Virale transgene expressie in knaagdierharten en de beoordeling van het risico op hartritmestoornissen
Summary
Het huidige protocol beschrijft methoden voor transgene expressie in ratten- en muizenharten door directe intramyocardiale injectie van het virus onder echocardiografiebegeleiding. Methoden voor de beoordeling van de gevoeligheid van harten voor ventriculaire aritmieën door de geprogrammeerde elektrische stimulatie van geïsoleerde, langendorff-doordrenkte harten worden hier ook uitgelegd.
Abstract
Hartziekten zijn wereldwijd de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. Vanwege het gebruiksgemak en de overvloed aan transgene stammen, zijn knaagdieren essentiële modellen geworden voor cardiovasculair onderzoek. Spontane dodelijke hartritmestoornissen die vaak sterfte veroorzaken bij patiënten met hartaandoeningen zijn echter zeldzaam in knaagdiermodellen van hartaandoeningen. Dit is voornamelijk te wijten aan de soortverschillen in cardiale elektrische eigenschappen tussen mens en knaagdier en vormt een uitdaging voor de studie van hartritmestoornissen met behulp van knaagdieren. Dit protocol beschrijft een aanpak om efficiënte transgene expressie mogelijk te maken bij muis- en rattenventrikelmyocardium met behulp van echocardiografiegeleide intramusculaire injecties van recombinant virus (adenovirus en adeno-geassocieerd virus). Dit werk schetst ook een methode om een betrouwbare beoordeling van de cardiale gevoeligheid voor aritmieën mogelijk te maken met behulp van geïsoleerde, Langendorff-doordrenkte muizen- en rattenharten met zowel adrenerge als geprogrammeerde elektrische stimulaties. Deze technieken zijn van cruciaal belang voor het bestuderen van hartritmestoornissen geassocieerd met nadelige hartremodellering na verwondingen, zoals een hartinfarct.
Introduction
Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak en eisten alleen al in 2017 het leven van 18 miljoen mensen1. Knaagdieren, vooral muizen en ratten, zijn het meest gebruikte model geworden in cardiovasculair onderzoek vanwege het gebruiksgemak en de beschikbaarheid van verschillende transgene overexpressie- of knock-outlijnen. Knaagdiermodellen zijn van fundamenteel belang geweest voor het begrijpen van de ziektemechanismen en voor het identificeren van potentiële nieuwe therapeutische doelen bij myocardinfarct2, hypertensie3, hartfalen4 en atherosclerose5. Het gebruik van knaagdieren in studies van hartritmestoornissen wordt echter beperkt door hun kleine hartomvang en snellere hartslag in vergelijking met menselijke of grote diermodellen. Daarom zijn spontane dodelijke aritmieën bij muizen of ratten na een hartinfarct zeldzaam2. Onderzoekers worden gedwongen zich te concentreren op indirecte secundaire veranderingen die een pro-aritmisch substraat kunnen weerspiegelen, zoals fibrose of genexpressie, zonder betekenisvolle veranderingen in aritmielast of pro-aritmische neigingen te vertonen. Om deze beperking te overwinnen, wordt in dit protocol een methode beschreven die een betrouwbare beoordeling mogelijk maakt van de gevoeligheid van muizen- en rattenharten voor ventriculaire tachyaritmieën na genetische modificatie 6,7 of myocardinfarct2. Deze methode combineert adrenerge receptorstimulatie met geprogrammeerde elektrische stimulatie om ventriculaire tachyaritmieën te induceren in geïsoleerde, langendorff-doordrenkte8 muizen- en rattenharten.
Standaardbenaderingen voor virale genoverdracht in myocardineweefsel van knaagdieren omvatten vaak de blootstelling van het hart door thoracotomie 9,10,11, wat een invasieve procedure is en geassocieerd is met vertraagd herstel van de dieren na de procedure. Dit artikel beschrijft een methode van directe intramyocardiale injectie van het virus onder begeleiding van echografie beeldvorming voor de overexpressie van transgenen. Deze minder invasieve procedure zorgt voor een sneller herstel van het dier na virale injectie en minder weefselletsel, in vergelijking met thoracotomie, vermindert postoperatieve pijn en ontsteking bij het dier en maakt dus een betere beoordeling van de effecten van transgene genen op de hartfunctie mogelijk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende stappen zijn van cruciaal belang voor het succes van de langendorff-doordrenkte, geïsoleerde hartpreparaat. Ten eerste is het belangrijk om schade aan het hart tijdens het verzamelen van het hart te voorkomen (bijvoorbeeld als gevolg van per ongeluk knijpen of knippen met de schaar). Ten tweede is het van cruciaal belang om het verzamelde hart zo snel mogelijk in koude Tyrode-oplossing te plaatsen, omdat dit de hartslag zal stoppen en het zuurstofverbruik van het hart zal verminderen. Ten derde mag het inb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Project Grants (PJT-148918 en PJT-180533, aan WL), de CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, aan WL), de Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) McDonald Scholarship en New Investigator Award (S-17-LI-0866, aan WL), Student Scholarships (aan JW en YX), en een Postdoctoral Fellowship (aan AL) van de University of Ottawa Cardiac Endowment Funds aan het Heart Institute. De auteurs bedanken de heer Richard Seymour voor zijn technische ondersteuning. Figuur 2 is gemaakt met Biorender.com met goedgekeurde licenties.
Materials
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
- Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
- Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
- Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
- Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
- Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
- Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
- Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
- Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
- Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
- Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
- Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
- Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
- Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
- Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
- Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
- Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
- McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
- Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
- Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).
