Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

बायोफिजिकल गुणों और कार्यों का अध्ययन करने के लिए झिल्ली में सेप्टिन असेंबली का पुनर्गठन

Published: July 28, 2022 doi: 10.3791/64090
Automatic Translation
*1, *2, 1,3, 1,2,3
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill
* These authors contributed equally

Summary

साइटोस्केलेटन असेंबली को समझने के लिए सेल-मुक्त पुनर्गठन एक महत्वपूर्ण उपकरण रहा है, और पिछले दशक में काम ने न्यूनतम प्रणालियों में सेप्टिन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण स्थापित किए हैं। यहां प्रस्तुत विभिन्न झिल्ली संदर्भों में सेप्टिन असेंबली का निरीक्षण करने के लिए तीन पूरक तरीके हैं: प्लानर बाइलेयर, गोलाकार समर्थन और रॉड समर्थन करता है।

Abstract

अधिकांश कोशिकाएं मौलिक कोशिका प्रक्रियाओं को पूरा करने के लिए अपने आकार को समझ सकती हैं और बदल सकती हैं। कई यूकेरियोट्स में, सेप्टिन साइटोस्केलेटन साइटोकिनेसिस, ध्रुवीकृत विकास और प्रवास जैसे आकार परिवर्तनों के समन्वय में एक अभिन्न घटक है। सेप्टिन फिलामेंट बनाने वाले प्रोटीन हैं जो विविध उच्च-क्रम संरचनाओं को बनाने के लिए इकट्ठा होते हैं और, कई मामलों में, प्लाज्मा झिल्ली के विभिन्न क्षेत्रों में पाए जाते हैं, विशेष रूप से माइक्रोन-स्केल पॉजिटिव वक्रता के क्षेत्रों में। विवो में सेप्टिन असेंबली की प्रक्रिया की निगरानी कोशिकाओं में प्रकाश माइक्रोस्कोपी की सीमाओं के साथ-साथ झिल्ली और साइटोस्केलेटल तत्वों दोनों के साथ बातचीत की जटिलता से बाधित होती है, जिससे जीवित प्रणालियों में सेप्टिन गतिशीलता को निर्धारित करना मुश्किल हो जाता है। सौभाग्य से, उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्पों पर सेप्टिन असेंबली को नियंत्रित करने वाले तंत्र को विच्छेदित करने के लिए सेल-मुक्त प्रणाली में सेप्टिन साइटोस्केलेटन के पुनर्गठन में पिछले दशक में पर्याप्त प्रगति हुई है। सेप्टिन असेंबली के मुख्य चरणों में सेप्टिन हेटरोलिगोमर एसोसिएशन और झिल्ली के साथ पृथक्करण, फिलामेंट्स में पोलीमराइजेशन और फिलामेंट्स के बीच बातचीत के माध्यम से उच्च-क्रम संरचनाओं का गठन शामिल है। यहां, हम विभिन्न संदर्भों में सेप्टिन असेंबली का निरीक्षण करने के लिए तीन तरीके प्रस्तुत करते हैं: प्लानर बाइलेयर, गोलाकार समर्थन और रॉड समर्थन। इन विधियों का उपयोग असेंबली के विभिन्न चरणों में सेप्टिन के बायोफिजिकल मापदंडों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है: झिल्ली को बांधने वाले एकल ऑक्टेमर्स के रूप में, फिलामेंट्स के रूप में, और फिलामेंट्स की असेंबली के रूप में। हम वक्रता नमूनाकरण और अधिमान्य सोखना के माप के साथ जोड़े गए इन मापदंडों का उपयोग यह समझने के लिए करते हैं कि वक्रता संवेदन विभिन्न लंबाई और समय के तराजू पर कैसे संचालित होता है।

Introduction

कोशिकाओं के आकार और उनके कई आंतरिक डिब्बे लिपिड झिल्ली पर निर्भर हैं जो उन्हें घेरते हैं। झिल्ली विस्कोइलास्टिक संरचनाएं हैं जिन्हें प्रोटीन, लिपिड सॉर्टिंग और विभिन्न प्रकार के आकार 1,2,3,4 उत्पन्न करने के लिए आंतरिक और बाहरी बलों के साथ बातचीत के माध्यम से विकृत किया जा सकता है। इन आकृतियों को अक्सर झिल्ली वक्रता के संदर्भ में वर्णित किया जाता है। कोशिकाएं प्रोटीन के एक विविध सूट का उपयोग करती हैं जो अधिमानतः इकट्ठा करने में सक्षम होती हैं, या "संवेदन", विशेष झिल्ली वक्रता कोशिका तस्करी, साइटोकिनेसिस और माइग्रेशन 5,6 सहित प्रक्रियाओं पर परिभाषित स्थानिक-अस्थायी नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए। कोशिका स्वास्थ्य के साथ समय और स्थानिक संकल्प को संतुलित करने की कठिनाई के कारण झिल्ली पर सेल मशीनरी की गतिशीलता का निरीक्षण करना विशेष रूप से मुश्किल है। जबकि सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक ऐसी संरचनाओं का विस्तृत दृश्य प्रदान कर सकती है, उन्हें लंबे अधिग्रहण की आवश्यकता होती है जो अधिकांश मशीनरी के लिए असेंबली / इसके अतिरिक्त, उनके मूल वातावरण में इन विधानसभाओं की आणविक जटिलता और भूमिकाओं की भीड़ एक घटक खेल सकते हैं न्यूनतम पुनर्गठन प्रणालियों अणुओं की कार्यात्मक क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाते हैं।

कोशिका के बाहर झिल्ली गुणों और प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए न्यूनतम झिल्ली मिमेटिक्स विकसित किए गए हैं। झिल्ली मिमेटिक्स मुक्त खड़े लिपिड बाइलेयर, जैसे कि लिपोसोम या विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं से समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) 7,8,9,10 तक भिन्न होते हैं। एसएलबी बायोमिमेटिक झिल्ली हैं जो अंतर्निहित समर्थन के लिए लंगर डाले हुए हैं, आमतौर पर ग्लास, अभ्रक या सिलिका11,12 से बने होते हैं। विभिन्न प्रकार की ज्यामिति का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें समतल सतहों, गोले, छड़, और यहां तक कि अवतल और उत्तल वक्रता दोनों पर प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन की जांच करने के लिए लहरदार या माइक्रोपैटर्न सब्सट्रेट भी शामिल हैं1 3,14,15,16,17,18 . बाइलेयर गठन एक हाइड्रोफिलिक सतह पर पुटिका सोखना के साथ शुरू होता है, इसके बाद संलयन और टूटना एक निरंतर बाइलेयर (चित्रा 1) 19 बनाने के लिए होता है। समर्थित बाइलेयर विशेष रूप से प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए उत्तरदायी होते हैं, जो कोशिकाओं में अक्सर प्राप्त करने योग्य होने की तुलना में बेहतर समय और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन दोनों प्रदान करते हैं। घुमावदार एसएलबी विशेष रूप से महत्वपूर्ण झिल्ली विरूपण की अनुपस्थिति में प्रोटीन वक्रता संवेदनशीलता की जांच करने के लिए एक आकर्षक साधन प्रदान करते हैं, जिससे वक्रता संवेदन और वक्रता प्रेरण के बीच अंतर करने की अनुमति मिलती है, जो अक्सर मुक्त-खड़े प्रणालियों में अलग करना असंभव होता है।

सेप्टिन फिलामेंट बनाने वाले साइटोस्केलेटल प्रोटीन का एक वर्ग है जो सकारात्मक रूप से घुमावदार झिल्ली 6,18,20 पर इकट्ठा करने की उनकी क्षमता के लिए जाना जाता है। खमीर में सेल चक्र के दौरान, सेप्टिन एक अंगूठी में इकट्ठा होते हैं और क्रमशः कली उद्भव और साइटोकिनेसिस से जुड़े घंटे के चश्मे और डबल रिंग संरचनाओं को बनाने के लिए पुनर्व्यवस्थित करना चाहिए। जबकि प्लैटिनम प्रतिकृति इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अलग-अलग सेल चक्र चरणों22 पर सेप्टिन वास्तुकला का निरीक्षण करने के लिए सुंदर काम किया गया है, खमीर में प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके समय के साथ सेप्टिन असेंबली को देखना सीमित स्थानिक संकल्प के साथ मिला है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) द्वारा कल्पना की गई लिपिड मोनोलेयर का उपयोग करके सेप्टिन पर पिछला काम कई दिलचस्प सेप्टिन संरचनाओं जैसे कि छल्ले, बंडल और धुंध23 को पुनर्गठित करने में सक्षम था। हालांकि, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के विपरीत, ईएम तकनीकें अपने अस्थायी संकल्प में भी सीमित हैं। सेप्टिन असेंबली की बहु-पैमाने की प्रक्रिया के गतिज मापदंडों को बेहतर ढंग से हल करने के लिए, हम समर्थित झिल्ली मिमेटिक्स में बदल गए, जहां कोई झिल्ली ज्यामिति, नमूना स्थितियों और इमेजिंग मोडलिटी को सावधानीपूर्वक नियंत्रित कर सकता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्लानर या घुमावदार एसएलबी, शुद्ध प्रोटीन और माइक्रोस्कोपी तकनीकों के संयोजन का उपयोग करते हैं। मात्रात्मक प्रतिदीप्ति कंफोकल माइक्रोस्कोपी और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (टीआईआरएफएम) का उपयोग विभिन्न झिल्ली वक्रताओं पर थोक प्रोटीन बाध्यकारी दोनों को मापने के साथ-साथ एकल अणुओं के बाध्यकारी कैनेटीक्स को मापने के लिए किया गया था। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को विभिन्न झिल्ली वक्रता पर प्रोटीन अल्ट्रास्ट्रक्चर की जांच करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) के साथ उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया गया है। जबकि इन प्रोटोकॉल का ध्यान सेप्टिन साइटोस्केलेटन पर है, प्रोटोकॉल को आसानी से किसी भी प्रोटीन की वक्रता संवेदनशीलता की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है जो पाठक को दिलचस्प लगता है। इसके अतिरिक्त, एंडोसाइटोसिस या वेसिकुलर ट्रैफिकिंग जैसे क्षेत्रों में काम करने वालों को इन तकनीकों को बहु-प्रोटीन परिसरों की वक्रता-निर्भर विधानसभाओं की जांच के लिए उपयोगी लग सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: समर्थित लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए मोनोडिस्प्रेस्ड छोटे यूनिलेमेलर पुटिकाओं (एसयूवी) की तैयारी की आवश्यकता होती है। कृपया एसयूवी गठन पर पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल24 देखें। संक्षेप में, सभी एसयूवी बर्फ के पानी में 2 मिनट आराम अवधि के बाद 4 मिनट सोनिकेशन अवधि के माध्यम से 70% आयाम पर कुल 12 मिनट के लिए जांच सोनिकेशन द्वारा गठित कर रहे हैं। एसयूवी समाधानों को अच्छी तरह से स्पष्ट किया जाना चाहिए और आकार में मोनोडिस्प्रेस्ड किया जाना चाहिए। एसयूवी के आकार वितरण को मापा जा सकता है, उदाहरण के लिए, गतिशील प्रकाश बिखरने25 द्वारा।

1. प्लानर लिपिड बाइलेयर

  1. स्लाइड्स की प्लाज्मा सफाई
    नोट: प्लाज्मा सफाई कार्बनिक दूषित पदार्थों को हटा देती है और ग्लास की हाइड्रोफिलिसिटी को बढ़ाती है, कुशल लिपिड सोखना सुनिश्चित करती है। उपयोग किए गए प्लाज्मा क्लीनर और ग्लास कवरलिप्स के आधार पर निम्नलिखित चरण बदल सकते हैं या अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    1. लाइनों और कक्ष से हवा को हटाने के लिए ऑक्सीजन के साथ 5 मिनट के लिए प्लाज्मा क्लीनर शुद्ध करें। यह सुनिश्चित करना है कि, जब प्लाज्मा क्लीनर चलाया जाता है, तो लाइनों और कक्ष में मुख्य रूप से ऑक्सीजन होता है, जो अधिक सुसंगत बाइलेयर तैयारी प्रदान करता है।
    2. शुद्ध करते समय, धूल और कणों को हटाने के लिए माइक्रो कवर ग्लास स्लाइड पर एन2 या एआर जैसी निष्क्रिय गैस को स्ट्रीम करें।
      वैकल्पिक: कवर ग्लास स्लाइड को पानी के बाद 100% आइसोप्रोपेनॉल के साथ प्रत्येक पक्ष को छिड़ककर धोया जा सकता है। आइसोप्रोपेनोल-वॉटर वॉश 3एक्स दोहराएं और फिर एन2 स्ट्रीम के साथ सूखें।
    3. एक सिरेमिक पालना में सूखे कवर ग्लास स्लाइड व्यवस्थित करें। प्लाज्मा कक्ष के पीछे पालना रखें ताकि कवरलिप्स कक्ष के लंबे किनारे के समानांतर हों (यह प्लाज्मा सफाई के दौरान उन्हें जगह में रखता है)। अधिकतम शक्ति पर ऑक्सीजन के साथ 15 मिनट के लिए प्लाज्मा क्लीनर चलाएं।
  2. चैंबर की तैयारी
    नोट: यहां वर्णित विधि प्रतिक्रिया मात्रा का समर्थन करने के लिए प्लास्टिक पीसीआर ट्यूबों से घर के बने कक्षों का उपयोग करती है, लेकिन अन्य कम आसंजन सामग्री, जैसे सिलिकॉन कुएं, भी उपयुक्त हो सकते हैं।
    1. एक रेजर ब्लेड या कैंची का उपयोग करके, 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब (चित्रा 2) के पाले सेओढ़ लिया हिस्सा के ठीक नीचे टोपी काट लें।
    2. ट्यूब के अंदर से परहेज करते हुए, यूवी-सक्रिय चिपकने वाला के साथ पीसीआर ट्यूब के रिम को पेंट करें। धीरे-धीरे पीसीआर ट्यूब गोंद-डाउन को प्लाज्मा-साफ कवरस्लिप के केंद्र में रखें।
      नोट: कक्ष के अंदर गोंद से बचने के लिए, सील प्राप्त करने के लिए गोंद की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करें, और कक्ष को टक्कर या परेशान किए बिना यूवी के साथ तुरंत इलाज करें।
    3. चिपकने वाला इलाज करने के लिए 5-7 मिनट के लिए लंबी तरंग दैर्ध्य यूवी प्रकाश के तहत कक्ष रखें।
  3. बिलियर गठन
    नोट: कुशल बाइलेयर गठन के लिए इस चरण में मोनोडिस्प्रेस्ड एसयूवी का उपयोग किया जाना चाहिए। तालिका 1 स्टॉक और अंतिम बफर सांद्रता सहित बाइलेयर गठन में उपयोग किए जाने वाले सभी बफर के लिए व्यंजनों प्रदान करता है।
    1. समर्थित लिपिड बाइलेयर बफर के 40 μL जोड़ें (एसएलबीबी: 300 एमएम केसीएल, 20 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.4, 1 एमएम एमजीसीएल2; तालिका 1), 5 एमएम एसयूवी के 10 μL, और कुएं के लिए 100 एमएम सीएसीएल2 का 1 μL। धीरे एसयूवी को बाधित करने के लिए पक्ष से कक्षों को हिलाएं, और फिर 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: वाष्पीकरण को सीमित करने के लिए, गीले पोंछे के साथ एक कवर पेट्री डिश में सेते हैं।
  4. अतिरिक्त लिपिड को धोना
    नोट:: यह चरण अतिरिक्त एसयूवी निकालता है और एक बफर एक्सचेंज चरण के रूप में कार्य करता है। धोने के दौरान पिपेट टिप के साथ बाइलेयर को परिमार्जन नहीं करना बहुत महत्वपूर्ण है; यदि ग्लास उजागर होता है, तो सेप्टिन और कई अन्य प्रोटीन अपरिवर्तनीय रूप से बंध जाएंगे, प्रभावी प्रोटीन एकाग्रता को कम करेंगे।
    1. इनक्यूबेशन के बाद, एसएलबीबी के 150 μL के साथ बाइलेयर 6x कुल्ला, बुलबुले से बचने के दौरान हर बार मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग।
      नोट: प्रतिक्रिया में कुल 200 μL के लिए पहले से मौजूद बफर और एसयूवी के 50 μL करने के लिए सीधे 150 μL जोड़ें।
    2. जब सेप्टिन या पसंद के एक अलग प्रोटीन के साथ इनक्यूबेटिंग शुरू करने के लिए तैयार हों, तो प्रतिक्रिया बफर के 150 μL (आरएक्सएन: 33.3 एमएम केसीएल, 50 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.4, 1.4 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 0.14% मिथाइलसेल्यूलोज, 1 एमएम बीएमई) के साथ बाइलेयर 6 एक्स को धो लें।
      नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, प्रतिक्रिया बफर ताजा बनाएं और बुलबुले से बचने के लिए प्रतिक्रिया में अच्छी तरह से मिश्रण करते समय बहुत सावधान रहें।
    3. अंतिम धोने के चरण पर, प्रतिक्रिया बफर के 125 μL को हटा दें, कुएं में 75 μL छोड़ दें। टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी 26 द्वारा वांछित एकाग्रता और छवि पर सेप्टिन स्टोरेज बफर (एसएसबी: 300 एमएम केसीएल, 50 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.4, 1 एमएम बीएमई) में पतला सेप्टिनके 25 μL जोड़ें।
      नोट: पहली बार इस परख की स्थापना करते समय या एक नई लिपिड संरचना को शामिल करते समय, यह सुनिश्चित करना अच्छा अभ्यास है कि लिपिड फोटोब्लीचिंग (एफआरएपी) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली का उपयोग करके सतह पर स्वतंत्र रूप से फैल रहे हैं। जबकि वसूली की दर अलग-अलग लिपिड रचनाओं के लिए अलग-अलग होगी और फ्री-स्टैंडिंग सिस्टम की तुलना में स्वाभाविक रूप से कम होगी, लिपिड स्थिर नहीं होना चाहिए।

समर्थित लिपिड बिलियर बफर (एसएलबीबी)
भंडार आयतन अंतिम एकाग्रता
2 एम केसीएल 1.5 मिलीलीटर 300 एमएम
1 एम हेप्स 200 μL 20 एमएम
500 एमएम एमजीसीएल2 20 μL 1 एमएम
पानी 8 मिलीलीटर
प्री-रिएक्शन बफर (पीआरबी)
भंडार आयतन अंतिम एकाग्रता
2 एम केसीएल 166 μL 33.3 एमएम
1 एम हेप्स 500 μL 50 एमएम
पानी 9.33 एमएल
प्रतिक्रिया बफर
भंडार आयतन अंतिम एकाग्रता
2 एम केसीएल 166 μL 33.3 एमएम
1 एम हेप्स 300 μL 50 एमएम
10 मिलीग्राम /एमएल बीएसए 1.39 एमएल 1.39 मिलीग्राम /
1% मिथाइलसेल्यूलोज 1.39 एमएल 0.0014
पानी 10 एमएल तक
बीएमई 0.7 μL 1 एमएम
सेप्टिन स्टोरेज बफर (एसएसबी)
भंडार आयतन अंतिम एकाग्रता
2 एम केसीएल 1.5 मिलीलीटर 300 एमएम
1 एम हेप्स 500 μL 50 एमएम
पानी 10 एमएल तक
बीएमई 0.7 μL 1 एमएम

तालिका 1: समर्थित लिपिड बाइलेयर और प्रतिक्रियाओं की तैयारी के लिए बफर घटक। स्टॉक समाधानों की मात्रा जो बफर में शामिल हैं और प्रत्येक घटक की अंतिम सांद्रता दिखाई जाती है। एसएलबी और पीआरबी को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है और प्रयोगों के बीच पुन: उपयोग किया जा सकता है। प्रतिक्रिया बफर और एसएसबी प्रत्येक प्रयोग के लिए ताजा बनाया जाता है।

2. गोलाकार समर्थित लिपिड बाइलेयर

नोट: यह प्रोटोकॉल 10% घनत्व पर अल्ट्राप्योर पानी में निलंबित सिलिका माइक्रोस्फीयर का उपयोग करता है। प्रोटीन असेंबली के गतिज मापदंडों पर किसी भी काम के लिए, प्रयोगों और वक्रताओं के बीच कुल झिल्ली सतह क्षेत्र को कड़ाई से नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है। तालिका 2 कुल झिल्ली सतह क्षेत्र के 5 मिमी2 को बनाए रखने के लिए मोतियों और बफर की सही मात्रा को दर्शाता है। यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित विधि8,18 पर फैलता है।

  1. बिलियर गठन
    नोट: प्लानर बाइलेयर्स के लिए, मजबूत बाइलेयर गठन के लिए उच्च गुणवत्ता वाली एसयूवी होना महत्वपूर्ण है। तालिका 2 10% घनत्व समाधान से मोतियों की मात्रा और उनके संबंधित एसएलबीबी वॉल्यूम को सूचीबद्ध करती है जिसका उपयोग मनका व्यास की एक श्रृंखला के लिए 5 मिमी2 के अंतिम सतह क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए किया जाता है।
    1. सिलिका माइक्रोस्फीयर (मोतियों के रूप में भी जाना जाता है) एक साथ बसने और झुरमुट करते हैं; मोतियों को मिलाने और किसी भी क्लस्टर को तोड़ने के लिए, बोतल को 15 एस के लिए भंवर करें, फिर 1 मिनट के लिए स्नान-सोनिकेट करें, और 15 एस के लिए फिर से भंवर।
    2. एसएलबीबी की इसी मात्रा के साथ मोतियों की उचित मात्रा (तालिका 2) और 0.5 एमएल कम आसंजन माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 5 एमएम एसयूवी के 10 μL मिलाएं।
    3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मनका-लिपिड मिश्रण एंड-ओवर-एंड रॉक करें। सुनिश्चित करें कि यह इनक्यूबेशन अवसादन को रोकने के लिए रोटेटर पर किया जाता है।
  2. पीईजीलेटेड कवरलिप्स पर कक्ष तैयार करें
    नोट: प्लानर बाइलेयर्स के लिए, प्लास्टिक पीसीआर ट्यूबों से घर का बना कक्षों का उपयोग प्रतिक्रिया मात्रा का समर्थन करने के लिए किया जाता है, लेकिन अन्य कम आसंजन सामग्री, जैसे सिलिकॉन कुएं, बस के रूप में अच्छी तरह से काम कर सकते हैं।
    1. जबकि मोती कमाल कर रहे हैं, कमरे के तापमान पर एक पीईजीलेटेड कवरस्लिप को पिघलाएं। एक 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब काट लें और चरण 1.2 में वर्णित कवरस्लिप में इसे गोंद करें। 24 मिमी x 50 मिमी स्लाइड के लिए, 10 कक्षों तक एक स्लाइड पर फिट हो सकते हैं।
      नोट: यह प्रोटोकॉल 24 मिमी x 50 मिमी पीईजीलेटेड ग्लास कवरलिप्स का उपयोग करता है जो अग्रिम में तैयार किए जाते हैं। संक्षेप में, ग्लास कवरलिप्स को एसीटोन, मेथनॉल और 3 एम केओएच में सोनिकेशन के माध्यम से अच्छी तरह से साफ किया जाता है। कवरलिप्स को तब एन -2-एमिनोएथिल -3-एमिनोप्रोपिलट्रिमेथॉक्सीसिलेन के साथ कार्यात्मक किया जाता है और सहसंयोजक रूप से एमपीईजी सक्सिनिमिडिल वैलेरेट से जुड़ा होता है। समाप्त पीईजीलेटेड कवरलिप्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम-सील किया जाता है। एक समान निष्क्रियता प्रोटोकॉल के लिए, कृपया गिदी एट अल .27 का काम देखें। जबकि पीईजीलेटेड ग्लास कवरलिप्स यहां सुझाए गए हैं, निष्क्रियता के अन्य साधन, जैसे बीएसए या पॉली-एल-लाइसिन विधियां, प्रभावी हो सकती हैं।
  3. अतिरिक्त लिपिड को धोना
    नोट:: यह चरण अतिरिक्त एसयूवी को निकालने और एक बफर एक्सचेंज करने के लिए कार्य करता है। मोती को पूर्व-प्रतिक्रिया बफर (पीआरबी: 33.3 एमएम केसीएल, 50 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.4) के साथ कुल मिलाकर 4 एक्स धोया जाता है। तालिका 3 मनका व्यास की एक श्रृंखला के लिए आरसीएफ में स्पिन गति को सूचीबद्ध करती है।
    1. 30 एस (तालिका 3) के लिए निर्दिष्ट आरसीएफ पर स्पिन मोती। यदि कई मनका आकारों का उपयोग कर रहे हैं, तो मोतियों को तब तक रॉकिंग रखें जब तक कि यह धोने का समय न हो।
      नोट: यह समय बचाने के लिए छोटे मनका अवसादन वेग के साथ छोटे मोती के रूप में एक ही स्पिन में बड़े मोती तलछट के लायक नहीं है। इससे मोती एक-दूसरे से चिपके रह सकते हैं और बाइलेयर की अखंडता से समझौता कर सकते हैं।
    2. पहले स्पिन के बाद, सतह पर तैरनेवाला के 50 μL निकालें और पीआरबी के 200 μL जोड़ें। दूसरे और तीसरे स्पिन के बाद, 200 μL निकालें और पीआरबी के 200 μL जोड़ें। चौथे स्पिन के बाद, 200 μL निकालें और पीआरबी के 220 μL जोड़ें। प्रत्येक धोने के लिए सख्ती से पिपेट।
      नोट: अंतिम पुन: निलंबन मात्रा वॉश से अलग है। लिपिड के साथ इनक्यूबेशन के बाद मोतियों को भंवर न करें क्योंकि यह बाइलेयर में अंतराल छोड़ सकता है। अन्य मनका आकार के साथ काम करते समय या परख के अन्य हिस्सों की स्थापना करते समय अवसादन से बचने के लिए, मनका मिश्रण को एंड-ओवर-एंड रोटेटर पर वापस रखें।
  4. प्रतिक्रिया की तैयारी
    नोट: यह प्रतिक्रिया 5 मिमी2 पर प्रतिक्रिया के कुल झिल्ली सतह क्षेत्र को संरक्षित करने और 100 एमएम केसीएल, 50 एमएम एचईपीईएस, 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 0.1% मिथाइलसेल्यूलोज और 1 एमएम बीएमई की अंतिम प्रतिक्रिया स्थिति का उत्पादन करने के लिए डिज़ाइन की गई है।
    1. यदि कई मनका आकार के साथ एक प्रतियोगिता परख कर रही है, तो प्रत्येक मनका आकार के बराबर मात्रा को एक साथ मिलाकर 1: 1 मिश्रण बनाएं। फिर, आरएक्सएन बफर के 721 μL के साथ वांछित मनका मिश्रण (या एक एकल मनका) के 29 μL मिश्रण मिश्रण मिश्रण मिश्रण।
      नोट: मोतियों के घने समूहों से बचने के लिए एक पिपेट के साथ प्रत्येक चरण में मोतियों को अच्छी तरह से मिश्रण करना महत्वपूर्ण है; इसके परिणामस्वरूप अधिक मनका वितरण और सटीक कुल सतह क्षेत्र होगा।
    2. पतला मोती के 75 μL और एसएसबी में पतला प्रोटीन के 25 μL कुओं के लिए मिलाएं।
      नोट: लेखक आमतौर पर 1-50 एनएम पर खमीर सेप्टिन परिसरों की छवि बनाते हैं।
    3. यदि एक स्थिर-अवस्था में सेप्टिन को मापते हैं, तो 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, और फिर निकट-टीआईआरएफ या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि।
मनका व्यास (μm) अच्छी तरह से मिश्रित मोतियों की मात्रा (μL) एसएलबी बफर की मात्रा (μL) एसयूवी की मात्रा (μL)
6.46 8.94 61.1 10
5.06 7 63 10
3.17 4.39 65.6 10
0.96 1.33 68.7 10
0.54 0.75 69.3 10
0.31 0.43 69.6 10

तालिका 2: माइक्रोस्फीयर के सामान्यीकृत वॉल्यूम। प्रत्येक मनका आकार के बराबर सतह क्षेत्र को बनाए रखने और प्रयोगों के बीच कुल झिल्ली सतह क्षेत्र को सुसंगत रखने के लिए, प्रत्येक मनका आकार और बफर के लिए वॉल्यूम की गणना की गई थी जो कुल सतह क्षेत्र को सामान्यीकृत करता है।

मनका व्यास (μm) अवसादन वेग (आरसीएफ)
0.31 4.5
0.54 4.5
0.96 2.3
3.17 0.8
5.06 0.3

तालिका 3: अलग-अलग व्यास के सूक्ष्ममंडलों के लिए अवसादन वेग। प्रत्येक मनका व्यास के लिए, दिखाए गए न्यूनतम अवसादन वेग का उपयोग अनबाउंड लिपोसोम को धोने के लिए मोतियों को गोली देने के लिए किया गया था।

3. रॉड समर्थित लिपिड बाइलेयर

नोट: यहां प्रस्तुत अन्य परखों के विपरीत, रॉड परख कुल झिल्ली सतह क्षेत्र के सावधानीपूर्वक नियंत्रण की अनुमति नहीं देती है। प्रयोगों के बीच मात्रा और मात्रा में सुसंगत हो सकता है, लेकिन क्योंकि इसके परिणामस्वरूप विभिन्न लंबाई और व्यास की छड़ें होती हैं, इसलिए प्रतिक्रिया में कुल झिल्ली सतह क्षेत्र को एक्सट्रपलेशन करना मुश्किल होता है। इस प्रकार, जबकि यह एक ही सतह पर कई वक्रताओं के साथ वक्रता संवेदन की खोज के लिए एक उत्कृष्ट परख है और सेप्टिन अल्ट्रास्ट्रक्चर की खोज के लिए उपयोगी रहा है, यह गतिज माप के लिए अनुशंसित नहीं है। इस पद्धति को पहले18 बताया गया था और यहां इसका विस्तार किया जा रहा है।

  1. ग्लास माइक्रोफाइबर फिल्टर से बोरोसिलिकेट रॉड प्राप्त करना
    1. सी ग्लास माइक्रोफाइबर फ़िल्टर को छोटे टुकड़ों में फाड़ें और उन्हें 100% इथेनॉल के 60 एमएल के साथ 100 एमएल बीकर में रखें। जब तक समाधान अपारदर्शी नहीं हो जाता तब तक स्नान-सोनिकेट; यह एक बारीक कटा हुआ फिल्टर के साथ 20-30 मिनट जितना कम समय ले सकता है।
      नोट: बड़े टुकड़ों को तोड़ने के लिए अच्छी तरह से सोनीकेट करें; जितना अधिक पृथक / अपारदर्शी होगा, उतना ही बेहतर होगा।
    2. फिल्म के साथ समाधान को कवर करें और रात भर कमरे के तापमान पर समाधान स्टोर करें।
  2. छड़ पर बाइलेयर बनाना
    नोट: यह चरण पूर्ण रॉड कवरेज प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त लिपिड के साथ किया जाता है क्योंकि इस विधि में कुल सतह क्षेत्र को निर्धारित करना असंभव है।
    1. अगले दिन इथेनॉल समाधान का निपटारा किया जाएगा (चरण 3.1.2.), इसलिए उपयोग करने से पहले इसे अच्छी तरह से मिलाएं। रॉड समाधान के 10 μL और SLBB के 70 μL गठबंधन।
    2. 30 एस के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र में शीर्ष गति पर स्पिन और सतह पर तैरनेवाला के 50 μL हटा दें। एसएलबीबी के एक और 50 μL में पुन: निलंबित करें और इथेनॉल को पतला करने के लिए कुल चार वॉश के लिए स्पिन दोहराएं।
      नोट: रॉड समर्थन ट्यूब के तल पर एक ठोस गोली नहीं बनाएगा। इसके बजाय उन्हें ट्यूब के किनारे धुंधला कर दिया जाता है; इससे धोने के दौरान उन्हें पूरी तरह से संरक्षित करना मुश्किल हो जाता है। चूंकि इस परख में कुल सतह क्षेत्र नियंत्रित नहीं है, इसलिए यह ठीक है अगर वे परेशान हैं।
    3. 5 एमएम एसयूवी के 50 μL और SLBB के 20 μL के साथ अच्छी तरह से मिश्रित रॉड समाधान के 10 μL गठबंधन। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं, माइक्रोस्फीयर पर बाइलेयर बनाते समय एंड-ओवर-एंड घूर्णन करते हैं।
  3. अतिरिक्त लिपिड को धोना
    1. चरण 3.2.2 के समान, समाधान से झिल्ली-लेपित छड़ को गोली देने के लिए 30 एस के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र में शीर्ष गति पर लिपिड-रॉड समाधान को स्पिन करें।
    2. पहले स्पिन के बाद, सतह पर तैरनेवाला के 50 μL निकालें और पीआरबी के 200 μL जोड़ें। दूसरे और तीसरे स्पिन के बाद, 200 μL निकालें और पीआरबी के 200 μL जोड़ें। चौथे स्पिन के बाद, 200 μL निकालें, पीआरबी के 220 μL जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए सख्ती से पिपेट।
  4. प्रतिक्रिया की तैयारी
    1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में, रॉड समाधान के 29 μL के साथ प्रतिक्रिया बफर के 721 μL मिश्रण। अच्छी तरह मिक्स करें।
    2. एक 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में, प्रतिक्रिया बफर में छड़ के 75 μL और वांछित एकाग्रता पर सेप्टिन के 25 μL गठबंधन, एसएसबी में पतला। इसे कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  5. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के लिए तैयारी
    1. इनक्यूबेशन के बाद, एक दौर, खूंटी-लेपित 12 मिमी कवरस्लिप पर 100 μL सेप्टिन-रॉड मिश्रण जोड़ें और एक बंद पेट्री डिश में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    2. पेट्री डिश (10 एमएल पर्याप्त होना चाहिए) के तल को 30 मिनट के लिए 0.05 एम सोडियम कैकोडाइलेट (एनएसीओ), पीएच 7.4 में 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ भरकर नमूना ठीक करें। एक ग्लास पिपेट के साथ तरल की आकांक्षा करें। 5 मिनट के लिए 0.05 एम नाको के 10 मिलीलीटर के साथ सेते हुए नमूना धो लें और कुल दो धोने के लिए दोहराएं।
    3. 30 मिनट के लिए 0.5% ओएसओ4 कोकोडिलेट बफर में पोस्टफिक्स, और फिर 0.05 एम नाको (5 मिनट /
    4. 15 मिनट के लिए 1% टैनिक एसिड के साथ नमूना सेते हैं, और फिर नाको 3 एक्स में धो लें। 0.5% ओएसओ4 में 15 मिनट के लिए सेते हैं और नाको के साथ 3x धो लें।
    5. इथेनॉल सांद्रता में वृद्धि का उपयोग कर नमूनों को निर्जलित करें: 5 मिनट, 2x के लिए 30% ईटीओएच; 5 मिनट के लिए 50% ईटीओएच; 5 मिनट के लिए 75% ईटीओएच; और 5 मिनट, 2x के लिए 100% ईटीओएच। एक और 10 मिनट इनक्यूबेशन के साथ पालन करें।
    6. संक्रमण तरल पदार्थ (हेक्सामेथिलडिसिलाज़ेन) 3x (5 मिनट, 10 मिनट, फिर 5 मिनट) में सेते हैं।
    7. हवा को सूखने दें, फिर नमूनों को स्पटर-कोटिंग तक डेसिकेटर में रखें। पैलेडियम मिश्र धातु के साथ 4 एनएम परत को स्पटर-कोट करें और फिर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर छवि।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रत्येक एसएलबी की तैयारी के बाद, सेप्टिन या ब्याज के प्रोटीन को वांछित समर्थन के साथ ऊष्मायन किया जा सकता है और टीआईआरएफएम, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी या एसईएम के माध्यम से इमेज किया जा सकता है। यहां दिखाए गए परिणाम ई कोलाई17 से पुनः संयोजक रूप से व्यक्त और शुद्ध सेप्टिन का उपयोग करते हैं। प्लानर एसएलबी पर टीआईआरएफएम का उपयोग करते हुए, फिलामेंट्स की लंबाई और उनके लचीलेपन को निर्धारित करना, प्रसार गुणांक को मापना और समय28,29 के साथ असेंबली का निरीक्षण करना संभव है। उच्चतम गुणवत्ता वाले माप एकत्र करने के लिए, सबसे पहले बाइलेयर की गुणवत्ता का पता लगाना आवश्यक है, खासकर जब उन्हें पहली बार तैयार किया जाता है या लिपिड रचनाओं को बदलते समय। टीआईआरएफएम द्वारा बाइलेयर पर प्रोटीन वितरण का एक दृश्य निरीक्षण बाइलेयर के उन क्षेत्रों की पहचान करने में मदद कर सकता है जिन्हें खरोंच दिया गया है या विकृत किया गया है। प्रोटीन वितरण सजातीय (चित्रा 3 ए) होना चाहिए, और बाइलेयर (चित्रा 3 बी) में छेद या अंतराल नहीं होना चाहिए। छेद के साथ झिल्ली से बचना सबसे अच्छा है, जो धूल संदूषण या स्लाइड हैंडलिंग से धुंध से बन सकता है, क्योंकि यह बाइलेयर के अन्य क्षेत्रों में प्रोटीन वितरण को बदल सकता है। झिल्ली की कल्पना करने के लिए, ट्रेस रोडामाइन-पीई को बाइलेयर गठन के लिए एसयूवी में शामिल किया जा सकता है। उच्च गुणवत्ता वाले बाइलेयर में, फ़ील्ड भी दिखाई देगा (छवियां नहीं दिखाई गई हैं), लेकिन अगर लिपोसोम पुराने हैं या यदि वॉश पर्याप्त कड़े नहीं हैं, तो सतह पर अनबर्स्ट और ट्यूबुलेटेड लिपोसोम जमा हो सकते हैं (चित्रा 3 सी)। इसके अतिरिक्त, जबकि ठोस समर्थन लिपिड8 के मुक्त प्रसार में बाधा डालेंगे, लिपिड स्थिर नहीं होना चाहिए। एफआरएपी प्रयोगों का उपयोग प्लानर बाइलेयर्स पर लिपिड की गतिशीलता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, जो संरचना द्वारा भिन्न हो सकते हैं और सेकंड30 के क्रम में वसूली दर दिखानी चाहिए।

गोलाकार समर्थन का उपयोग परिभाषित वक्रताओं की झिल्ली पर प्रोटीन बाध्यकारी की जांच करने के लिए किया जा सकता है या तो अलगाव (एक वक्रता) में या वक्रता 6,18 के बीच प्रतिस्पर्धा का निरीक्षण करने के लिए एक ही कुएं में कई झिल्ली वक्रताओं के साथ। मोतियों पर निकट-टीआईआरएफएम >1 μm का उपयोग किसी दिए गए क्षेत्र27 के लिए एसोसिएशन की घटनाओं की संख्या को मापने के लिए भी किया जा सकता है। प्लानर बाइलेयर्स के साथ, हम चिकनी बाइलेयर जमाव (चित्रा 4 ए) की तलाश करने के लिए रोडामाइन-पीई का उपयोग करते हैं, अर्थात, कोई लिपिड क्लंप नहीं, जो बहु-लैमेलैरिटी या अनबर्स्ट लिपोसोम (चित्रा 4 बी) का संकेत देता है, और बिलियर (चित्रा 4 सी) में कोई अंतराल नहीं है। घुमावदार सतहों पर समय के साथ कुल प्रोटीन सोखना या प्रोटीन सोखना को मापने के लिए, एक असतत मात्रा बनाने के लिए एक दूसरे से व्यक्तिगत मोतियों को अलग करना आवश्यक है जिसके लिए योग लिपिड तीव्रता और योग सेप्टिन तीव्रता को मापा जा सकता है। इस प्रकार, मोतियों को चित्रा 4 डी के रूप में एक साथ क्लंप करने के बजाय अच्छी तरह से अलग किया जाना चाहिए। हम चर्चा अनुभाग में इन सभी संभावित समस्याओं के लिए समस्या निवारण विकल्पों को संबोधित करते हैं।

यह एसएलबी परख रॉड समर्थन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, जो प्रोटीन के लिए एक ही सतह पर कई वक्रताओं का नमूना देने के लिए एक वातावरण प्रदान करता है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ इस परख को जोड़ने से उपयोगकर्ता वक्रता वरीयता, संरेखण और सेप्टिन18 या ब्याज के अन्य प्रोटीन की लंबाई वितरण की जांच करने की अनुमति देता है। जबकि यहां प्रस्तुत अन्य परखों के समान, रॉड परख फिल्टर पेपर से प्राप्त सब्सट्रेट की विषम प्रकृति के कारण कुल झिल्ली सतह क्षेत्र के सावधानीपूर्वक नियंत्रण की अनुमति नहीं देता है। यहां उपयोग किए जाने वाले फिल्टर पेपर के भौतिक गुणों के परिणामस्वरूप विभिन्न लंबाई और व्यास (चित्रा 5 ए) की छड़ें होती हैं; यह घुमावदार सतहों (चित्रा 5 बी) पर प्रोटीन वक्रता संवेदन और संगठन की खोज के लिए उपयोगी है, लेकिन क्योंकि झिल्ली के लिए प्रोटीन के अनुपात को नियंत्रित नहीं किया जा सकता है, छड़ संतृप्ति-बाध्यकारी घटता उत्पन्न करने या बाध्यकारी स्थिरांक जैसे मापदंडों को मापने के लिए सीमित उपयोगिता के हैं।

Figure 1
चित्रा 1: विभिन्न वक्रताओं के साथ समर्थन पर समर्थित लिपिड बाइलेयर गठन का अवलोकन। एसयूवी को किसी दिए गए झिल्ली पर नमूने के लिए उपलब्ध वक्रताओं को बदलने के लिए विभिन्न ज्यामिति के ठोस समर्थन के साथ ऊष्मायन किया जाता है। एसयूवी ठोस समर्थन सतह पर सोखते हैं और लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए टूट जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिक्रिया कक्ष की योजनाबद्ध स्थापित। कस्टम कक्षों को तैयार करने के लिए, एक 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब को काट दिया जाता है जहां ट्यूब टेपर और टोपी (लाल धराशायी लाइनों) पर शुरू होती है। कट ट्यूब के बिना खतना के रिम को यूवी-सक्रिय गोंद (नीले) की एक पतली परत के साथ लेपित किया जाता है और एक कवरस्लिप पर गोंद-डाउन रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्लानर बाइलेयर्स के प्रतिनिधि टीआईआरएफ माइक्रोग्राफ (ए) गैर-पोलीमराइजेबल सेप्टिन बाध्य (हरे) के साथ एक उच्च गुणवत्ता वाले लिपिड बाइलेयर (75% डीओपीसी, 25% सोया पीआई) की एक प्रतिनिधि छवि। प्रोटीन किसी भी विशिष्ट क्षेत्रों में क्लस्टरिंग नहीं है, और झिल्ली से जुड़े कोई लिपोसोम नहीं हैं और कोई छेद नहीं है। (बी) यह बाइलेयर खराब साफ ग्लास कवरलिप्स के साथ बनाया गया था और झिल्ली में "छेद" (सफेद तीर) प्रतीत होता है जहां कम सेप्टिन होते हैं। बाइलेयर में इन दोषों के किनारों पर सेप्टिन को भीड़ में देखा जा सकता है (दाईं ओर ज़ूम किए गए क्षेत्र में सफेद तीर द्वारा दर्शाया गया है)। (सी) ट्रेस रोडामाइन-पीई का उपयोग करके कम गुणवत्ता वाले बाइलेयर की एक प्रतिनिधि छवि। सतह पर अनबर्स्ट लिपोसोम और ट्यूबुलेटेड लिपिड दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: लिपिड-लेपित माइक्रोस्फीयर के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ। प्रतिस्पर्धा परख से प्रतिनिधि छवियां जहां लिपिड-लेपित मोती (75% डीओपीसी, 25% सोया पीआई, 0.1% रोडामाइन पीई) 0.3 μm, 0.5 μm, 1 μm, 3 μm और 5 μm के व्यास के साथ मिश्रित थे। सभी छवियां अधिकतम जेड अनुमान हैं। (ए) लिपिड-लेपित माइक्रोस्फीयर के उच्च गुणवत्ता वाले मिश्रण की प्रतिनिधि छवि। गोलाकार समर्थन झिल्ली द्वारा समान रूप से लेपित होते हैं, और कुछ मनका समूह होते हैं। (बी) असमान झिल्ली कोटिंग की प्रतिनिधि छवि, संभवतः अतिरिक्त लिपिड की अपर्याप्त धुलाई के कारण होती है। (सी) अनुचित हैंडलिंग के कारण झिल्ली कवरेज (सफेद तीर) में अंतराल के साथ मोतियों की प्रतिनिधि छवि। (डी) घने गुच्छेदार मोतियों की प्रतिनिधि छवि, संभवतः पूरी प्रक्रिया में अपर्याप्त मिश्रण के कारण होती है, खासकर जब विभिन्न मोतियों को एक साथ जोड़ते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: लिपिड और सेप्टिन-लेपित छड़ के प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (ए) एसईएम छवि लिपिड-लेपित (75% डीओपीसी, 25% सोया पीआई, 0.1% रोडामाइन पीई) रॉड लंबाई और व्यास के वितरण को दर्शाती है। (बी) सकारात्मक वक्रता की धुरी के साथ गठबंधन सेप्टिन फिलामेंट्स के साथ एक पृथक झिल्ली-लेपित रॉड का किनारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

कोशिका झिल्ली कई अलग-अलग आकार, वक्रता और भौतिक रासायनिक गुणों को लेती है। नैनोमीटर-स्केल मशीनरी का अध्ययन करने के लिए जिसके माध्यम से कोशिकाएं माइक्रोमीटर-स्केल असेंबली का निर्माण करती हैं, झिल्ली मिमेटिक्स के न्यूनतम पुनर्गठन प्रणालियों को डिजाइन करना आवश्यक है। यह प्रोटोकॉल उन तकनीकों को प्रस्तुत करता है जो झिल्ली वक्रता और संरचना दोनों को ठीक से नियंत्रित करते हैं जबकि उपयोगकर्ता को व्यापक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करके मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माप लेने की अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण घटक उपयुक्त सतह पर कुओं को इकट्ठा कर रहे हैं और लिपिड को संभाल रहे हैं। यहां वर्णित कुएं पीसीआर ट्यूबों और यूवी-सक्रिय चिपकने वाले का उपयोग करके हस्तनिर्मित हैं; असेंबली के दौरान प्रतिक्रिया क्षेत्र के अंदर गोंद नहीं मिलना महत्वपूर्ण है। यह अच्छी तरह से के किनारों के साथ इमेजिंग और कवर ग्लास पर उच्च प्रोटीन सोखना के लिए देख कर प्रयोग के दौरान के लिए जाँच की जा सकती है। उपयोगकर्ता कुओं के लिए वैकल्पिक सामग्रियों का उपयोग करना चुन सकता है, जैसे कि सिलिकॉन, जिसे व्यावसायिक रूप से आदेश दिया जा सकता है, लेकिन प्रस्तुत विधि मजबूत कुएं प्रदान करती है जो शिफ्ट या रिसाव नहीं करेगी और बड़ी प्रतिक्रिया मात्रा का समर्थन कर सकती है। कवर ग्लास की सतह, हमारे हाथों में, प्लानर बाइलेयर बनाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण रही है। प्लाज्मा सफाई समय या यहां तक कि कवर ग्लास के ब्रांड का अनुकूलन बाइलेयर के गठन को देखने के लिए आवश्यक हो सकता है, क्योंकि उपयुक्त सतह उपचार और चार्ज पुटिका सोखना और संलयन 31,32,33 के लिए महत्वपूर्ण हैं। पहली बार इन प्रयोगों को स्थापित करते समय या नई लिपिड रचनाओं के साथ काम करते समय, फोटोब्लीचिंग (एफआरएपी) प्रयोगों के बाद प्रतिदीप्ति वसूली का उपयोग फ्री-स्टैंडिंग सिस्टम30 की तुलना में झिल्ली की तरलता का आकलन करने के लिए किया जाना चाहिए। यह उम्मीद की जाती है कि समर्थन प्रणाली उनके मुक्त खड़े समकक्षों की तुलना में कम तरल पदार्थ होगी लेकिन स्थिर नहींहोगी 12.

प्रतिदीप्ति द्वारा बाइलेयर गुणवत्ता का आकलन करते समय, बाइलेयर (चित्रा 3 सी) में अनबर्स्ट लिपोसोम या दोषों की तलाश करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ये स्थानीय प्रोटीन सोखना को बदल सकते हैं। निम्न समस्या निवारण विकल्पों पर विचार किया जा सकता है। ए) कोई भी बाइलेयर गुणवत्ता में सुधार करने के लिए एसयूवी तैयारी को समायोजित कर सकता है। सोनिकेशन, फ्रीज-पिघलना और एक्सट्रूज़न सभी आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले तरीके हैं जो लिपिड रचनाओं के आधार पर आसानी और सफलता में भिन्न हो सकते हैं। हमारे हाथों में, एक मोनोडिस्प्रेस्ड आकार वितरण के साथ एक पूरी तरह से स्पष्ट एसयूवी समाधान के परिणामस्वरूप सबसे सजातीय बाइलेयर होते हैं। गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) का उपयोग आकार वितरण25 का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। बी) कोई एसयूवी के अंदर और बाहरी बफर के बीच नमक एकाग्रता में अंतर बढ़ा सकता है। आंतरिक आयन एकाग्रता को कम करके (या बाहरी एक को बढ़ाकर), एसयूवी पर आसमाटिक तनाव टूटने की संभावना को बढ़ाता है31. वैकल्पिक रूप से, मौजूद मोनोवैलेंट केशन को बदलने से एसएलबी गठन के कैनेटीक्स बदल सकते हैं और नई लिपिड रचनाओं के एसएलबी को अनुकूलित करने में सहायता मिल सकती है। ग) कोई भी धोने की संख्या या बल को बढ़ा सकता है। लेखकों के अनुभव में, वॉश के दौरान जोरदार मिश्रण क्लीनर बाइलेयर की ओर जाता है और विघटनकारी प्रतीत नहीं होता है; इसके बजाय, सबसे बड़ा मुद्दा गलती से पिपेट युक्तियों के साथ बाइलेयर को स्क्रैप करने से आता है, जो झिल्ली में गश के रूप में दिखाई देगा। घुमावदार बाइलेयर्स के लिए, संकीर्ण पिपेट युक्तियों के साथ हैंडलिंग को कम करना और धोने के चरणों को करते समय धीरे-धीरे मिश्रण करना सबसे अच्छा है, खासकर बड़े (>1 μm) मोतियों के लिए, क्योंकि झिल्ली को ग्लास मोतियों से हटाया जा सकता है। यदि गोलाकार झिल्ली बाइलेयर में लगातार अंतराल मनाया जाता है (चित्रा 4 सी), पिपेट युक्तियों की चौड़ाई में वृद्धि (टिप के अंत को काटकर या विस्तृत युक्तियां खरीदकर) और जितना संभव हो उतना हैंडलिंग को कम करना, जबकि अभी भी मनका समाधान पूरी तरह से मिश्रण करना, मदद कर सकता है। इस तकनीक के साथ एक आम तकनीकी मुद्दा मोतियों की प्रवृत्ति एक साथ झुरमुट (चित्रा 4 डी) है। यह आंशिक रूप से बाइलेयर गठन से पहले सोनिकेशन समय को बढ़ाकर हल किया जा सकता है; हालाँकि, कुछ क्लस्टरिंग अपरिहार्य है क्योंकि झिल्ली-लेपित मोती भी कुएं में समय के साथ एक साथ टकरा सकते हैं। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए क्लंप्ड मोतियों से बचा जाना चाहिए।

प्लानर बाइलेयर्स पर एकल-अणु गतिशीलता के मात्रात्मक माप की सीमाओं में कणों को सटीक रूप से ट्रैक करने और गिनने के लिए कम सांद्रता पर रहने की आवश्यकता शामिल है। हालांकि, ट्रैकिंग35 के दौरान दिखाई देने वाले कणों की संख्या को कम करने के लिए अधिग्रहण के दौरान ब्याज के प्रोटीन को अंडर-लेबल करके इसे ठीक किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, गोलाकार और रॉड एसएलबी को विशेष रूप से माइक्रोमीटर-स्केल झिल्ली पर प्रोटीन की वक्रता संवेदनशीलता को मापने के लिए विकसित किया गया था, और यहां उपयोग किए जाने वाले सिलिका माइक्रोस्फीयर केवल व्यास में 100 एनएम तक उपलब्ध हैं, जिस बिंदु पर वे प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जाने पर विवर्तन-सीमित पंक्टा होते हैं। इस प्रकार, जो लोग छोटे व्यास पर सटीक वक्रता विशिष्टता का आकलन करना चाहते हैं, वे इस विधि का उपयोग करके ऐसा करने में असमर्थ होंगे। हालांकि, यह तकनीक अभी भी वक्रता वरीयता की प्रवृत्ति के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करेगी और वक्रता-निर्भर विधानसभाओं के विच्छेदन की अनुमति देगी।

फ्री-स्टैंडिंग लिपिड बाइलेयर सिस्टम की तुलना में, यह तकनीक बफर स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्तरदायी है और तैयारी के दौरान सावधानीपूर्वक आसमाटिक संतुलन की आवश्यकता नहीं है। इसके अतिरिक्त, क्योंकि यह ग्लास समर्थन का उपयोग करता है, बाइलेयर आसानी से कुएं के नीचे डूब जाते हैं, टीथरिंग की आवश्यकता को हटा देते हैं या सुक्रोज या अन्य गाढ़ाएजेंटों के उपयोग को हटा देते हैं 36. जबकि फ्री-स्टैंडिंग लिपिड बाइलेयर सिस्टम झिल्ली-बाध्यकारी प्रोटीन द्वारा झिल्ली विरूपण की जांच करने का एक उपयोगी साधन प्रदान करते हैं, झिल्ली वक्रता और जटिल असेंबली के बीच संबंधों का अध्ययन करना मुश्किल है। आसानी से विकृत झिल्ली प्रणालियों के विपरीत, यह दृष्टिकोण उपयोगकर्ता को झिल्ली की वैश्विक ज्यामिति को निर्धारित करने वाली व्यक्तिगत लिपिड प्रजातियों के आंतरिक आकार के बिना विभिन्न प्रकार की लिपिड रचनाओं का उपयोग करने की अनुमति देता है। अंत में, रॉड के आकार के एसएलबी ब्याज के प्रोटीन (चित्रा 5 बी) के लिए एक ही निरंतर झिल्ली पर कई वक्रताओं के नमूने की अनुमति देते हैं, जो वक्रता-निर्भर विधानसभाओं या कई घटकों के कोलोकलाइजेशन के मूल्यांकन के लिए विशिष्ट रूप से जानकारीपूर्ण है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान सं. आर 01 जीएम -130934 और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ) अनुदान एमसीबी- 2016022। बीएनसी, ईजेडीवी, और केएससी को पुरस्कार टी 32 जीएम 119999 के तहत नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural Watson 137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes USA Scientific 1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME) Sigma-Aldrich M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips Thermo Scientific 152450 Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
Egg Liss Rhodamine PE Avanti Polar Lipids 810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade VWR 16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer VWR 11652
Ethanol, 200 proof Fisher Scientific 04-355-223EA
HEPES Sigma Aldrich H3375-1KG
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191
Magnesium chloride VWR 7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers Matsunami Discontinued 22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres Bangs Laboratories, Inc. Depends on size: SS0200*-SS0500* Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive Norland Thorlabs NOA 68 Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide Millipore Sigma 20816-12-0
Parafilm VWR 52858-000
Plasma Cleaner Plasma Etch PE-25 Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride VWR 0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm   VWR 64-0712
Sonicator bath Branson 1510R-MT Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI Avanti Polar Lipids 840044
Tabletop centrifuge Eppendorf 22331
UV Lamp Spectroline ENF-260C 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper VWR 28455-030 42.5 mm diameter, Grade GF/C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
  2. Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
  3. Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
  4. Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
  5. Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  6. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
  7. Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
  8. Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
  9. Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).
  10. Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
  11. Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
  12. Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
  13. Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).
  14. Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
  15. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  16. Lou, H. -Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  17. Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
  18. Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
  19. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  20. Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).
  21. Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
  22. Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
  23. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  24. Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
  25. Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
  26. Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).
  27. Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
  28. Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
  29. Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
  30. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).
  31. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
  32. Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
  33. Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
  34. Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
  35. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
  36. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).

Tags

जैव रसायन अंक 185
बायोफिजिकल गुणों और कार्यों का अध्ययन करने के लिए झिल्ली में सेप्टिन असेंबली का पुनर्गठन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Curtis, B. N., Vogt, E. J. D.,… More

Curtis, B. N., Vogt, E. J. D., Cannon, K. S., Gladfelter, A. S. Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions. J. Vis. Exp. (185), e64090, doi:10.3791/64090 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter