הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור

Felix A. Kyere; Ian Curtin; Oleh Krupa; Carolyn M. McCormick; Mustafa Dere; Sarah Khan; Minjeong Kim; Tzu-Wen Winnie Wang; Qiuhong He; Guorong Wu; Yen-Yu Ian Shih; Jason L. Stein

doi:10.3791/64096

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור

3.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64096

⸱

1 באוגוסט 2022

Felix A. Kyere^*¹^,² , Ian Curtin^*¹^,² , Oleh Krupa¹^,² , Carolyn M. McCormick¹^,² , Mustafa Dere³ , Sarah Khan³^,⁷ , Minjeong Kim⁷ , Tzu-Wen Winnie Wang⁴^,⁵^,⁶ , Qiuhong He⁴^,⁵^,⁶ , Guorong Wu³ , Yen-Yu Ian Shih⁴^,⁵^,⁶ , Jason L. Stein¹^,²

¹UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, ²Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, ³Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, ⁴Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁵Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁶Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁷Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטות לביצוע הדמיית תהודה מגנטית, ניקוי ותיוג חיסוני של מוחות עכברים שלמים באמצעות iDISCO+, ולאחר מכן תיאור מפורט של הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה של יריעות אור, וניתוחים במורד הזרם באמצעות NuMorph.

תקציר

ניקוי רקמות ואחריו מיקרוסקופיה של יריעות אור (LSFM) מאפשרים הדמיה ברזולוציה תאית של מבנה מוח שלם, ומאפשרים ניתוח כמותי של שינויים מבניים הנגרמים על ידי הפרעות גנטיות או סביבתיות. הדמיה של מוח שלם מביאה לכימות מדויק יותר של תאים ולחקר הבדלים ספציפיים לאזור שעלולים להתפספס במיקרוסקופיה נפוצה של רקמות שנחתכו פיזית. שימוש במיקרוסקופיה של יריעות אור כדי לצלם מוחות מנוקים מגביר מאוד את מהירות הרכישה בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית. אף על פי שתמונות אלה מייצרות כמויות גדולות מאוד של נתונים מבניים על המוח, רוב הכלים החישוביים המבצעים כימות תכונות בתמונות של רקמות מנוקות מוגבלים לספירת אוכלוסיות תאים דלילות, ולא לכל הגרעינים.

כאן אנו מדגימים את NuMorph (מורפומטריה מבוססת גרעין), קבוצה של כלי ניתוח, כדי לכמת את כל הגרעינים והסמנים הגרעיניים באזורים מבוארים במוח עכבר ביום 4 (P4) לאחר הלידה לאחר ניקוי והדמיה במיקרוסקופ של יריעת אור. אנו מתארים דימות תהודה מגנטית (MRI) למדידת נפח המוח לפני התכווצות הנגרמת על ידי שלבי התייבשות של ניקוי רקמות, ניקוי רקמות בשיטת iDISCO+, כולל תיוג חיסוני, ולאחר מכן מיקרוסקופיה של יריעות אור באמצעות פלטפורמה זמינה מסחרית לצילום מוחות עכברים ברזולוציה תאית. לאחר מכן אנו מדגימים את צינור ניתוח התמונות הזה באמצעות NuMorph, המשמש לתיקון הבדלי עוצמה, לתפירת אריחי תמונה, יישור ערוצים מרובים, ספירת גרעינים וביאור אזורי מוח באמצעות רישום לאטלסים הזמינים לציבור.

עיצבנו גישה זו תוך שימוש בפרוטוקולים ובתוכנות הזמינים לציבור, ומאפשרים לכל חוקר בעל המיקרוסקופ והמשאבים החישוביים הדרושים לבצע טכניקות אלה. כלים אלה של ניקוי רקמות, הדמיה וחישוב מאפשרים מדידה וכימות של הארגון התלת-ממדי (3D) של סוגי תאים בקליפת המוח, והם אמורים להיות ישימים באופן נרחב לכל תכנון מחקר של עכברי בר/נוקאאוט.

מבוא

דימות מוחי שלם ברזולוציה של תא בודד הוא אתגר חשוב במדעי המוח. תמונות מוח ברזולוציה תאית מאפשרות ניתוח מפורט ומיפוי ברמת המערכת של מעגלי המוח וכיצד מעגלים אלה מופרעים על ידי גורמי סיכון גנטיים או סביבתיים להפרעות נוירופסיכיאטריות, התנהגות תאית בעוברים מתפתחים, כמו גם מעגלים עצביים במוח הבוגר ^1,2,3. ישנן שיטות היסטולוגיות מרובות המאפשרות תמונות ברזולוציה גבוהה של המוח התלת-ממדי המשוחזר; עם זאת, טכניקות אלה דורשות ציוד מיוחד ויקר, ייתכן שאינן תואמות את התווית החיסונית, והאופי הדו-ממדי (2D) של שיטות מסוימות עלול להוביל לנזק לרקמות ולגזירה במהלך חתך ^4,....