. Para a varredura PET, isso permitirá a sincronização da injeção do traçador e o início real da varredura PET; para a tomografia computadorizada, permitirá que o usuário feche a tampa (blindagem) antes da emissão de raios-X durante a tomografia computadorizada (o estudo será abortado automaticamente se a tampa estiver aberta antes do início da tomografia computadorizada); para a varredura Cine-CT, essa pausa permitirá que o usuário inicie o protocolo de infusão de CA e a tomografia computadorizada com o atraso necessário.
  8. Para o posicionamento de animais, ligue o módulo de controle do motor usando o interruptor no painel esquerdo da GUI.
    NOTA: Isso ativará os lasers de centralização na cama do animal e ativará os botões de alinhamento manual da cama colocados na lateral do scanner.
  9. Use os botões de alinhamento manual da cama para mover o peito do animal para as marcas a laser. Verifique cuidadosamente o alinhamento longitudinal e vertical do animal.
  10. Uma vez que o animal é colocado na posição correta de acordo com o laser de centralização, pressione Desligar o laser para salvar a posição atual marcada a laser, que deve ser movida para o centro dos scanners PET e CT durante as fases de aquisição correspondentes. Depois, desligue o módulo de controle do motor.

6. Tomografia por emissão de pósitrons (PET)

  1. Pressione Iniciar aquisição para mover o animal para o scanner PET FOV. A cauda e a cânula permanecerão fora do FOV para permitir a injeção do traçador. O scanner permanecerá ocioso até que o usuário pressione o botão Continuar .
  2. Prepare a seringa com a dose calibrada do marcador PET.
  3. Inicie a aquisição pressionando o botão Continue e comece a injetar o marcador na cânula dentro de 5 s a partir do início da digitalização (Figura 1).
    NOTA: A duração da injeção será de ~20-25 s.
  4. Coloque a seringa no calibrador de dose PET para medir a atividade residual na seringa. Anote a atividade real e o tempo de medição.
  5. Na guia Monitor de hardware da GUI do scanner, use o botão Atualizar informações do traçador PET para inserir o tempo, a atividade e o volume injetados reais.
  6. Durante a varredura, verifique os parâmetros fisiológicos do animal periodicamente.
  7. Durante o exame, meça a glicemia conforme explicado na etapa 2.2 nos seguintes momentos: 5 min, 20 min, 40 min e 60 min após o início do PET scan.
  8. Após a medição da glicemia, coloque a tira de teste no contador gama e realize a medição da atividade por 60 s. Registre o tempo real em que a medição da atividade foi realizada e corrija o decaimento radioativo, tomando o tempo de injeção do traçador como um tempo de referência. Converta os valores de atividade registrados em concentração de atividade (Bq/mL) considerando um volume sanguíneo médio de 1 μL na tira de teste de glicose (ou seja, usando a equação [1]):
    C sangue(t) = Asangue(t)/0,001 mL [Bq/mL] (1)
    em que A(t) de sangue é a actividade medida corrigida pelo decaimento da amostra de sangue na tirade ensaio, expressa em Bq.
    NOTA: O início da tomografia computadorizada e a injeção do traçador podem ser realizados pelo mesmo operador usando o dispositivo de controle móvel do tomógrafo colocado na mesa lateral do scanner perto do local do operador durante a injeção. Atrasos mais longos entre o início da varredura e o início da injeção são permitidos, mas alguns quadros reconstruídos no início da sequência dinâmica permanecerão em branco. Recomenda-se evitar atrasos maiores que 10 s (ou seja, levando a dois quadros em branco com o protocolo atual).

Figure 1
Figura 1: Injeção do traçador PET. Esta operação é realizada logo após o início da PET Scan. O animal está dentro do campo de visão do PET (cabeça primeiro, com a cauda visível no lado do operador). Abreviação: PET = tomografia por emissão de pósitrons. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Tomografia computadorizada

  1. Antes de injetar o agente de contraste CT, inicie a varredura CTAC logo após fechar a tampa do scanner e pressionar o botão Continuar na GUI. No final desta aquisição muito curta, empregue os seguintes procedimentos para garantir o aumento adequado do pool sanguíneo, injetando o CA antes da aquisição usando o mesmo acesso vascular empregado para a injeção do marcador PET.
    1. Emulsão lipídica iodada CA:
      1. Após a conclusão da varredura CTAC, injete a emulsão lipídica iodada CA usando a cânula já conectada à veia da cauda do rato. A duração típica da injeção é da ordem de 30-60 s.
      2. Inicie a imagem logo após a conclusão da injeção. Pressione Continue na GUI do scanner para iniciar a aquisição do Cine-CT.
    2. Bomba de iomeprol/seringa:
      1. Se uma CA de raios-X normal for usada, como o iomeprol, use uma bomba de seringa que permita a injeção lenta a uma taxa constante.
      2. Para camundongos, defina a taxa de injeção do CA para 10 mL/h (~ 0,17 mL/ min) limitando o volume de injeção a 0,5 mL. Com esta configuração, pare a injeção após ~ 3 min. Para ratos, ajuste a bomba para uma taxa de 24 mL/h (= 0,4 mL/min) e limite o volume de injeção a 2 mL. Com esta configuração, pare a injeção após 5 minutos.
      3. Conecte a agulha presa à tubulação CA à cânula da veia da cauda, garantindo que tanto a tubulação quanto a agulha sejam pré-preenchidas com CA.
      4. Inicie a injeção. Feche a tampa do scanner e prepare-se para a varredura Cine-CT.
      5. Pressione o botão Continuar na GUI do tomógrafo após 60 s do início da injeção para camundongos e após 90 s do início da injeção para ratos, para que a aquisição do Cine-CT seja iniciada. A injeção de CA irá parar aproximadamente ao mesmo tempo que a conclusão da varredura Cine-CT para camundongos e após a conclusão para ratos.
  2. Após a conclusão da tomografia computadorizada Cine-CT, desconecte o animal do sistema de monitoramento fisiológico e remova a cânula da veia da cauda. Dependendo do protocolo real, os animais são recuperados ou sacrificados após o procedimento de imagem descrito. No primeiro caso, os animais são acordados em suas gaiolas em um ambiente quente sob uma lâmpada infravermelha. Eles são monitorados até o despertar completo, levando 15/30 min após a anestesia gasosa. No caso de protocolos que exijam, por exemplo, a colheita de tecidos no final do procedimento de imagem, os animais são eutanasiados usando uma overdose de anestésico em uma câmara de indução (isoflurano a 5%), conforme Anexo VI da D.Lgs. 26/2014.
    NOTA: No caso de 18radionuclídeos à base de F, conforme discutido neste protocolo, 24 horas após a injeção do traçador são suficientes para atingir um nível de radioatividade residual no corpo do animal que seja seguro para todos os fins práticos.

8. Reconstrução das imagens cardíacas de 4DCT utilizando gating cardiorrespiratório intrínseco

NOTA: Após a conclusão do estudo de imagem, a reconstrução padrão de PET e TC é realizada automaticamente. No entanto, a reconstrução da sequência de cardiotomografia computadorizada 4D (Cine) deve ser realizada manualmente e requer alguma interação do usuário. Este tipo especial de reconstrução, obrigatório para a subsequente análise morfofuncional da TC cardíaca, é discutido nesta seção.

  1. Abra o módulo de bloqueio cardíaco da GUI do tomogragh e selecione o estudo de imagem a ser analisado.
  2. Selecione uma região de interesse (ROI) nas radiografias do animal exibido (Figura 2) para construir uma curva de movimento cardíaco dependente do tempo, representando o sinal de bloqueio - o quimograma. Mova verticalmente o ROI retangular pré-desenhado de tal forma que o ápice cardíaco e o diafragma sejam selecionados. Em seguida, selecione Análise de sinal de Gating. A interface do usuário agora mostrará o sinal de bloqueio tanto no domínio do tempo quanto no domínio da frequência.
  3. No primeiro gráfico do domínio da frequência, selecione a banda de frequência respiratória destacando o primeiro grupo de picos do espectro de frequências (consulte a Figura 3 para obter um exemplo de espectro).
  4. No segundo gráfico no domínio da frequência, selecione a banda de frequência de movimento cardíaco, destacando o segundo pico mais acentuado.
  5. Na fase seguinte, observe o sinal de bloqueio no domínio do tempo com marcadores de cor (pontos) sobrepostos, mostrando os picos respiratórios e os picos de contração cardíaca identificados. Se as posições do marcador se encaixarem bem com os picos respiratórios e cardíacos do sinal de bloqueio original, prossiga para a próxima fase. Caso contrário:
    1. Se a forma do sinal de bloqueio for muito diferente da exibida na Figura 3, volte para a etapa 8.2 e selecione outro ROI.
    2. Se a forma do sinal de bloqueio for razoavelmente semelhante à mostrada na Figura 3, volte para as etapas 8.3 e 8.4 e selecione bandas de frequência diferentes no espectro de sinal de bloqueio.
  6. Na próxima fase, selecione um mínimo de quatro portas cardíacas.
    NOTA: A reconstrução típica da Cine-TC consiste em 8-12 portas cardíacas.
  7. Selecione a janela respiratória adequada usando o menu suspenso: Janela respiratória | 20%-80%.
    NOTA: Isso reterá 60% dos dados adquiridos na reconstrução, excluindo a fase de pico de inspiração e, assim, melhorando a nitidez das paredes miocárdicas reconstruídas em cada fase cardíaca.
  8. Execute a reconstrução para converter as imagens Cine-CT retrospectivamente fechadas no formato DICOM, prontas para serem importadas para o software para posterior análise funcional.

Figure 2
Figura 2: Ferramenta de seleção de ROI para gating intrínseco. Esta imagem é mostrada na GUI do tomógrafo durante a fase de reconstrução do Cine-CT. O usuário deve selecionar a posição do ROI (retângulo amarelo) no qual o sinal de bloqueio intrínseco (quimograma) é obtido a partir das projeções brutas de TC. O objeto de forma circular sobreposto ao peito do animal é o travesseiro respiratório usado apenas para monitoramento fisiológico durante o estudo. Abreviaturas: ROI = região de interesse; TC = tomografia computadorizada; GUI = interface gráfica do usuário. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Exemplo de sinal de bloqueio (quadro superior) e espectro de frequência correspondente (centro e inferior). Imagens obtidas com o módulo de bloqueio cardíaco do software Atrium. O usuário deve selecionar as bandas de frequência adequadas para o movimento respiratório (quadro central) e cardíaco (quadro inferior). Isso permitirá a identificação dos marcadores respiratórios e cardíacos no sinal de bloqueio, que devem ser verificados pelo usuário antes de prosseguir com a reconstrução 4D. A má identificação dos picos ou a atribuição errada (por exemplo, respiratória para cardíaca, ou vice-versa) levará a uma reconstrução incorreta. Os dados apresentados foram obtidos a partir da análise de uma cinétilografia 4D de um rato Wistar macho adulto saudável (507 g) injetado com 2 mL de iomeprol, 200 mg/mL, à taxa de 0,4 mL/min por 5 min (o gráfico no topo é ampliado nos primeiros 22 s de aquisição para permitir uma melhor visualização do movimento cardíaco e respiratório identificado). Abreviação: TC = tomografia computadorizada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

9. Análise cardíaca PET

NOTA: Esta seção mostra como realizar uma análise cinética de dados dinâmicos [18F]FDG do ventrículo esquerdo de pequenos animais. A análise é baseada no software Carimas. As instruções abaixo não se destinam a substituir o manual do usuário do software17. O procedimento apresentado a seguir baseia-se na análise gráfica de Patlak dos dados dinâmicos do PET18. Consulte a seção Discussão para obter detalhes sobre essa análise.

  1. Abra as imagens DICOM da PET scan dinâmica.
  2. Selecione o módulo HeartPlugin .
  3. Amplie a imagem no coração do rato/rato e selecione o último período de tempo (ou, equivalentemente, a soma dos últimos três a cinco períodos de tempo) para o qual a maior parte da atividade do pool de sangue já foi lavada.
  4. Siga as instruções na tela para reorientar a imagem ao longo do eixo principal do coração do animal (eixo curto, eixo longo vertical e horizontal). Faça isso interativamente movendo os marcadores exibidos para a base e o ápice do coração (Figura 4).
  5. Selecione a ferramenta Segmentação .
    Observação : por padrão, a segmentação automática está habilitada, o que produz resultados confiáveis na maioria dos casos.
  6. Se o resultado da segmentação automática não for aceitável, refine a forma do miocárdio segmentado e/ou da cavidade do VE ativando o Modo Manual (ROI Search Disabled).
  7. Na Ferramenta de modelagem , selecione o modelo cinético apropriado a ser usado para a análise dinâmica de PET. Nesse caso, selecione Gráfico | Patlak para permitir a análise do gráfico de Patlak para o cálculo da taxa metabólica de captação de glicose (MRGlu) para cada setor cardíaco.
  8. Na ferramenta polarmap , selecione o número correto de segmentos cardíacos exibidos. Nesse caso, selecione 17 segmentos.
  9. Agora, pressione o botão Ajustar para executar o procedimento de ajuste da análise de Patlak.
  10. Ao final do procedimento de ajuste, observe o mapa polar exibido dos valores de Ki (ou seja, a inclinação da regressão linear expressa em mL/[mL × min]).
  11. Usando os valores de Ki para cada setor mostrado em uma tabela, calcule o MRGlu usando a equação (2):
    MR Glu = (Ki × PGlu)/LC (2)
    onde PGlu é um valor derivado de amostra de sangue da concentração de glicose plasmática (mmol / L), e a constante agrupada (LC) é um coeficiente empírico usado para compensar a diferença na absorção entre glicose normal e FDG. Ver, por exemplo, Ng et al.22 para valores típicos da constante agrupada em várias condições experimentais.
    NOTA: Antes de iniciar a análise PET, é uma boa prática inspecionar visualmente a sequência dinâmica dos volumes de PET dentro da ferramenta de software de análise PET. Isso é necessário para excluir o movimento macroscópico do animal entre os períodos de tempo durante o estudo. Se houver movimento, o registro adequado da imagem (fora do escopo deste protocolo) deve ser realizado antes da análise, se possível.

Figure 4
Figura 4: Ferramenta de reorientação do software de análise PET. A projeção de dois segmentos de linha simples no espaço 3D é mostrada em cada um dos três planos padrão (transaxial, coronal e sagital). O primeiro segmento permite que o usuário selecione a base e o ápice do coração, enquanto o segundo permite selecionar os lados esquerdo e direito do coração. Esta etapa resulta em uma nova imagem PET (interpolada) (linha inferior), com o coração reorientado ao longo da representação AHA padrão. As imagens foram obtidas com Carimas de um rato CD-1 macho adulto saudável pesando 51 g e injetado com 10 MBq de [18F]FDG. Abreviaturas: PET = tomografia por emissão de pósitrons; AHA = Associação Americana do Coração; FDG = fluorodesoxiglicose. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

10. Análise cardíaca por cine-TC

NOTA: Esta seção mostra como realizar a análise quantitativa da imagem cardíaca Cine-CT para coletar dados quantitativos globais da função cardíaca. A análise é baseada no software Osirix MD. As instruções abaixo não se destinam a substituir o manual do usuário do Osirix24.

  1. Carregue as imagens DICOM da varredura Cine-CT no software.
  2. Abra o conjunto de dados dinâmico com o visualizador 4D incorporado.
  3. Usando a ferramenta Reforma Multiplanar 3D (MPR), reoriente os dados da imagem ao longo do eixo curto (Figura 5).
  4. Exporte os dados reorientados para o DICOM, garantindo que todos os dados 4D sejam exportados, com espessura de fatia preservada (igual à original) e profundidade de bits da imagem (16 bits por voxel)
  5. Abra as imagens 4D MPR exportadas usando o visualizador 4D.
  6. Selecione um período de tempo correspondente à diástole-final. Navegue por todos os períodos de tempo com o controle deslizante de tempo na barra de ferramentas principal para garantir que a fase cardíaca correta seja selecionada.
  7. Nesse período de tempo, escolha a ferramenta de anotação de polígono fechado e delineie manualmente a parede endocárdica do VE.
  8. Faça o mesmo para 10-20 fatias da base ao ápice, garantindo que todos os ROIs tenham o mesmo nome (por exemplo, LVENDO).
  9. No menu ROI , selecione Volume de ROI | Gere ROIs ausentes para gerar os ROIs em todas as fatias de eixo curto por interpolação dos ROIs desenhados manualmente.
  10. No menu ROI , selecione Volume de ROI | Calcule Volume para calcular o volume do grupo ROI com o mesmo nome de ROI.
  11. Navegue pelos períodos de tempo e selecione uma fase correspondente à sístole final (volume LV menor) e repita as etapas 10.7-10.10 acima.
  12. Calcular o volume sistólico (SV) e a fração de ejeção utilizando as equações (3) e (4):
    VS = EDV - ESV[mL] (3)
    FE = 100 × SV/EDV [%] (4)
    onde EDV é o volume diastólico final e ESV é o volume sistólico final.

Figure 5
Figura 5: Interface gráfica da ferramenta de reforma multiplanar. Esta ferramenta é utilizada para a reorientação dos dados do Cine-CT para posterior análise funcional. O utilizador deve girar e traduzir os eixos de referência no lado esquerdo do ecrã de modo a que a vista de eixo curto do coração seja mostrada à direita. No final deste procedimento, o usuário pode exportar as imagens reorientadas como um conjunto de arquivos DICOM. As imagens foram obtidas com Osirix MD e referem-se a um rato Wistar macho adulto saudável (507 g) injetado com 2 mL de iomeprol, 200 mg/mL, a uma taxa de 0,4 mL/min por 5 min, reconstruído com Retroprojeção Filtrada com um tamanho de voxel de 0,24 mm3. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

Nesta seção, os resultados típicos são mostrados para a análise de PET e TC seguindo os procedimentos descritos até o momento. A Figura 6 mostra os resultados da segmentação automática do miocárdio e da cavidade do VE do exame de [18F]FDG PET de um camundongo CD-1 controle (saudável). Embora o ventrículo direito nem sempre seja visível nas imagens reconstruídas, os eixos de orientação baseados no cabeçalho DICOM podem ser utilizados para discriminar corretamente o septo interventricular das demais paredes do VE, conforme necessário para a identificação confiável dos setores padrão seguindo as recomendações da American Heart Association (AHA)25 . No caso de isquemia miocárdica, uma redução regional da captação do traçador aparece como um sinal típico de perda de vitalidade miocárdica. Isso não está necessariamente correlacionado com a perfusão reduzida, que precisaria de um traçador diferente (por exemplo, [13N]NH3 ou [15O]H2O) para ser visualizado em imagens PET. Mesmo em indivíduos saudáveis, valores reconstruídos mais baixos ao redor do ápice são comumente observados na PET (ver Figura 6). Isso pode surgir de um artefato de volume parcial mais pronunciado devido a uma espessura miocárdica (geralmente) mais fina no ápice, em comparação com, por exemplo, a parede esquerda ou o septo.

Figure 6
Figura 6: Resultados da segmentação automática do software de análise PET. As imagens foram obtidas com o plugin Heart do software Carimas. A segmentação foi feita após a reorientação padrão de acordo com as diretrizes da AHA. As imagens mostradas referem-se a um camundongo CD-1 adulto saudável (o mesmo que a Figura 4) pesando 51 g e injetado com 10 MBq de [18 F]FDG, sem bloqueio cardíaco, e somando os últimos 15min de um PET scan. As imagens foram reconstruídas com um algoritmo iterativo 3D-OSEM com um tamanho de voxel de 0,85 mm3. Abreviaturas: PET = tomografia por emissão de pósitrons; AHA = Associação Americana do Coração; FDG = fluorodesoxiglicose. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na Figura 7, um exemplo do Ki regional obtido através da análise gráfica de Patlak18 é mostrado (canto superior esquerdo). No quadro na parte inferior, o gráfico de dispersão de Patlak e os resultados correspondentes da análise de regressão linear são mostrados. Cada ponto no gráfico de dispersão representa a razão entre a concentração de atividade tecidual e a concentração de atividade plasmática em um determinado momento t (após correção para decaimento radioativo), CT(t)/CP(t), plotado contra a integral de tempo da concentração de atividade plasmática do tempo de injeção t 0 =0 ao tempo t. A tabela no quadro superior direito da Figura 7 mostra os valores da inclinação (Ki) e interceptação (Ic) do ajuste linear realizado em cada segmento, juntamente com o coeficiente de determinação correspondente (R2).

No que diz respeito à PET cardíaca, os sinais de má execução do protocolo podem incluir, mas não estão limitados a, o seguinte: (i) baixa ou ausente captação do marcador do miocárdio, o que é tipicamente um sinal de que ocorreu um problema durante a injeção do traçador, como uma injeção extravasada; ii) problemas semelhantes aos do ponto anterior se a temperatura do animal for demasiado baixa durante a PET (por exemplo, inferior a 35 °C) e, por conseguinte, se ocorrer uma alteração da captação do traçador; (iii) desfoque evidente da imagem, que pode ser devido a um nível de anestesia muito baixo ou movimento involuntário.

Figure 7
Figura 7: Resultados da análise gráfica de Patlak. As imagens foram obtidas com o plugin Heart do software Carimas. Canto superior esquerdo: mapa polar paramétrico da região Ki do VE resultante da análise de Patlak. Canto superior direito: valores médios de Ki e IC em cada segmento miocárdico, juntamente com os coeficientes de determinação de cada ajuste linear (R2). Inferior: gráfico de dispersão de y(t) versus x(t) (consulte o texto para obter detalhes) para o segmento miocárdico selecionado (segmento 1 neste exemplo). Este resultado refere-se às imagens de PET miocárdica mostradas na Figura 4 e na Figura 6 (camundongo adulto adulto saudável com CD-1 pesando 51 g e injetado com 10 MBq de [18F]FDG). Abreviaturas: PET = tomografia por emissão de pósitrons; FDG = fluorodesoxiglicose. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Exemplo de segmentação manual do VE de um rato. A imagem refere-se ao mesmo animal mostrado na Figura 5 e foi obtida com Osirix MD. A análise volumétrica resultante do VE na diástole final e na sístole final é mostrada na parte inferior. A partir desses resultados, a FE e a VS são calculadas de acordo com as equações 3 e 4. Abreviaturas: FE = fração de ejeção; VS = volume sistólico; ROIs = regiões de interesse; VE = ventrículo esquerdo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Renderização de volume das imagens do Cine-CT. As imagens referem-se ao mesmo rato mostrado na Figura 5 e na Figura 8 (rato Wistar macho adulto saudável pesando 507 g e injetado com 2 mL de iomeprol, 200 mg/mL, à razão de 24 mL/h por 5 min, reconstruído com FBP com tamanho de voxel de 0,24 mm3). Abreviaturas: AR = átrio direito; AE = átrio esquerdo; VE = ventrículo esquerdo; VD = ventrículo direito; TC = tomografia computadorizada; FBP = Retroprojeção Filtrada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 8 e a Figura 9 tratam dos resultados representativos da análise cardíaca da Cine-CT para um rato saudável. Em particular, na Figura 8, as diferentes formas e tamanhos do VE são mostrados para as fases diastólica final e sistólica final, juntamente com a reconstrução 3D do volume segmentado do VE em ambas as fases. Neste exemplo, o cálculo dos volumes de acordo com as equações 3 e 4 resultou em EDV = 0,361 mL e ESV = 0,038 mL, correspondendo a um volume sistólico de VS = 0,323 mL e uma fração de ejeção EF = 89,4%. Isso está de acordo com os resultados relatados em protocolos semelhantes na literatura, mostrando FE normal de ratos na faixa de 70%-90%26. Corações infartados podem levar a uma FE reduzida, na faixa de 50% a 70% ou menos, dependendo da gravidade da lesão e da extensão do miocárdio acinético.

Os seguintes sinais de má execução do experimento podem ocorrer para as imagens de Cine-CT: (i) contraste de imagem reduzido ou ausente entre as câmaras/vasos cardíacos e o miocárdio; neste caso, é provável que tenha ocorrido um problema na injeção do agente de contraste; (ii) contornos borrados das paredes miocárdicas; neste caso, ocorreu um problema na reconstrução, provavelmente devido à identificação errada dos picos cardíacos e respiratórios a partir do sinal de bloqueio intrínseco, que, por sua vez, pode depender da má seleção das bandas de frequência (Figura 3) e/ou má seleção do ROI do sinal de bloqueio (Figura 2); (iii) artefatos de movimento evidentes, que podem ser devidos a um nível de anestesia muito baixo ou movimento involuntário.

Na Figura 9, uma renderização de volume do mesmo coração de rato é mostrada tanto para a diástole final quanto para a sístole final. Este tipo de visualização só permite descrever as câmaras e vasos reforçados com iodo, de modo que seu valor é mais qualitativo do que quantitativo. No entanto, a motilidade reduzida das paredes miocárdicas, como a encontrada em ratos infartados, produzirá imagens volumétricas com diferenças menos evidentes entre as fases diastólica final e sistólica final.

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Discussion

O protocolo apresentado neste artigo enfoca um procedimento experimental típico para pesquisa cardiovascular translacional em pequenos modelos animais de lesão cardíaca usando imagens PET/CT de alta resolução. Os resultados apresentados são indicativos do alto valor quantitativo e qualitativo das imagens PET e Cine-CT, fornecendo informações funcionais e estruturais de todo o coração sobre seu metabolismo da glicose, forma e dinâmica de sua contração. Além disso, todas as imagens obtidas são 3D, resolvidas no tempo e apresentam espaçamento isotrópico de pixels; isso é benéfico do ponto de vista do processamento de imagem, pois não requer tarefas dependentes do operador de pré-digitalização para selecionar orientações de fatia específicas ao longo dos eixos padrão do coração.

Este trabalho inclui um protocolo baseado na análise gráfica de Patlak de dados dinâmicos de PET18. Esse tipo de análise é útil para descrever a captação irreversível do traçador do tecido, o que é uma boa aproximação no caso do [18F]FDG, onde o efeito da desfosforilação ou metabólitos é geralmente insignificante no miocárdio19. Dentro desta aproximação, a razão entre a concentração de atividade tecidual corrigida por decaimento CT(t) e a concentração de atividade plasmática corrigida por decaimento CP(t) pode ser aproximada pela seguinte equação (5):

Equation 1 (5)

que vale para os tempos t, após uma certa hora de início, t*, que deve ser determinada empiricamente. Na equação acima, a constante Ki representa a taxa de influxo líquido do sangue para o tecido, enquanto IC é uma constante que envolve a fração de volume sanguíneo e o volume de distribuição do marcador no compartimento reversível (ou seja, o plasma). Uma derivação matemática mais detalhada dessa fórmula pode ser encontrada em outro lugar20. Se as curvas de atividade temporal (TACs) do plasma e do tecido estiverem disponíveis (por exemplo, a partir de uma varredura dinâmica de PET e/ou amostragem de plasma), um gráfico de dispersão 2D pode ser criado por plotagem Equation 2 Equation 3 e, para cada período de tempo, t, de modo que Ki e IC possam ser facilmente determinados como a inclinação e interceptação do gráfico de dispersão por regressão linear simples, restrito aos pontos de tempo t > t* após os quais a linearidade é observada. Deve-se ressaltar que a anestesia prolongada pode impactar na taxa metabólica do miocárdio21. Por esta razão, é muito importante padronizar o protocolo para que as variações inter-sujeitos de todos os parâmetros fisiológicos relevantes sejam mantidas ao mínimo. O procedimento descrito no protocolo, implementado em Carimas, permite a análise gráfica regional de Patlak do miocárdio; usamos a concentração de atividade do sangue total na cavidade do VE como uma aproximação da função de entrada plasmática CP(t).

Alguns scanners PET podem ter menor resolução espacial e/ou sensibilidade, levando ao uso de ROIs maiores e erros consistentes de volume/transbordamento parcial nas curvas de atividade temporal (TACs) das medições, especialmente a plasmática usada como função de entrada (IF). Neste caso, o protocolo de análise pode ser modificado através da criação de um FI híbrido com base nos valores da imagem na fase inicial após a injeção e na concentração de atividade da amostra de sangue (ver passo 6.8 do protocolo) na fase tardia (>20 min). Os pontos corrigidos do FI híbrido podem ser calculados por interpolação, como mostram Shoghi et al.23. Dentro do Carimas, é possível exportar os TACs brutos de cada segmento miocárdico, corrigir o TAC arterial e carregá-los novamente para realizar a análise de Patlak diretamente nas curvas corrigidas. Devido à complexidade da operação necessária, não fornecemos operações de protocolo específicas para fazer isso, pois os resultados obtidos no caso descrito neste protocolo têm um bom nível de reprodutibilidade para a maioria das aplicações.

Uma possível aplicação do protocolo apresentado é em pequenos modelos animais de infarto do miocárdio. Para evitar restrições a um campo tão específico de pesquisa de imagem, não foi adicionada uma instrução de protocolo específica para a indução de IAM ou outros tipos de doenças cardiovasculares. Procedimentos cirúrgicos detalhados podem ser encontrados em outras partes da literatura12,13, e têm sido aplicados com sucesso em nosso grupo com o objetivo de descrever informações complementares tanto para defeitos de perfusão regional quanto para angiogênese induzida por isquemia4. No entanto, o protocolo de imagem PET/CT apresentado neste trabalho pode ser útil em uma variedade de desenhos de estudo quando o metabolismo, a função e/ou a morfologia cardíaca são preocupantes, incluindo, mas não se limitando a, doenças metabólicas27, resposta à terapia e/ou a diferentes dietas 28 e lesões induzidas por radiação29. Além disso, esse tipo de investigação pode ser útil na validação de novas sondas moleculares para monitoramento do remodelamento cardíaco e da neovascularização em correlação com a função e morfologia cardíaca global e regional 4.

Aqui, discutimos uma aquisição e análise típica de imagens PET focadas na quantificação da captação de glicose regional miocárdica por meio de [18F]FDG; para a imagem do infarto do miocárdio, por exemplo, esta é útil e amplamente adotada para medir a viabilidade miocárdica26 como informação complementar sobre a perfusão, que requer diferentes traçadores. Além disso, [18F]FDG é o traçador mais amplamente disponível em imagens PET e, portanto, decidimos adaptar este protocolo a este traçador para aumentar sua aplicabilidade. Com pequenas modificações no fluxo de trabalho de análise, o mesmo procedimento pode ser usado para quantificar, por exemplo, o fluxo sanguíneo miocárdico regional (MBF), empregando [13N]NH3 ou [15O]H2O como traçadores de fluxo sanguíneo30.

Nesses casos, o protocolo de aquisição de PET requer pequenas alterações, considerando os diferentes tempos de decaimento de radionuclídeos de 13N (T 1/2 = 9,97 min) e 15 O (T 1/2 = 2,04 min) em relação a 18 F (T 1/2 = 109,8min). Além disso, modelos cinéticos apropriados devem ser usados em vez do apresentado neste artigo, que é comumente disponível na maioria dos softwares quantitativos de processamento de imagens para análise PET; além desses pontos, o procedimento experimental apresentado neste protocolo é mais adequado para outros tipos de investigação experimental voltada para o coração de pequenos animais. Embora o protocolo tenha sido projetado especificamente para imagens cardíacas de modelos de camundongos, trabalhar com ratos pode implicar algumas modificações no protocolo real, principalmente por causa do maior tamanho do animal (~ 10x mais pesado). No entanto, informações adicionais foram adicionadas ao protocolo para indicar as modificações necessárias para a imagem de ratos por uma questão de simplicidade.

Uma vantagem do protocolo apresentado é que ele não requer o uso de sondas de ECG no animal, pois o estudo PET pode ser conduzido de forma confiável sem gating, e o estudo de TC usa gating retrospectivo intrínseco (sem sensores). O algoritmo na base do software de gating intrínseco baseia-se no trabalho de Dinkel et al.31. Esse método apresenta concordância muito alta com o gating cardíaco baseado em ECG (extrínseco) e pode até ser potencialmente melhor no caso de arritmias devido à dissociação de eventos mecânicos e elétricos31. Embora o gating intrínseco possa ser implementado em fluxos de trabalho totalmente automatizados32, esse protocolo é baseado em um método interativo implementado no tomógrafo IRIS, dando mais flexibilidade na escolha dos parâmetros. Como discutido, pequenas adaptações dos procedimentos são necessárias quando se utilizam ratos em vez de camundongos, principalmente em relação às doses injetadas, à necessidade de exames de correção de atenuação (CTAC) ao se utilizar animais maiores, bem como algumas diferenças entre os tipos de contrastes tomográficos. Em relação a este último ponto, o uso de emulsões lipídicas de óleo em água ricas em iodo em ratos também é relatado nas notas técnicas de fornecedores de CA de pequenos animais. Devido aos volumes de injeção relativamente grandes envolvidos, ao custo relativamente maior e à disponibilidade menos difundida desses agentes de contraste especializados, também apresentamos uma modificação do protocolo com base em contrastes vasculares comumente disponíveis, como o iomeprol, que é amplamente aplicável em ambientes clínicos. Devido à depuração muito rápida de tais agentes vasculares padrão, uma bomba de injeção motorizada que permita a injeção contínua lenta é necessária neste caso.

Limitações do método
A aplicabilidade dos protocolos PET/CT apresentados depende da disponibilidade de instrumentação geralmente menos difundida e mais cara do que outras técnicas (principalmente ecocardiografia por US), embora as informações contextuais sobre estrutura, função e metabolismo não possam ser alcançadas por nenhuma outra técnica com a mesma sensibilidade e flexibilidade na escolha da sonda molecular. No entanto, a conclusão bem-sucedida de todo o fluxo de trabalho de preparação / aquisição / análise com essa metodologia requer uma forte colaboração entre várias figuras profissionais, incluindo biólogos, médicos veterinários, químicos, físicos e bioengenheiros. Isso é ainda mais verdadeiro quando são utilizados traçadores PET não padronizados, implicando esforços tanto na radiossíntese quanto na modelagem matemática, bem como na adaptação do software de análise para quantificação correta e confiável33,34,35.

Na seção 9 do protocolo, descrevemos um procedimento de quantificação muito simples usando uma função de entrada derivada de imagem (IDIF), apontando que uma abordagem mista usando IDIF e IF derivado de amostra de sangue para quadros tardios pode dar melhores resultados. Deve-se notar que o uso da atividade medida do sangue inteiro (venoso) retirado da cauda é considerado uma aproximação confiável no [18F]FDG, mas requer correções adicionais para a atividade dos metabólitos no caso de diferentes traçadores36,37. Um dos pontos mais críticos de todo o protocolo é a canulação intravenosa, dando acesso venoso para a injeção tanto do marcador radioativo para a PET scan quanto do meio de contraste iodado para a tomografia computadorizada. A realização sem sucesso dessa etapa crítica resulta em imagens inúteis, pois a quantidade efetiva de traçador PET circulante ou CT CA pode ser menor do que o necessário. Pessoal especializado com treinamento específico para injeção de veia caudal deve ser envolvido neste procedimento para fornecer resultados confiáveis.

Uma desvantagem da TC para imagens cardíacas dinâmicas é sua resolução temporal relativamente menor em comparação com a US e a RM, embora a imagem cardíaca 3D com ultrassonografia exija o uso de um estágio de tradução motorizada para a sonda e o subsequente registro da imagem para obter resultados corretos. A necessidade de injetar volumes consistentes de AC para a correta discriminação de sangue e miocárdio em imagens reconstruídas é uma das principais preocupações devido à baixa sensibilidade intrínseca da metodologia. Neste protocolo, limitamos o volume de injeção de AC para estudos de TC a 0,5 mL em camundongos e 2 mL em ratos, usando infusão contínua por 3 min a 10 mL/h em camundongos e por 5 min a 24 mL/h em ratos. Observamos que essas taxas e volumes de injeções são bem tolerados pelos animais. As quantidades aqui descritas estão de acordo ou são menores do que os protocolos equivalentes encontrados na literatura.

Nahrendorf e col. descreveram um protocolo Cine-CT para a representação de infarto do miocárdio murino, envolvendo uma injeção basal (pré-scan) em bolus de 0,2 mL de óleo em água de emulsão lipídica de CA seguida de uma injeção contínua de iomeprol a 1 mL/h por 1 h38. Badea e col. compararam um protocolo semelhante de Cine-CT cardíaco baseado em uma infusão de 1 h de Isovue 370 (iopamidol) com uma injeção em bolus de 0,5 mL/25 g de peso corporal de Fenestra VC (emulsão lipídica óleo-em-água), encontrando melhores resultados em termos de contraste de imagem no segundo caso39. O mesmo fabricante do meio de contraste Fenestra VC relatou um volume recomendado de injeção de 0,4 mL/20 g de peso corporal para imagens vasculares com micro-TC40. No entanto, novas CAs com maior densidade, como eXIA 160 XL, MVivo Au, Aurovist 15 nm ou Exitron nano 12000, entraram recentemente no mercado pré-clínico e têm o potencial de reduzir os volumes de injeção em protocolos de micro-TC cardíaca. Nebuloni et al. realizaram uma extensa caracterização de tais ACs41. A dose de radiação na TC fechada é outra preocupação comum para estudos longitudinais; neste caso, a dose máxima para o protocolo Cine-CT descrito é inferior a 200 mGy para camundongos e ratos, conforme estimado com base na caracterização dosimétrica prévia de nosso tomógrafo42. Isso é aproximadamente 5x menor do que a dose relatada na literatura para tomografias cardíacas 4D38,39 e 30x menor do que a dose letal média para irradiação corporal total de pequenos animais, estimada em 6 Gy43.

Aplicabilidade do protocolo a diferentes instrumentações e softwares
Embora as instruções específicas apresentadas neste protocolo sejam inevitavelmente adaptadas para um tomógrafo PET/CT específico, as tarefas de imagem aqui apresentadas podem ser adaptadas a diferentes sistemas de imagem. Em relação à seção PET deste protocolo, todos os sistemas PET ou PET/CT de última geração projetados para pesquisa com pequenos animais têm requisitos de desempenho (em termos de resolução espacial e temporal) adequados para a realização do protocolo. No que diz respeito à TC cardíaca, o protocolo pode mudar dependendo do sistema de bloqueio cardiorrespiratório específico empregado (por exemplo, extrínseco ou intrínseco). Os leitores podem consultar artigos de revisão recentes e capítulos de livros para uma discussão completa das capacidades atuais dos sistemas PET, CT ou PET/CT44,45,46. Destaca-se que os protocolos de TC e PET apresentados neste trabalho podem ser realizados de forma independente, com base nas capacidades e peculiaridades da instrumentação tomográfica em uso. Acreditamos, portanto, que os procedimentos apresentados podem fornecer uma referência útil para qualquer profissional interessado em realizar, pela primeira vez, um estudo PET/CT cardíaco em pequenos animais.

Qualquer usuário com habilidades suficientes na configuração geral do protocolo de seu próprio tomógrafo PET/CT deve ser capaz de implementar as adaptações necessárias no método apresentado para obter resultados equivalentes em seu laboratório. Os mesmos argumentos podem ser usados para a seção dedicada à análise de imagens. Uma lista completa de todos os pacotes de software disponíveis para PET cardíaco e análise de TC cardíaca está fora do propósito deste artigo. No entanto, muitos outros pacotes de software comparáveis usam uma metodologia semelhante para geração de mapas polares e análise cinética de traçadores regionais. O leitor pode consultar Wang et al.47 e referências para a tarefa de quantificação de PET e para artigos de pesquisa pertinentes 48,49,50 para quantificação de TC 4D. Neste caso, optou-se por focar este protocolo em Carimas 51,52,53,54 e OsiriX55,56,57,58 para a análise quantitativa de imagens cardíacas de PET e TC, respectivamente. Devido ao uso generalizado dessas ferramentas, acreditamos que essa escolha poderia ser útil para aumentar o interesse da comunidade de pesquisa na implementação e aplicação dos métodos apresentados, em comparação com uma discussão focada em ferramentas de análise fechadas, comerciais e específicas para scanners fornecidas por alguns fabricantes de scanners PET e CT.

Modificações no protocolo quantitativo de análise de imagens
Os resultados de exemplo mostrados aqui são apenas um resultado simples de uma tarefa de análise quantitativa direta, que pode ser considerada suficiente para a maioria dos propósitos práticos em experimentos de pesquisa cardiovascular translacional focados em pequenos modelos animais de lesão cardíaca. No entanto, muitas outras opções de análise são possíveis, a partir das imagens DICOM resultantes do protocolo de aquisição/reconstrução descrito neste artigo. Por exemplo, pode-se estar interessado em aplicar diferentes modelos compartimentais em vez da análise gráfica de Patlak a partir de dados dinâmicos [18F]FDG-PET 59,60,61. Além disso, a análise da função cardíaca com base nas imagens 4D Cine-CT mostradas neste protocolo foi global apenas para todo o VE, mas vários softwares diferentes (principalmente comerciais) permitem que os usuários realizem análise de deformação e movimento regional da parede, espessamento da parede e análise regional da FE a partir das mesmas imagens49. No entanto, acreditamos que os exemplos aqui apresentados representam um bom ponto de partida para tarefas pós-processamento e quantitativas mais aprofundadas.

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Disclosures

Daniele Panetta recebeu subsídios para a P&D de instrumentação micro-CT da Inviscan Sas.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Projeto JPI-HDHL-INTIMIC "GUTMOM": Obesidade materna e disfunção cognitiva na prole: Papel de causa-efeito do GUT MicrobiOMe e prevenção dietética precoce (projeto no. INTIMIC-085, Ministério da Educação, Universidade e Decreto de Pesquisa da Itália nº 946/2019).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% sterile saline Fresenius Kabi 0.9% sodium chloride for injection
1025L Physiological Monitoring Small Animal Instruments Physiological monitoring system for small animal imaging
5 mL syringes Artsana Syringes with needle for injection of PET tracer
Atomlab 500 Else Nuclear PET Dose calibrator
Atrium software Inviscan Version 1.5.5 PET/CT operating software
Butterfly catheters Delta Med 27.5 G needle
Carimas software Turku PET Center Version 2.10 Image analysis software
Fenestra VC Medilumine Lipid emulsion iodinated contrast agent for small animals
Heat lamp Heat lamp with clamp and switch
Insulin syringes Artsana Syringes with needle for injection of CT CA
Iomeron 400 mgI/mL Bracco Iomeprol, vascular contrast agent
IRIS PET/CT Inviscan PET/CT scanner for small animals
Isoflurane Zoetis Inhalation anesthetic, 250 mL
OneTouch Glucometer Johnson&Johnson Medical Glucose meter kit
Osirix MD software Pixmeo Version 11 Image analysis software
Oxygen Air liquide Compressed gas
Rectal probe for 1025L Small Animal Instruments Rectal probe with cable for SAII 1025L systems
Respiratory sensor for 1025L Small Animal Instruments Respiratory pillow with tubings for SAII 1025L systems
TJ-3A syringe pump Longer Motorized syringe pump for CT CA injection

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References

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Medicina Edição 190
Tomografia por Emissão de Pósitrons Cardíacos de Alta Resolução/Tomografia Computadorizada para Animais de Pequeno Porte
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Panetta, D., Guzzardi, M. A., La… More

Panetta, D., Guzzardi, M. A., La Rosa, F., Granziera, F., Terlizzi, D., Kusmic, C., Iozzo, P. High-Resolution Cardiac Positron Emission Tomography/Computed Tomography for Small Animals. J. Vis. Exp. (190), e64066, doi:10.3791/64066 (2022).

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