Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rekonstituering av septinmontering ved membraner for å studere biofysiske egenskaper og funksjoner

Published: July 28, 2022 doi: 10.3791/64090
Automatic Translation
*1, *2, 1,3, 1,2,3
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill
* These authors contributed equally

Summary

Cellefri rekonstituering har vært et sentralt verktøy for å forstå cytoskelettmonteringen, og arbeid i det siste tiåret har etablert tilnærminger for å studere septindynamikk i minimale systemer. Presentert her er tre komplementære metoder for å observere septinmontering i forskjellige membrankontekster: plane dobbeltlag, sfæriske støtter og stangstøtter.

Abstract

De fleste celler kan fornemme og endre form for å utføre grunnleggende celleprosesser. I mange eukaryoter er septincytoskelettet en integrert komponent i å koordinere formendringer som cytokinese, polarisert vekst og migrasjon. Septiner er filamentdannende proteiner som samles for å danne forskjellige høyere ordens strukturer, og i mange tilfeller finnes i forskjellige områder av plasmamembranen, særlig i regioner med mikronskala positiv krumning. Overvåking av prosessen med septinmontering in vivo hindres av begrensningene ved lysmikroskopi i celler, samt kompleksiteten av interaksjoner med både membraner og cytoskeletale elementer, noe som gjør det vanskelig å kvantifisere septindynamikk i levende systemer. Heldigvis har det vært betydelig fremgang i det siste tiåret i å rekonstituere septincytoskjelettet i et cellefritt system for å dissekere mekanismene som styrer septinmontering ved høye romlige og tidsmessige oppløsninger. Kjernetrinnene i septinmontering inkluderer septin heterooligomerforening og dissosiasjon med membranen, polymerisering i filamenter og dannelse av høyere ordens strukturer gjennom interaksjoner mellom filamenter. Her presenterer vi tre metoder for å observere septinmontering i forskjellige sammenhenger: plane dobbeltlag, sfæriske støtter og stangstøtter. Disse metodene kan brukes til å bestemme de biofysiske parametrene til septiner i forskjellige stadier av montering: som enkeltoktamer som binder membranen, som filamenter og som sammenstillinger av filamenter. Vi bruker disse parametrene sammen med målinger av krumningsprøvetaking og fortrinnsrett adsorpsjon for å forstå hvordan krumningsføler fungerer på en rekke lengde- og tidsskalaer.

Introduction

Formen på celler og mange av deres indre rom er avhengig av lipidmembranene som omgir dem. Membraner er viskoelastiske strukturer som kan deformeres gjennom interaksjoner med proteiner, lipidsortering og virkende interne og eksterne krefter for å generere en rekke former 1,2,3,4. Disse formene er ofte beskrevet i form av membrankrumning. Celler bruker en mangfoldig pakke med proteiner som er i stand til fortrinnsvis å montere på eller "sensing" bestemte membrankrumninger for å sikre definert spatio-temporal kontroll over prosesser, inkludert cellehandel, cytokinese og migrasjon 5,6. Dynamikken til cellemaskiner ved membranen er spesielt vanskelig å observere på grunn av vanskeligheten med å balansere tid og romlig oppløsning med cellehelsen. Mens superoppløsningsteknikker kan gi en detaljert oversikt over slike strukturer, krever de lange oppkjøp som ikke er egnet til tidsskalaene for montering / demontering for de fleste maskiner. I tillegg gjør den molekylære kompleksiteten til disse samlingene i deres opprinnelige miljø og de mange rollene en enkelt komponent kan spille, minimale rekonstitueringssystemer til et verdifullt verktøy for å studere molekylers funksjonelle kapasitet.

Minimal membranmimetika er utviklet for å studere membranegenskaper og proteinmembraninteraksjoner utenfor cellen. Membranmimetika varierer fra frittstående lipid dobbeltlag, som liposomer eller gigantiske unilamellære vesikler, til støttede lipid dobbeltlag (SLB)7,8,9,10. SLBer er biomimetiske membraner forankret til underliggende støtte, vanligvis sammensatt av glass, glimmer eller silika11,12. En rekke geometrier kan brukes, inkludert plane overflater, kuler, stenger og til og med bølgende eller mikropatternerte substrater for å undersøke proteinmembraninteraksjoner på både konkave og konvekse krumninger samtidig1 3,14,15,16,17,18 . Tolagsdannelse begynner med vesikkeladsorpsjon på en hydrofil overflate, etterfulgt av fusjon og brudd for å danne et kontinuerlig dobbeltlag (figur 1)19. Støttede dobbeltlag er spesielt mottagelige for lys- og elektronmikroskopi, noe som gir både bedre tid og romlig oppløsning enn det som ofte er oppnåelig i celler. Buede SLBer gir spesielt et attraktivt middel til å undersøke proteinkurvaturfølsomhet i fravær av signifikant membrandeformasjon, slik at man kan skille mellom krumningsføler og krumningsinduksjon, som ofte er umulig å skille i frittstående systemer.

Septiner er en klasse av filamentdannende cytoskeletale proteiner kjent for sin evne til å montere på positivt buede membraner 6,18,20. I løpet av cellesyklusen i gjær samles septiner i en ring og må omorganiseres for å danne timeglass- og dobbeltringstrukturene assosiert med henholdsvis knoppoppkomst og cytokinese, henholdsvis21. Mens vakkert arbeid har blitt gjort ved hjelp av platina kopi elektronmikroskopi for å observere septinarkitektur ved varierende cellesyklusstadier22, har det å se septinmontering over tid ved hjelp av lysmikroskopi i gjær møtt med begrenset romlig oppløsning. Tidligere arbeid på septiner ved bruk av lipidmonolag visualisert ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) var i stand til å rekonstituere flere interessante septinstrukturer som ringer, bunter og gasbind23. Imidlertid er EM-teknikker også begrenset i sin tidsmessige oppløsning, i motsetning til fluorescensmikroskopi. For bedre å løse de kinetiske parametrene i multiskalaprosessen med septinmontering, vendte vi oss til støttet membranmimetika, hvor man nøye kan kontrollere membrangeometri, prøveforhold og bildemodalitet.

Protokollene beskrevet her bruker plane eller buede SLBer, renset protein og en kombinasjon av mikroskopiteknikker. Kvantitativ fluorescenskonfokalmikroskopi og total indre refleksjonsfluorescensmikroskopi (TIRFM) ble brukt til å måle både bulkproteinbinding på forskjellige membrankrumninger, samt for å måle bindingskinetikken til enkeltmolekyler. Videre er denne protokollen tilpasset til bruk med scanning elektronmikroskopi (SEM) for å undersøke protein ultrastruktur på ulike membrankrumninger. Mens fokuset på disse protokollene er på septincytoskelettet, kan protokollene enkelt modifiseres for å undersøke krumningsfølsomheten til ethvert protein leseren finner interessant. I tillegg kan de som arbeider i felt som endocytose eller vesikulær handel, finne disse teknikkene nyttige for å undersøke krumningsavhengige samlinger av multiproteinkomplekser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Forming av støttede lipid dobbeltlag krever fremstilling av monodispersed små unilamellære vesikler (SUVer). Se en tidligere publisert protokoll24 om SUV-dannelse. Kort sagt, alle SUVer dannes ved sonde sonikering i 12 minutter totalt ved 70% amplitude via 4 min sonikeringsperioder etterfulgt av 2 min hvileperioder i isvann. SUV-løsninger må være godt avklart og monodispersed i størrelse. Størrelsesfordelinger av SUV-er kan for eksempel måles ved dynamisk lysspredning25.

1. Plane lipid dobbeltlag

  1. Plasmarengjøring av lysbildene
    MERK: Plasmarengjøring fjerner organiske forurensninger og øker glassets hydrofilitet, noe som sikrer effektiv lipidadsorpsjon. Følgende trinn kan endres eller må optimaliseres avhengig av plasmarenseren og glassdekslene som brukes.
    1. Rens plasmarenseren i 5 minutter med oksygen for å fjerne luft fra linjene og kammeret. Dette er for å sikre at når plasmarenseren kjøres, er det først og fremst oksygen i linjene og kammeret, noe som gir mer konsistente dobbeltlagspreparater.
    2. Mens du renser, streamer du en inert gass, for eksempel N2 eller Ar, over mikrodekselglassglasset for å fjerne støv og partikler.
      VALGFRITT: Dekkglassglass kan vaskes ved å sprøyte hver side med 100% isopropanol etterfulgt av vann. Gjenta isopropanol-vannvasken 3x og tørk deretter med en N2-strøm .
    3. Ordne lysbilder med tørt deksel i en keramisk vugge. Plasser vuggen på baksiden av plasmakammeret slik at dekslene er parallelle med den lange kanten av kammeret (dette holder dem på plass under plasmarengjøring). Kjør plasmarenseren i 15 minutter med oksygen ved maksimal effekt.
  2. Kammer forberedelse
    MERK: Metoden beskrevet her bruker hjemmelagde kamre fra plast-PCR-rør for å støtte reaksjonsvolumene, men andre materialer med lav vedheft, for eksempel silikonbrønner, kan også være egnet.
    1. Bruk et barberblad eller en saks til å klippe av hetten rett under den frostede delen av et 0,2 ml PCR-rør (figur 2).
    2. Mal kanten av PCR-røret med UV-aktivert lim, unngå innsiden av røret. Plasser PCR-røret lim forsiktig ned i midten av en plasmarenset dekslipp.
      MERK: For å unngå lim inne i kammeret, bruk den minste mengden lim for å få en tetning, og behandle straks med UV uten å støte eller forstyrre kammeret.
    3. Plasser kammeret under UV-lys med lang bølgelengde i 5-7 minutter for å herde limet.
  3. Tolags formasjon
    MERK: Monodisperserte SUV-er bør brukes i dette trinnet for effektiv tolagsdannelse. Tabell 1 gir oppskrifter på alle buffere som brukes i tolagsformasjonen, inkludert lager- og sluttbufferkonsentrasjoner.
    1. Tilsett 40 μL støttet lipid dobbeltlagsbuffer (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2; Tabell 1), 10 μL av 5 mM SUVer, og 1 μL av 100 mM CaCl2 til brønnen. Rist forsiktig kamrene fra side til side for å forstyrre SUV-ene, og rug deretter ved 37 °C i 20 minutter.
      MERK: For å begrense fordampning, inkuber i en dekket petriskål med en våtserviett.
  4. Vask bort overflødig lipider
    MERK: Dette trinnet fjerner overflødige SUV-er og fungerer som et bufferbyttetrinn. Det er veldig viktig å ikke skrape dobbeltlaget med pipettespissen mens du vasker; Hvis glasset eksponeres, vil septiner og mange andre proteiner binde seg irreversibelt og redusere den effektive proteinkonsentrasjonen.
    1. Etter inkubering, skyll dobbeltlaget 6x med 150 μL SLBB, pipetter opp og ned for å blande hver gang mens du unngår bobler.
      MERK: Tilsett 150 μL direkte til 50 μL buffer og SUVer som allerede er tilstede for totalt 200 μL i reaksjonsbrønnen.
    2. Når du er klar til å begynne å inkubere med septinene eller et annet protein, vask dobbeltlaget 6x med 150 μL reaksjonsbuffer (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg / ml BSA, 0,14% metylcellulose, 1 mM BME).
      MERK: For best resultat, gjør reaksjonsbufferen frisk og vær veldig forsiktig mens du blander inn reaksjonsbrønnen for å unngå bobler.
    3. På det siste vasketrinnet, fjern 125 μL reaksjonsbuffer, og la 75 μL ligge i brønnen. Tilsett 25 μL septiner fortynnet i septinlagringsbuffer (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) ved ønsket konsentrasjon og bilde ved TIRF-mikroskopi26.
      MERK: Når du setter opp denne analysen for første gang eller inkorporerer en ny lipidsammensetning, er det god praksis å sikre at lipider diffunderer fritt på overflaten ved hjelp av fluorescensgjenvinning etter fotobleking (FRAP). Mens utvinningsgraden vil være forskjellig for forskjellige lipidsammensetninger og iboende lavere enn for frittstående systemer, bør lipidene ikke være immobile.

Støttet lipid dobbeltlagsbuffer (SLBB)
Lager Volum Endelig konsentrasjon
2 M KCl 1,5 ml 300 mM
1 M HEPES 200 μL 20 mM
500 mM MgCl2 20 μL 1 mM
Vann 8 ml
Prereaksjonsbuffer (PRB)
Lager Volum Endelig konsentrasjon
2 M KCl 166 μL 33,3 mM
1 M HEPES 500 μL 50 mM
Vann 9,33 ml
Reaksjon Buffer
Lager Volum Endelig konsentrasjon
2 M KCl 166 μL 33,3 mM
1 M HEPES 300 μL 50 mM
10 mg/ml BSA 1,39 ml 1,39 mg/ml
1% metylcellulose 1,39 ml 0.0014
Vann Opptil 10 ml
BME 0,7 μL 1 mM
Septin lagringsbuffer (SSB)
Lager Volum Endelig konsentrasjon
2 M KCl 1,5 ml 300 mM
1 M HEPES 500 μL 50 mM
Vann Opptil 10 ml
BME 0,7 μL 1 mM

Tabell 1: Bufferkomponenter for fremstilling av støttet lipid dobbeltlag og reaksjoner. Volumer av lagerløsninger som er innlemmet i buffere og de endelige konsentrasjonene av hver komponent vises. SLB og PRB kan lagres ved romtemperatur og gjenbrukes mellom eksperimenter. Reaksjonsbuffer og SSB lages ferske for hvert forsøk.

2. Sfærisk støttede lipid dobbeltlag

MERK: Denne protokollen bruker silikamikrosfærer suspendert i ultrarent vann ved 10% tetthet. For ethvert arbeid på de kinetiske parametrene for proteinmontering er det viktig å strengt kontrollere det totale membranoverflaten mellom eksperimenter og krumninger. Tabell 2 viser korrigerte volumer av perler og buffer for å opprettholde 5 mm2 av totalt membranoverflate. Denne protokollen bygger på en tidligere publisert metode 8,18.

  1. Tolags formasjon
    MERK: Når det gjelder plane dobbeltlag, er det viktig å ha SUVer av høy kvalitet for robust dobbeltlagsformasjon. Tabell 2 viser volumet av perler fra en 10% tetthetsløsning og deres respektive SLBB-volumer som brukes til å oppnå et endelig overflateareal på 5 mm2 for et utvalg av perlediametre.
    1. Silikamikrosfærer (også referert til som perler) har en tendens til å bosette seg og klumpe seg sammen; å blande perlene og bryte opp noen klynger, virvel flasken i 15 s, deretter badesonikat i 1 min og virvel igjen i 15 s.
    2. Bland riktig volum av perler (tabell 2) med tilsvarende volum SLBB og 10 μL 5 mM SUV-er i et 0,5 ml mikrosentrifugerør med lav adhesjon.
    3. Rock perle-lipidblandingen ende-over-ende i 1 time ved romtemperatur. Sørg for at denne inkubasjonen gjøres på en rotator for å forhindre sedimentering.
  2. Klargjøre kamre på PEGylated deksler
    MERK: Når det gjelder plane dobbeltlag, brukes hjemmelagde kamre fra PCR-rør av plast for å støtte reaksjonsvolumene, men andre materialer med lav vedheft, for eksempel silikonbrønner, kan fungere like bra.
    1. Mens perlene gynger, tine en PEGylated deksler ved romtemperatur. Klipp et 0,2 ml PCR-rør og lim det på dekslippen som beskrevet i trinn 1.2. For 24 mm x 50 mm lysbilder kan opptil 10 kamre passe på ett lysbilde.
      MERK: Denne protokollen bruker 24 mm x 50 mm PEGylated glassdeksler som er forberedt på forhånd. Kort sagt, glassdeksler rengjøres grundig gjennom sonikering i aceton, metanol og 3 M KOH. Omslagslips blir deretter funksjonalisert med n-2-aminoetyl-3-aminopropyltrimetoksysilan og kovalent knyttet til mPEG-succinimidylvalerat. Ferdige PEGylaterte deksler lagres vakuumforseglet ved −80 °C. For en lignende passivasjonsprotokoll, se arbeidet til Gidi et al.27. Mens PEGylated glass coverlips er foreslått her, andre former for passivering, for eksempel BSA eller poly-L-lysin metoder, kan være effektive.
  3. Vask bort overflødig lipider
    MERK: Dette trinnet fungerer for å fjerne overflødige SUV-er og utføre bufferbytte. Perler vaskes 4x totalt med prereaksjonsbuffer (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). Tabell 3 viser spinnhastighetene i RCF for en rekke dråpediametre.
    1. Spinnperler på den angitte RCF i 30 s (tabell 3). Hvis du bruker flere perlestørrelser, må du holde perlene gyngende til det er deres tid å bli vasket.
      MERK: Det er ikke verdt å sedimentere større perler i samme spinn som mindre perler med mindre dråpesedimenteringshastighet for å spare tid. Dette kan føre til at perler holder seg til hverandre og kompromitterer dobbeltlagets integritet.
    2. Etter det første spinnet, fjern 50 μL supernatant og tilsett 200 μL PRB. Etter det andre og tredje spinnet, fjern 200 μL og tilsett 200 μL PRB. Etter fjerde spinn, fjern 200 μL og tilsett 220 μL PRB. Pipetter kraftig for hver vask.
      MERK: Det endelige resuspenderingsvolumet er forskjellig fra vaskene. Ikke virvle perlene etter inkubering med lipidene, da dette kan etterlate hull i dobbeltlagene. For å unngå sedimentering mens du arbeider med de andre perlestørrelsene eller setter opp andre deler av analysen, plasser dråpeblandingene tilbake på ende-over-ende-rotatoren.
  4. Forbereder reaksjonen
    MERK: Denne reaksjonen er utformet for å bevare reaksjonens totale membranoverflate ved 5 mm2 og for å produsere en endelig reaksjonstilstand på 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg / ml BSA, 0,1% metylcellulose og 1 mM BME.
    1. Hvis du gjør en konkurranseanalyse med flere perlestørrelser, lag en 1: 1-blanding ved å blande like store mengder av hver perlestørrelse sammen. Bland deretter 29 μL av ønsket perleblanding (eller av en enkelt perle) med 721 μL RXN-buffer.
      MERK: Det er viktig å blande perlene grundig på hvert trinn med en pipette for å unngå tette klynger av perler; Dette vil resultere i en jevnere perlefordeling og nøyaktig total overflateareal.
    2. Bland 75 μL fortynnede perler og 25 μL protein fortynnet i SSB til brønnene.
      MERK: Forfatterne viser vanligvis gjærseptinkomplekser ved 1-50 nM.
    3. Hvis du måler septiner ved steady-state, inkuberes ved romtemperatur i 1 time, og deretter bildet ved enten nær-TIRF eller konfokal mikroskopi.
Dråpediameter (μm) Volum av godt blandede perler (μL) Volum av SLB-buffer (μL) Volum av SUVer (μL)
6.46 8.94 61.1 10
5.06 7 63 10
3.17 4.39 65.6 10
0.96 1.33 68.7 10
0.54 0.75 69.3 10
0.31 0.43 69.6 10

Tabell 2: Normaliserte volumer av mikrosfærer. For å opprettholde et likt overflateareal av hver dråpestørrelse og for å holde det totale membranoverflaten konsistent mellom forsøkene, ble volumer for hver perlestørrelse og buffer som normaliserte det totale overflatearealet beregnet.

Dråpediameter (μm) Sedimenteringshastighet (RCF)
0.31 4.5
0.54 4.5
0.96 2.3
3.17 0.8
5.06 0.3

Tabell 3: Sedimentasjonshastigheter for mikrosfærer med varierende diameter. For hver dråpediameter ble de viste minimum sedimenteringshastighetene brukt til å pelletere perlene for å vaske bort ubundne liposomer.

3. Stangstøttede lipid dobbeltlag

MERK: I motsetning til de andre analysene som presenteres her, tillater ikke stavanalysen nøye kontroll av det totale membranoverflaten. Man kan være konsistent i mengder og volum mellom forsøkene, men fordi dette resulterer i stenger av forskjellige lengder og diametre, er det vanskelig å ekstrapolere det totale membranoverflaten i reaksjonen. Selv om dette er en utmerket analyse for å utforske krumningssensor med flere krumninger på en enkelt overflate og har vært nyttig for å utforske septin ultrastruktur, anbefales det ikke for kinetiske målinger. Denne metoden ble tidligere rapportert18 og blir utvidet her.

  1. Innhenting av borosilikatstenger fra glassmikrofiberfiltre
    1. Riv et enkelt 42,5 mm GF/C glassmikrofiberfilter i små biter og legg dem i et 100 ml beger med 60 ml 100 % etanol. Bad-sonikat til løsningen blir ugjennomsiktig; dette kan ta så lite som 20-30 min med et fint strimlet filter.
      MERK: Sonicate grundig å bryte opp store biter; jo mer dissosiert/ugjennomsiktig, jo bedre.
    2. Dekk løsningen med film og oppbevar oppløsningen ved romtemperatur over natten.
  2. Danner dobbeltlag på stengene
    MERK: Dette trinnet utføres med overskytende lipider for å oppnå fullstendig stangdekning, da det er umulig å kvantifisere det totale overflatearealet i denne metoden.
    1. Neste dag vil etanoloppløsningen bli avgjort (trinn 3.1.2.), så bland den godt før bruk. Kombiner 10 μL stangløsning og 70 μL SLBB.
    2. Spinn med toppfart i en mini sentrifuge i 30 s og fjern 50 μL av supernatanten. Resuspender i ytterligere 50 μL SLBB og gjenta spinnet i totalt fire vasker for å fortynne etanolen.
      MERK: Stangstøtter vil ikke danne en solid pellet i bunnen av røret. De er i stedet smurt langs siden av røret; dette gjør dem vanskelige å bevare helt når de vaskes. Siden det totale overflatearealet i denne analysen ikke er kontrollert, er det greit hvis de blir forstyrret.
    3. Kombiner 10 μL godt blandet stangløsning med 50 μL av 5 mM SUVer og 20 μL SLBB. Inkuber i 1 time ved romtemperatur, roterende ende-over-ende som når du danner dobbeltlag på mikrosfærene.
  3. Vask bort overflødig lipider
    1. I likhet med trinn 3.2.2 spinner du lipidstangen med topphastighet i en minisentrifuge i 30 s for å pelletere de membranbelagte stengene ut av oppløsningen.
    2. Etter det første spinnet, fjern 50 μL av supernatanten og tilsett 200 μL PRB. Etter det andre og tredje spinnet, fjern 200 μL og tilsett 200 μL PRB. Etter fjerde spinn, fjern 200 μL, tilsett 220 μL PRB og pipetter kraftig for å blande.
  4. Forbereder reaksjonen
    1. I et 1,5 ml mikrosentrifugerør blandes 721 μL reaksjonsbuffer med 29 μL stangoppløsning. Bland godt.
    2. I et 0,2 ml PCR-rør kombinerer du 75 μL stenger i reaksjonsbuffer og 25 μL septiner ved ønsket konsentrasjon, fortynnet i SSB. La den ruge ved romtemperatur i minst 1 time.
  5. Forberedelse til skanning elektronmikroskopi
    1. Etter inkubering, tilsett 100 μL septin-stangblandingen på en rund, PEG-belagt 12 mm dekslipp og inkuber ved romtemperatur i 1 time i en lukket petriskål.
    2. Fest prøven ved å fylle bunnen av petriskålen (10 ml skal være nok) med 2,5% glutaraldehyd i 0,05 M natriumkakodylat (NaCo), pH 7,4, i 30 minutter. Aspirer væsken med en glasspipette. Vask prøven ved å inkubere den med 10 ml 0,05 M NaCo i 5 minutter og gjenta i totalt to vasker.
    3. Postfix i 0,5% OsO4 cacodylate buffer i 30 min, og vask deretter 3x i 0,05 M NaCo (5 min/vask).
    4. Inkuber prøven med 1% garvesyre i 15 minutter, og vask deretter i NaCo 3x. Rug i 15 minutter i 0,5 % OsO4 og vask 3x med NaCo.
    5. Dehydrer prøvene ved å øke etanolkonsentrasjonen: 30% EtOH i 5 minutter, 2x; 50% EtOH i 5 min; 75% EtOH i 5 min; og 100% EtOH i 5 min, 2x. Følg med ytterligere 10 min inkubasjon.
    6. Inkuber i overgangsvæske (heksametyldisilazan) 3x (5 min, 10 min, deretter 5 min).
    7. Tillat å lufttørke, og legg deretter prøvene i en tørkemaskin til sputter-belegg. Sputter-coat 4 nm laget med en gull / palladium legering og deretter bilde på en skanning elektronmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter tilberedning av hver SLB kan septiner eller protein av interesse inkuberes med ønsket støtte og avbildes via TIRFM, konfokal mikroskopi eller SEM. Resultatene vist her bruker septiner rekombinant uttrykt og renset fra E. coli17. Ved å bruke TIRFM på plane SLBer er det mulig å bestemme lengden på filamenter og deres fleksibilitet, måle diffusjonskoeffisientene og observere montering over tid28,29. For å samle målinger av høyeste kvalitet, er det først nødvendig å fastslå kvaliteten på dobbeltlag, spesielt når du forbereder dem for første gang eller når du endrer lipidsammensetninger. En visuell inspeksjon av proteinfordelingen på dobbeltlagene av TIRFM kan bidra til å identifisere regioner i dobbeltlaget som har blitt riper eller er misformet. Proteinfordelingen skal være homogen (figur 3A), og det skal ikke være hull eller hull i dobbeltlaget (figur 3B). Det er best å unngå membraner med hull, som kan dannes fra støvforurensning eller flekker fra glidehåndtering, da dette kan endre proteinfordelingen i andre områder av dobbeltlaget. For å visualisere selve membranen, kan spor rhodamin-PE inkorporeres i SUVer for tolagsdannelse. I høykvalitets dobbeltlag vil feltet vises jevnt (bilder vises ikke), men hvis liposomer er gamle eller hvis vaskene ikke er strenge nok, kan det samle seg uutbrudd og tubulære liposomer på overflaten (figur 3C). I tillegg, mens faste støtter vil hemme fri diffusjon av lipider8, bør lipidene ikke være immobile. FRAP-eksperimenter kan brukes til å vurdere mobiliteten til lipider på plane dobbeltlag, som kan variere etter sammensetning og skal vise utvinningshastigheter i størrelsesordensekunder 30.

Sfæriske støtter kan brukes til å undersøke proteinbinding på membraner av definerte krumninger enten isolert (en krumning) eller med flere membrankrumninger i samme brønn for å observere konkurranse mellom krumninger 6,18. Nær-TIRFM på perler >1 μm kan også brukes til å måle antall foreningshendelser for et gitt område27. Som med plane dobbeltlag, bruker vi rhodamin-PE for å lete etter glatt dobbeltlagsavsetning (figur 4A), det vil si ingen lipidklumper, som indikerer multilamellalitet eller unburst liposomer (figur 4B), og ingen hull i dobbeltlaget (figur 4C). For å måle den totale proteinadsorpsjonen eller proteinadsorpsjonen over tid på buede overflater, er det nødvendig å isolere individuelle perler fra hverandre for å skape et diskret volum for hvilket sum lipidintensitet og sumseptinintensitet kan måles. Dermed bør perlene være godt separert i stedet for klumpet sammen som i figur 4D. Vi tar for oss feilsøkingsalternativer for alle disse potensielle problemene i diskusjonsdelen.

Denne SLB-analysen kan også brukes på stangstøtter, som gir et miljø for proteiner for å prøve flere krumninger på en enkelt overflate. Sammenkobling av denne analysen med skanningelektronmikroskopi gjør det mulig for brukeren å undersøke krumning preferanse, justering og lengdefordeling av septiner18 eller andre proteiner av interesse. Selv om det ligner på de andre analysene som presenteres her, tillater ikke stavanalysen nøye kontroll av total membranoverflate på grunn av den heterogene naturen til substratet som er avledet fra filterpapir. Materialegenskapene til filterpapiret som brukes her resulterer i stenger av forskjellige lengder og diametre (figur 5A); Dette er nyttig for å utforske proteinkrumning og organisering på buede overflater (figur 5B), men fordi forholdet mellom protein og membran ikke kan kontrolleres, har stavene begrenset nytte for å generere metningsbindende kurver eller måle parametere som bindingskonstanter.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over støttet lipid dobbeltlagsdannelse på støtter med forskjellige krumninger. SUV-er inkuberes med solide støtter av forskjellige geometrier for å endre krumningene som er tilgjengelige for prøvetaking på en gitt membran. SUV-er adsorberer på den faste støtteoverflaten og brister for å skape lipid dobbeltlag. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk oppsett av reaksjonskammer. For å forberede tilpassede kamre kuttes et 0,2 ml PCR-rør der røret begynner å avta og ved hetten (røde stiplede linjer). Den uklippede kanten av kuttrøret blir deretter belagt med et tynt lag UV-aktivert lim (blått) og plassert lim ned på en deksler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative TIRF-mikrografer av plane dobbeltlag. (A) Et representativt bilde av et høykvalitets lipid dobbeltlag (75% DOPC, 25% Soya PI) med ikke-polymeriserbare septiner bundet (grønn). Protein er ikke clustering i noen bestemte regioner, og det er ingen liposomer festet til membranen og ingen hull. (B) Dette dobbeltlaget ble laget med dårlig rengjorte glassdeksler og viser det som ser ut til å være "hull" (hvite piler) i membranen der det er færre septiner. Septiner kan sees overfylt på kantene av disse feilene i dobbeltlaget (betegnet med de hvite pilene i det zoomede området til høyre). (C) Et representativt bilde av et dobbeltlag av lav kvalitet ved bruk av spor rhodamin-PE. Unburst liposomer og tubulære lipider er synlige på overflaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative mikrografer av lipidbelagte mikrosfærer. Representative bilder fra konkurranseanalyser hvor lipidbelagte perler (75% DOPC, 25% Soya PI, 0,1% Rhodamin PE) med diametre på 0,3 μm, 0,5 μm, 1 μm, 3 μm og 5 μm ble blandet. Alle bilder er maksimale Z-projeksjoner. (A) Representativt bilde av en høykvalitets blanding av lipidbelagte mikrosfærer. De sfæriske støttene er jevnt belagt av membranen, og det er få perleklynger. (B) Representativt bilde av ujevnt membranbelegg, sannsynligvis forårsaket av utilstrekkelig vasking av overflødig lipider. (C) Representativt bilde av perler med hull i membrandekning (hvite piler) på grunn av feil håndtering. (D) Representativt bilde av tett grupperte perler, sannsynligvis forårsaket av utilstrekkelig blanding gjennom hele prosedyren, spesielt når du kombinerer de forskjellige perlene sammen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative elektronmikrografier av lipid- og septinbelagte stenger. (A) SEM-bilde som viser fordelingen av lipidbelagte (75% DOPC, 25% Soya PI, 0,1% Rhodamine PE) stanglengder og diametre. (B) Kanten av en isolert membranbelagt stang med septinfilamenter justert langs aksen for positiv krumning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cellemembraner tar mange forskjellige former, krumninger og fysisk-kjemiske egenskaper. For å studere nanometerskala maskiner gjennom hvilke celler bygger mikrometerskala samlinger, er det nødvendig å designe minimale rekonstitueringssystemer av membranmimetika. Denne protokollen presenterer teknikker som nøyaktig styrer både membrankrumning og sammensetning, samtidig som brukeren enkelt kan ta kvantitative fluorescensmålinger ved hjelp av allment tilgjengelige mikroskopiteknikker.

De mest kritiske komponentene i denne protokollen er å montere brønner på riktig overflate og håndtere lipidene. Brønnene beskrevet her er håndlaget ved hjelp av PCR-rør og UV-aktiverte lim; Det er viktig å ikke få lim inne i reaksjonsområdet under montering. Dette kan kontrolleres for under forsøket ved å avbilde langs kantene av brønnen og se etter høyproteinadsorpsjon på dekselglasset. Brukeren kan velge å bruke alternative materialer til brønner, for eksempel silikon, som kan bestilles kommersielt, men den presenterte metoden gir solide brønner som ikke vil skifte eller lekke og kan støtte større reaksjonsvolumer. Overflaten på dekkglasset, i våre hender, har vært svært viktig for å danne plane dobbeltlag. Optimalisering av plasmarengjøringstider eller til og med merket av dekkglass kan være nødvendig for å se jevn dannelse av dobbeltlagene, da passende overflatebehandling og ladning er avgjørende for vesikkeladsorpsjon og fusjon 31,32,33. Ved oppsett av disse forsøkene for første gang eller arbeid med nye lipidsammensetninger, bør fluorescensgjenvinning etter fotobleking (FRAP) eksperimenter brukes til å vurdere membranets fluiditet sammenlignet med frittstående systemer30. Det forventes at støttesystemer vil være mindre flytende enn sine frittstående kolleger, men ikke immobile12.

Ved vurdering av dobbeltlagskvalitet ved fluorescens er det viktig å se etter unburst liposomer eller defekter i dobbeltlaget (figur 3C), da disse kan endre lokal proteinadsorpsjon. Følgende feilsøkingsalternativer kan vurderes. a) Man kan justere SUV-preparatet for å forbedre dobbeltlagskvaliteten. Sonikering, fryse-tine og ekstrudering er alle vanlige metoder som kan variere i letthet og suksess basert på lipidsammensetninger. I våre hender resulterer en fullstendig avklart SUV-løsning med en monodispersert størrelsesfordeling i de mest homogene dobbeltlagene. Dynamisk lysspredning (DLS) kan brukes til å vurdere størrelsesfordeling25. b) Man kan øke forskjellen i saltkonsentrasjon mellom innsiden av SUV-ene og den eksterne bufferen. Ved å redusere den indre ionkonsentrasjonen (eller øke den eksterne), øker osmotisk stress på SUVene sannsynligheten for brudd31. Alternativt kan endring av monovalent kation tilstede endre kinetikken til SLB-dannelse og hjelpe til med å optimalisere SLBer av nye lipidsammensetninger34. c) Man kan øke antall eller kraft av vasker. Forfatternes erfaring er at kraftig blanding under vasken fører til renere dobbeltlag og ser ikke ut til å være forstyrrende; i stedet kommer det største problemet fra å skrape dobbeltlaget ved et uhell med pipettespisser, som vil vises som en gash i membranen. For buede dobbeltlag er det best å minimere håndteringen med smale pipettespisser og blande forsiktig når du utfører vasketrinnene, spesielt for større (>1 μm) perler, da membranen kan skjæres fra glassperlene. Hvis det observeres vedvarende hull i de sfæriske membranlagene (figur 4C), kan det hjelpe å øke bredden på pipettespissene (ved å kutte av enden av spissen eller kjøpe brede spisser) og redusere håndteringen så mye som mulig, mens du fortsatt blander dråpeløsningene helt. Et vanlig teknisk problem med denne teknikken er perlenes tendens til å klumpe seg sammen (figur 4D). Dette kan delvis løses ved å øke sonikeringstiden før dobbeltlagsdannelse; Noen klynger er imidlertid uunngåelige, da membranbelagte perler også kan ha en tendens til å klumpe seg sammen over tid i brønnen. Klumpete perler bør unngås for kvantitative analyser.

Begrensninger for kvantitative målinger av enkeltmolekyldynamikk på plane dobbeltlag inkluderer behovet for å holde seg i lave konsentrasjoner for å nøyaktig spore og telle partiklene. Dette kan imidlertid rettes opp ved å undermerke proteinet av interesse under oppkjøpet for å redusere antall partikler som er synlige under sporing35. I tillegg ble sfæriske og stav-SLBer utviklet spesielt for å kvantifisere krumningsfølsomheten til proteiner på mikrometerskalamembraner, og silikamikrosfærene som brukes her er bare tilgjengelige ned til 100 nm i diameter, på hvilket tidspunkt de er diffraksjonsbegrenset puncta når de ses ved lysmikroskopi. Dermed vil de som ønsker å vurdere presis krumningsspesifisitet på mindre diametre, ikke kunne gjøre det ved hjelp av denne metoden. Imidlertid vil denne teknikken fortsatt gi verdifull informasjon om trenden med krumningspreferanse og tillate disseksjon av krumningsavhengige forsamlinger.

Sammenlignet med frittstående lipid dobbeltlagssystemer, er denne teknikken mottagelig for et bredt spekter av bufferforhold og krever ikke forsiktig osmotisk balansering under forberedelse. I tillegg, fordi den bruker glassstøtter, synker dobbeltlagene lett til bunnen av brønnen, og fjerner behovet for tethering eller bruk av sukrose eller andre fortykningsmidler36. Mens frittstående lipid dobbeltlagssystemer gir et nyttig middel til å undersøke membrandeformasjon av membranbindende proteiner, er det vanskelig å studere forholdet mellom membrankrumning og kompleks montering. I motsetning til lett deformerbare membransystemer, tillater denne tilnærmingen brukeren å bruke en rekke lipidsammensetninger uten den indre formen til individuelle lipidarter som dikterer membranets globale geometri. Til slutt tillater stangformede SLBer prøvetaking av flere krumninger på samme kontinuerlige membran for proteiner av interesse (figur 5B), som er unikt informativ for evaluering av krumningsavhengige sammenstillinger eller colocalization av flere komponenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) Grant nr. R01 GM-130934 og National Science Foundation (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. og K.S.C. ble delvis støttet av et stipend fra National Institute of General Medical Sciences under pris T32 GM119999.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural Watson 137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes USA Scientific 1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME) Sigma-Aldrich M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips Thermo Scientific 152450 Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
Egg Liss Rhodamine PE Avanti Polar Lipids 810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade VWR 16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer VWR 11652
Ethanol, 200 proof Fisher Scientific 04-355-223EA
HEPES Sigma Aldrich H3375-1KG
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191
Magnesium chloride VWR 7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers Matsunami Discontinued 22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres Bangs Laboratories, Inc. Depends on size: SS0200*-SS0500* Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive Norland Thorlabs NOA 68 Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide Millipore Sigma 20816-12-0
Parafilm VWR 52858-000
Plasma Cleaner Plasma Etch PE-25 Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride VWR 0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm   VWR 64-0712
Sonicator bath Branson 1510R-MT Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI Avanti Polar Lipids 840044
Tabletop centrifuge Eppendorf 22331
UV Lamp Spectroline ENF-260C 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper VWR 28455-030 42.5 mm diameter, Grade GF/C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
  2. Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
  3. Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
  4. Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
  5. Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  6. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
  7. Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
  8. Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
  9. Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).
  10. Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
  11. Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
  12. Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
  13. Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).
  14. Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
  15. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  16. Lou, H. -Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  17. Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
  18. Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
  19. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  20. Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).
  21. Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
  22. Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
  23. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  24. Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
  25. Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
  26. Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).
  27. Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
  28. Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
  29. Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
  30. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).
  31. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
  32. Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
  33. Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
  34. Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
  35. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
  36. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).

Tags

Biokjemi utgave 185
Rekonstituering av septinmontering ved membraner for å studere biofysiske egenskaper og funksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Curtis, B. N., Vogt, E. J. D.,… More

Curtis, B. N., Vogt, E. J. D., Cannon, K. S., Gladfelter, A. S. Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions. J. Vis. Exp. (185), e64090, doi:10.3791/64090 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter