Summary
Modelos de transplante cardíaco de camundongos representam valiosas ferramentas de pesquisa para o estudo da imunologia do transplante. O presente protocolo detalha o transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongos que envolve a colocação de manguitos na artéria carótida comum do receptor e no tronco da artéria pulmonar do doador para permitir o fluxo sanguíneo laminar.
Abstract
Modelos murinos de transplante cardíaco são frequentemente utilizados para estudar a lesão de isquemia-reperfusão, as respostas imunes inatas e adaptativas após o transplante e o impacto das terapias imunomoduladoras na rejeição do enxerto. O transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos foi descrito pela primeira vez em 1991 usando anastomoses suturadas e posteriormente modificado para incluir técnicas de manguito. Essa modificação permitiu melhores taxas de sucesso e, desde então, houve vários relatórios que propuseram melhorias técnicas adicionais. No entanto, a tradução para uma utilização mais difundida permanece limitada devido à dificuldade técnica associada às anastomoses do enxerto, que requer precisão para alcançar o comprimento e o calibre adequados dos manguitos para evitar torção anastomótica vascular ou tensão excessiva, o que pode resultar em danos ao enxerto. O presente protocolo descreve uma técnica modificada para a realização de transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos que envolve a colocação do manguito na artéria carótida comum do receptor e na artéria pulmonar do doador em alinhamento com a direção do fluxo sanguíneo.
Introduction
Abbott et al. publicaram1 a primeira descrição do transplante cardíaco abdominal heterotópico em ratos em 1964. Essas técnicas cirúrgicas foram refinadas e simplificadas por Ono et al., em 19692. Corry et al. descreveram pela primeira vez um método para transplante cardíaco abdominal heterotópico em camundongos em 1973; semelhante aos modelos de ratos relatados anteriormente, envolveu enxerto no abdome do hospedeiro com revascularização por anastomoses end-to-side da artéria pulmonar do doador e aorta ascendente para a veia cava inferior e aorta abdominal do receptor, respectivamente3. O transplante cardíaco cervical heterotópico em ratos foi descrito por Heron em 1971 com manguitos de Teflon feitos de cateteres intravenosos de 16 G (1,6 mm de diâmetro externo)4. Chen5 e Matsuura et al.6 relataram posteriormente transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos em 1991, cujas técnicas diferiam principalmente em seu método de re-anastomose. A abordagem de Chen envolveu anastomoses suturadas da aorta ascendente do doador para a artéria carótida do receptor e da artéria pulmonar do doador para a veia jugular externa do receptor5. Devido à habilidade técnica avançada necessária para essas anastomoses microcirúrgicas suturadas, uma quantidade significativa de tempo e experiência foi necessária para alcançar uma alta taxa de sucesso. Matsuura et al. descreveram um método utilizando uma técnica de manguito sem sutura, semelhante à utilizada por Heron, que envolveu anastomoses de ponta a ponta utilizando a colocação extraluminal de manguitos. Confeccionou manguitos de Teflon a partir de cateteres intravenosos de 22 G (0,8 mm de diâmetro externo) e 24 G (0,67 mm de diâmetro externo) e colocou-os sobre a veia jugular externa e a artéria carótida comum do receptor, respectivamente6. Esses manguitos foram então colocados dentro da artéria pulmonar e da aorta do doador e fixados amarrando uma ligadura de sutura ao redor da conexão. Esta abordagem traduziu-se numa melhor taxa de sucesso. Mais importante ainda, resultou em um encurtamento do tempo necessário para completar ambas as anastomoses cervicais, reduzindo assim o tempo isquêmico quente do enxerto para menos de um terço do que utiliza o método de sutura abdominal. Além disso, como os manguitos são colocados ao redor da superfície externa do vaso, não há corpo estranho exposto à luz do vaso, o que reduz em grande parte a possibilidade de trombose após a cirurgia7. Enquanto isso, a utilização da técnica do manguito fornece suporte ao redor dos vasos no local da anastomose sem a necessidade de sutura, o que reduz o risco de sangramento após a revascularização6.
Numerosas revisões desta técnica foram propostas. Para acomodar o curto comprimento da artéria carótida comum do camundongo (aproximadamente 5 mm), Tomita et al.8 desenvolveram uma modificação dessa técnica com um manguito arterial menor (0,6 mm de diâmetro externo), omitindo suturas de retenção e puxando a artéria diretamente através do manguito com pinça fina. Wang et al. simplificaram ainda mais essa abordagem, colocando manguitos 22 G e 24 G na artéria pulmonar direita do doador e na artéria carótida comum direita do receptor, respectivamente9. Vários relatos descreveram modificações nessas abordagens, incluindo o uso de manguitos especializados, grampos microcirúrgicos, dilatadores de vasos e cardioplegia10,11,12. Notavelmente, todos esses métodos envolvem a circulação retrógrada do sangue através do coração, com o sangue fluindo da artéria carótida comum receptora para a aorta doadora, as artérias coronárias, o seio coronário, esvaziando então para o átrio direito e saindo da artéria pulmonar para a veia jugular externa receptora.
Em comparação com o enxerto no abdômen, o transplante cardíaco cervical oferece múltiplas vantagens. Como mencionado anteriormente, a exposição cervical permite uma revascularização mais rápida e tempos isquêmicos quentes mais curtos6. O método cervical também é menos invasivo e está associado a menores tempos de recuperação pós-operatória, pois evita uma laparotomia6. É importante ressaltar que anastomoses de ponta a ponta com manguitos podem ser realizadas em vez de anastomoses de ponta a ponta, o que diminui o risco de complicações como sangramento anastomótico. A abordagem abdominal também representa um risco aumentado de desenvolver complicações trombóticas na aorta abdominal ou veia cava inferior, levando a isquemia da medula espinhal e paralisia dos membros posteriores. A localização cervical superficial do transplante permite fácil acesso à avaliação da viabilidade do enxerto por palpação, eletrocardiografia e imagens invasivas ou não invasivas. Embora os enxertos cervicais retomem a atividade cardíaca espontânea após a reperfusão, eles não afetam significativamente os parâmetros sistólicos e diastólicos do receptor. Este modelo fornece informações valiosas para o estudo das respostas celulares após o transplante, como lesão de isquemia-reperfusão e rejeição do enxerto. Além disso, este modelo oferece uma abordagem ideal para permitir imagens pós-transplante, como microscopia intravital de dois fótons ou tomografia por emissão de pósitrons (PET). Para tanto, nosso laboratório já relatou métodos de imagem de tecidos e órgãos em movimento em camundongos, incluindo batimento de corações murinos e enxertos de arco aórtico após transplante cervical heterotópico para visualizar o tráfico de leucócitos durante lesão de isquemia-reperfusão e dentro de placas ateroscleróticas, respectivamente13,14,15 . Além disso, devido à sua localização superficial e facilidade de exposição, esse modelo é adequado para o retransplante cardíaco16.
Este relato descreve uma técnica que permite o fluxo sanguíneo laminar com a colocação externa dos manguitos vasculares nos vasos de onde se origina o fluxo sanguíneo. Isso permite uma transição suave do fluxo sanguíneo de um vaso para o outro, evitando a exposição da borda do vaso distal no lúmen vascular. Além disso, a técnica utiliza um manguito maior de 20 G, em vez de manguitos de 22 G usados anteriormente, para a artéria pulmonar doadora para garantir amplo retorno do fluxo sanguíneo para o receptor.
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Protocol
Todos os procedimentos de manuseio de animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do NIH Care and Use of Laboratory Animals e aprovados pelo Comitê de Estudos Animais da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Corações de camundongos C57BL/6 (B6) e BALB/c (pesando 20-25 g) foram transplantados para receptores B6 pareados por sexo (6-8 semanas de idade). Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Transplantes singênicos foram realizados para avaliar as respostas celulares relacionadas à lesão de isquemia-reperfusão, e transplantes alogênicos foram realizados para investigar os mecanismos imunológicos envolvidos na tolerância e rejeição do enxerto. Camundongos repórteres de proteína fluorescente verde M-verde B6 lisozima (LysM-GFP)17, originalmente obtidos de Klaus Ley do Instituto La Jolla de Alergia e Imunologia, La Jolla, CA, e posteriormente criados em nossas instalações, foram usados como receptores para experimentos selecionados para visualizar a infiltração de neutrófilos em enxertos cardíacos. A cirurgia de sobrevida foi realizada por meio de procedimentos assépticos.
1. Procedimento do doador
- Anestesiar os ratinhos injetando cetamina (80−100 mg/kg) e xilazina (8−10 mg/kg) (ver Tabela de Materiais) por via intraperitoneal no rato dador. Confirme o plano cirúrgico da anestesia com pinça do dedo do pé e da cauda.
- Prepare a área cirúrgica raspando o cabelo do peito e do abdômen usando uma navalha elétrica.
- Administrar 100 unidades de heparina (ver Tabela de Materiais) por via intravenosa na veia peniana (machos) ou veia jugular externa (machos ou fêmeas).
- Coloque os ratos em decúbito dorsal com os membros dianteiros por cima. Fixar os membros anteriores e posteriores com fita cirúrgica e desinfetar a pele com três esfoliantes alternados de iodo a 0,75% e etanol a 70%.
- Realizar uma incisão, laparoesternotomia mediana, do umbigo ao ângulo esternal (3-4 cm), seguida de toracotomia bilateral ao longo de cada margem costal (2 cm bilateralmente). Dobre a parede torácica anterior sobre o pescoço para exposição total do mediastino.
- Extirpar o timo e expor a veia cava inferior intratorácica.
- Transecto através da largura da aorta abdominal para exsanguinação.
- Para perfusão retrógrada, injetar 1,5 mL de solução salina 4 °C na veia cava inferior intratorácica com a agulha orientada superiormente em direção ao enxerto, conforme descrito anteriormente13.
- Ligue a veia cava superior usando um 8-0 sutura de seda e dividir distalmente.
- Repetir a perfusão retrógrada injetando mais 1,5 mL de solução salina 4 °C através da veia cava inferior.
- Ligue a veia cava inferior usando um 8-0 sutura de seda e dividir distalmente.
- Dissecar o arco aórtico e o tronco da artéria pulmonar para a retirada do enxerto e transecto ambos distalmente. Ligue as veias pulmonares na superfície posterior do coração usando uma sutura de seda 6-0 e divida distalmente.
- Realize a preparação do enxerto removendo o coração do doador da cavidade torácica. Colocar o coração excisado num recipiente de plástico cheio de solução salina heparinizada a 4 °C durante 1-2 min. Transferir o enxerto para um frasco plástico estéril cheio de gelo para colocação do manguito (Figura 1A).
NOTA: O enxerto cardíaco precisa permanecer no frasco por aproximadamente 5 minutos para colocar o manguito da artéria pulmonar do doador. - Coloque um manguito angiocateter 20 G de 1 mm de comprimento (ver Tabela de Materiais) sobre a artéria pulmonar para o manguito do doador. Usando pinça fina, dobre suavemente as bordas da artéria de volta sobre o manguito. Prenda o vaso dobrado ao manguito com uma gravata de nylon 10-0, conforme descrito anteriormente18 (Figura 1B,C).
- Conservar o coração do dador em solução salina heparinizada ou noutra solução de conservação a 4 °C.
NOTA: Embora alguns possam preferir soluções de preservação específicas (por exemplo, a solução da Universidade de Wisconsin) para preservação isquêmica prolongada, pode ser caro19. A solução salina pode ser uma alternativa adequada para curtos períodos de isquemia (<1 h)20. Em última análise, a escolha da solução de preservação depende do desenho experimental21.
2. Procedimento do destinatário
- Injete cetamina (80−100 mg/kg) e xilazina (8−10 mg/kg) por via intraperitoneal no rato receptor para anestesia. Injete buprenorfina de liberação sustentada (0,5-1,0 mg/kg) por via subcutânea para analgesia. Confirme o plano cirúrgico da anestesia com pinça do dedo do pé e da cauda.
- Prepare a área cirúrgica raspando o cabelo da área cervical usando uma navalha elétrica. Aplique pomada oftálmica estéril e não medicamentosa nos olhos para evitar o ressecamento da córnea.
- Coloque o animal em decúbito dorsal com os membros anteriores adjacentes ao corpo e a cabeça ligeiramente virada para a esquerda. Prenda os membros anteriores e posteriores com fita cirúrgica. Desinfete a pele com três esfoliantes alternados de iodo a 0,75% e etanol a 70%.
- Faça uma incisão cervical na linha média da mandíbula inferior até o esterno.
- Transect o músculo esternocleidomastóideo direito. Excise o lobo direito da glândula submandibular para criar espaço para o implante do enxerto.
- Amarre um nó escorregadio sobre a veia jugular externa proximal usando uma sutura de seda 6-0. Ligue a veia jugular externa distal e os ramos adjacentes usando um 8-0 sutura de seda. Faça uma incisão transversal através da parede anterior da veia jugular externa.
- Colocar uma sutura de nylon 10-0 através da borda da veia jugular externa proximal e do tecido subjacente para fixar a veia durante a inserção do manguito (Figura 1D).
- Lige a artéria carótida comum direita distal usando um 8-0 sutura de seda logo inferior à bifurcação carotídea. Amarre um nó escorregadio sobre a artéria carótida comum proximal usando uma sutura de seda 6-0. Transectar a artéria distalmente entre as suturas.
- Semelhante ao manguito do doador, coloque um manguito angiocateter 24 G de 0,6 mm de comprimento sobre a artéria carótida comum direita do receptor. Usando pinça fina, dobre suavemente as bordas da artéria de volta sobre o manguito. Prenda o recipiente dobrado ao manguito usando uma gravata de nylon 10-0.
- Coloque o coração do doador superior à área cervical direita.
- Goteje solução salina fria no enxerto cardíaco a cada poucos minutos durante a implantação.
- Colocar uma sutura de nylon 10-0 através da borda da aorta doadora e através de uma mordida superficial do tecido subjacente para fixar o enxerto no lugar (Figura 1E).
- Lavar a aorta do doador com 0,5 mL de solução salina heparinizada a 0,9%.
- Insira o manguito comum da artéria carótida do receptor na aorta do doador. Proteja a anastomose com um 8-0 gravata de seda (Figura 1F). Remova a sutura da âncora aórtica.
- Desaire a veia jugular externa lavando a veia jugular externa do receptor com 0,5 mL de solução salina heparinizada a 0,9%.
- Realizar anastomose da artéria pulmonar inserindo o manguito da artéria pulmonar doadora na veia jugular externa do receptor e segurar com um 8-0 gravata de seda (Figura 1G). Remova a sutura da âncora da veia jugular externa e transecte a parede posterior restante da veia jugular externa para liberar o enxerto do tecido subjacente. Certifique-se de que o enxerto esteja devidamente orientado sem torção ou torção das anastomoses.
- Solte os nós escorregadios na veia jugular externa do receptor seguido da artéria carótida comum para iniciar a reperfusão do enxerto cardíaco (Figura 1H).
- Feche a incisão da pele cervical usando uma sutura de nylon 6-0 interrompida.
3. Cuidados pós-operatórios
- Coloque o receptor em uma câmara de recuperação quente imediatamente após a cirurgia e monitore de perto até que esteja totalmente recuperado da anestesia (aproximadamente 1 h).
- Continue a monitorar de perto o animal (a cada 6-8 h) por pelo menos 72 h após a cirurgia para sinais de comportamento anormal, como letargia, tremores, respiração rápida ou anorexia.
- Para o controle da dor, injete carprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea a cada 8-12 h para analgesia, além de buprenorfina subcutânea (0,05 mg/kg) a cada 8-12 h por 24-48 h a partir do final da cirurgia.
4. Imagem intravital de dois fótons do tráfico de leucócitos no enxerto cardíaco
- Injetar cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (8-10 mg/kg) por via intraperitoneal em um camundongo receptor de B6 LysM-GFP17 2 h após reperfusão do enxerto para anestesia.
- Realizar a intubação orotraqueal com angiocateter 20 G, conforme descrito anteriormente18.
- Conecte o angiocateter à tubulação de um ventilador mecânico de camundongo e ventile com ar ambiente a uma taxa de 120 respirações/min e um volume corrente de 0,5 mL18.
- Injete 12 μL de pontos quânticos não direcionados de 655 nm (ver Tabela de Materiais), suspensos em 50 μL de PBS por via intravenosa, conforme descrito anteriormente13.
- Reabra a incisão do pescoço para expor o enxerto cardíaco. Coloque o rato numa câmara de estabilização.
- Prenda uma parte da parede livre do ventrículo esquerdo usando um anel fino de adesivo de tecido (ver Tabela de Materiais), aplicado a uma tampa de vidro presa à placa da câmara superior.
- Colocar a câmara sob a objetiva do microscópio de dois fótons para aquisição de imagens e vídeos, conforme descrito anteriormente13.
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Representative Results
Este modelo de transplante cardíaco heterotópico cervical de camundongos tem sido utilizado para realizar mais de 1.000 transplantes em nosso laboratório, com uma taxa de sobrevida de aproximadamente 97%. A taxa de sucesso é ligeiramente maior do que relatos anteriores utilizando outras técnicas de transplante cardíaco heterotópico cervical em camundongos10,11,20. Isso poderia ser atribuído ao manguito maior de 20 G colocado na artéria pulmonar do doador para garantir amplo retorno do fluxo sanguíneo para o receptor (Figura 1B,C). Além disso, o alinhamento do fluxo sanguíneo com a colocação do manguito na presente técnica minimiza o risco de trombose e turbulência anastomótica (Figura 1,2). Embora a ressonância magnética (RM) ou a ultrassonografia pudessem avaliar a turbulência da perfusão do enxerto 22,23, ainda não utilizamos essas técnicas nos experimentos. A morte intraoperatória usando esta técnica é rara para microcirurgiões experientes. A mortalidade pós-operatória é mais frequentemente devido a complicações hemorrágicas. O tempo médio de operação do receptor foi de 36,5 ± 3,5 min, com tempo médio de isquemia fria de 20 min. Para os estudos de sobrevida, os enxertos cardíacos foram avaliados diariamente por visualização direta e palpação digital dos batimentos cardíacos. Os ratos são tipicamente sacrificados para avaliação do enxerto em torno de 7-14 dias de pós-operatório. A imagem intravital de dois fótons é um procedimento terminal geralmente realizado precocemente após o transplante para avaliar o tráfico de leucócitos (Figura 3).
A maioria dos transplantes singênicos manteve fortes batimentos cardíacos até o sacrifício, até 6 meses após o transplante. Na inspeção macroscópica, a maioria dos enxertos singênicos parecia normal e o exame histológico não revelou evidências de rejeição. Todos os transplantes alogênicos não imunossuprimidos (BALB/c em B6) desenvolveram uma diminuição dos batimentos cardíacos dentro de 1-2 semanas após o enxerto. Os enxertos alogênicos excisados desses camundongos estavam grosseiramente dilatados e o exame histológico mostrou infiltração difusa de linfócitos e áreas de necrose miocárdica.
Figura 1: Preparação do enxerto cardíaco para transplante . (A) O coração é extirpado do rato dador. (B,C) O tronco da artéria pulmonar é exposto e puxado através de um manguito de 20 G, dobrado para trás e fixado com uma sutura de nylon 10-0. (D) Uma sutura de nylon 10-0 é colocada através da borda da veia jugular externa do receptor e fixada ao tecido subjacente. (E) Uma sutura de nylon 10-0 é colocada através da borda da aorta doadora e presa ao tecido subjacente adjacente à artéria carótida receptora. (F) O manguito comum da artéria carótida do receptor é inserido na aorta do doador e fixado com um 8-0 sutura de seda. (G) O manguito da artéria pulmonar do doador é inserido na veia jugular externa do receptor e fixado com um 8-0 sutura de seda. (H) O nó deslizante proximal na veia jugular externa do receptor é liberado, seguido pela liberação do nó deslizante da artéria carótida comum. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão intraoperatória do enxerto cardíaco. Um manguito de 1 mm 20 G é puxado sobre a artéria pulmonar do doador e fixado com uma gravata de nylon 10-0. Um manguito de 0,6 mm 24 G é puxado sobre a artéria carótida comum direita do receptor e fixado com uma gravata de nylon 10-0. As suturas de âncora (10-0 nylon) são colocadas na parede da aorta doadora e na veia jugular externa direita do receptor e presas ao tecido subjacente para evitar o movimento durante a inserção do manguito. (AO = aorta, PA = artéria pulmonar, CCA = artéria carótida comum, EJV = veia jugular externa). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem intravital de dois fótons da dinâmica leucocitária no enxerto cardíaco. A imagem intravital de dois fótons de coração batendo transplantado de camundongo B6 para receptor de B6 LysM-GFP demonstra tráfico de neutrófilos receptores para os tecidos do enxerto cardíaco entre 2-3 h de pós-operatório. (Verde = neutrófilos, vermelho = vasos marcados com pontos quânticos). Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Complicação | Possíveis causas | Soluções |
| Morte do destinatário | Hipotermia | Almofada de aquecimento |
| Desidratação | 0,9% de soro fisiológico i.p. no pós-operatório | |
| Má perfusão do enxerto | Torção da artéria carótida | Re-anastomose, ou |
| Trombo ou êmbolos aéreos | Anastomose arterial aberta e rubor com solução salina heparinizada | |
| Obstrução venosa | Trombo ou êmbolos aéreos | Re-anastomose, ou |
| Anastomose venosa aberta e lavagem com solução salina heparinizada | ||
| Sangramento pós-operatório | Sangramento dos ramos da veia jugular | Ramos da veia jugular da liga |
| Compressão de cotonete | ||
| Punhos soltos | Aperte os punhos | |
| Batimento cardíaco fraco | Enxerto cardíaco frio | Goteje solução salina quente na superfície do coração |
| Torção do enxerto | Posição inadequada do enxerto | Certifique-se de que o enxerto esteja devidamente orientado antes do fechamento da pele |
| Atividade errática (por exemplo, correr em círculos) | Isquemia cerebral | Artéria carótida comum ligata inferior à bifurcação carotídea |
Tabela 1: Solução de problemas para complicações. Complicações comumente encontradas com soluções.
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Discussion
Utilizando esta técnica, o transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongo pode ser realizado em menos de 40 minutos por um microcirurgião experiente e em aproximadamente 60 minutos por um microcirurgião de nível básico. Embora o transplante cardíaco cervical tenha sido estudado em numerosos modelos animais, um modelo de camundongo continua sendo o padrão-ouro devido a múltiplas cepas genéticas bem definidas, capacidades de alteração genética e disponibilidade de numerosos reagentes, incluindo anticorpos monoclonais24. A técnica aqui descrita oferece uma oportunidade única para o monitoramento pós-transplante, como eletrocardiografia ou imagem intravital, incluindo microscopia de dois fótons (Figura 3) ou PET não invasiva seriada13,14,15,25. Este método fornece uma localização superficial para o enxerto cardíaco que é mais fácil de estabilizar para imagens intravitais, evitando assim a complexidade inerente ao método de transplante abdominal devido à localização mais profunda do enxerto e dos órgãos abdominais circundantes. Além disso, esta técnica é especialmente útil no contexto do retransplante. Os modelos de retransplante representam ferramentas poderosas para identificar células residentes em enxertos cardíacos transplantados que medeiam as respostas aloimunes. Embora já tenhamos utilizado essa técnica em um modelo de retransplante cardíaco de camundongo para avaliar resultados de curto prazo, essa abordagem pode ser expandida em experimentos futuros para explorar resultados de longo prazo16. Para tanto, as presentes investigações até o momento utilizaram um curto período de isquemia fria (aproximadamente 20 min). Estudos futuros poderiam investigar o efeito da isquemia prolongada a frio ou quente nos desfechos de curto e longo prazo para imitar mais de perto o transplante clínico.
Várias etapas críticas dessa técnica precisam ser consideradas. Métodos prévios envolvem a inserção do manguito na veia jugular externa menor no grande lúmen da artéria pulmonar doadora 6,8. A colocação do manguito maior na artéria pulmonar doadora para estabelecer uma orientação adequada com o fluxo sanguíneo torna um pouco mais difícil a inserção do manguito na veia jugular externa menor. Fixar a borda da veia ao tecido subjacente e incidir apenas parcialmente a parede anterior da veia facilita a inserção do manguito. Além disso, a colocação do manguito na artéria carótida comum do receptor pode ser bastante desafiadora devido ao pequeno calibre do vaso. Dessa forma, técnicas anteriores relataram a utilização de manguitos menores (por exemplo, 26 G) para essa anastomose12. No entanto, a abordagem atual utiliza um manguito 24 G maior para garantir a perfusão adequada do enxerto, o que acreditamos que possa oferecer alguns benefícios de sobrevivência. A seleção de camundongos receptores maiores pode ajudar microcirurgiões novatos. As suturas da âncora são removidas após a reperfusão, e o enxerto não é fixado em uma orientação adequada, como outros descreveram3. Assim, é importante verificar se o enxerto está bem posicionado e orientado antes do fechamento da pele cervical para evitar torção ou torção (Tabela 1). A excisão da glândula submandibular direita é realizada para fornecer espaço adequado para o enxerto cardíaco, evitando assim a compressão do enxerto após o fechamento da pele.
O modelo descrito aqui oferece várias vantagens. Ao colocar os manguitos no tronco da artéria pulmonar do doador e na artéria carótida comum do receptor, a orientação do manguito se alinha com a direção do fluxo sanguíneo. Isso diminui a probabilidade de fluxo turbulento e formação de trombos. Em segundo lugar, um manguito maior de artéria pulmonar de 20 G é utilizado para garantir amplo retorno do fluxo sanguíneo para o receptor. Em terceiro lugar, um manguito maior de 24 G é colocado na artéria carótida comum para garantir a perfusão adequada do enxerto. Por fim, suturas de âncora de nylon 10-0 são usadas para fixar o enxerto aos tecidos subjacentes e facilitar a inserção do manguito. Essas modificações ajudam a superar os desafios técnicos do procedimento, previnem a turbulência anastomótica e reduzem as complicações pós-operatórias, como a formação de trombos.
Uma limitação importante de todos os modelos de transplante cardíaco de camundongos é que o fluxo sanguíneo fisiológico não é restaurado através das câmaras do coração. Em vez disso, esses modelos dependem da circulação através dos vasos coronários. As consequências desse padrão de fluxo retrógrado na lesão celular e nas respostas imunes do enxerto não foram claramente delineadas; no entanto, é possível que as forças mecânicas de cisalhamento resultantes dessa circulação não fisiológica influenciem as respostas imunes. Um modelo cirúrgico de transplante cardíaco em camundongos que restaure o fluxo sanguíneo fisiológico ainda não foi desenvolvido e exigiria avanços técnicos substanciais. Observa-se que uma pequena proporção de camundongos (<3%) experimenta comportamento errático transitório (por exemplo, correndo em círculos) após o procedimento. Esse comportamento dura aproximadamente 1-2 h antes da resolução. Tendo em vista que esse comportamento não é observado após outros procedimentos utilizando o mesmo esquema anestésico, pode estar relacionado à isquemia cerebral transitória devido a alterações do fluxo sanguíneo após o transplante cardíaco cervical. A recuperação completa ocorreu em todos os camundongos sem quaisquer déficits crônicos observados.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A DK é apoiada pelos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, Veterans Administration Merit Review grant 1I01BX002730 e The Foundation for Barnes-Jewish Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 7718729 | |
| 0.75% Providone iosine scrub | Priority Care Inc | NDC 57319-327-0 | |
| 10-0 nylon suture | Surgical Specialties Corporation | AK-0106 | |
| 655-nm nontargeted Q-dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc | 111000140 | |
| 8-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 1005597 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools Inc | 91127-12 | |
| BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) | Jackson Laboratories | ||
| Bipolar coagulator | Valleylab Inc | SurgII-20, E6008/E6008B | |
| Carprofen (Rimadyl) injection | Transpharm | 35844 | |
| Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet | Transpharm | 38995/37919 | |
| Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software | A&B Software | ||
| Dumont no. 5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11251-20 | |
| Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15000-03 | |
| GraphPad Prism 5.0 | Sun Microsystems Inc. | ||
| Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc | 91201-13 | |
| Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc | 91309-12 | |
| Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 | Harvard Apparatus | MA1 55-0001 | |
| Heparin solution (100 U/mL) | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine (50 mg/kg) | Wyeth | 206205-01 | |
| Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification | Leica Microsystems | ||
| Moria extra fine spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15396-00 | |
| Ohio isoflurane vaporizer | Parkland Scientific | V3000i | |
| Qdots | ThermoFisher | 1604036 | |
| S&T SuperGrip Forceps angled tip | Fine Science Tools Inc | 00649-11 | |
| S&T SuperGrip Forceps straight tip | Fine Science Tools Inc | 00632-11 | |
| Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride | Hospira Inc | NDC 0409-4888-20 | |
| Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) | Puritan Medical Company LLC | 823-WC | |
| Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | SR-OX2032CA | |
| Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | R-OX2419CA | |
| ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) | Thermocare Inc | ||
| VetBond | Santa Cruz Biotechnology SC361931 | NC0846393 | |
| Xylazine (10 mg/kg) | Lloyd Laboratories | 139-236 |
References
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