Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Felix A. Kyere; Ian Curtin; Oleh Krupa; Carolyn M. McCormick; Mustafa Dere; Sarah Khan; Minjeong Kim; Tzu-Wen Winnie Wang; Qiuhong He; Guorong Wu; Yen-Yu Ian Shih; Jason L. Stein

doi:10.3791/64096

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Articolo metodologico

Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

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DOI:

10.3791/64096

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1 agosto 2022

Felix A. Kyere^*¹^,² , Ian Curtin^*¹^,² , Oleh Krupa¹^,² , Carolyn M. McCormick¹^,² , Mustafa Dere³ , Sarah Khan³^,⁷ , Minjeong Kim⁷ , Tzu-Wen Winnie Wang⁴^,⁵^,⁶ , Qiuhong He⁴^,⁵^,⁶ , Guorong Wu³ , Yen-Yu Ian Shih⁴^,⁵^,⁶ , Jason L. Stein¹^,²

¹UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, ²Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, ³Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, ⁴Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁵Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁶Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁷Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive i metodi per condurre la risonanza magnetica, la pulizia e l'immunomarcatura di cervelli di topo intatti utilizzando iDISCO +, seguita da una descrizione dettagliata dell'imaging utilizzando la microscopia a foglio di luce e analisi a valle utilizzando NuMorph.

Abstract

La pulizia dei tessuti seguita dalla microscopia a foglio luminoso (LSFM) consente l'imaging a risoluzione cellulare della struttura cerebrale intatta, consentendo l'analisi quantitativa dei cambiamenti strutturali causati da perturbazioni genetiche o ambientali. L'imaging dell'intero cervello si traduce in una quantificazione più accurata delle cellule e nello studio delle differenze specifiche della regione che possono essere perse con la microscopia comunemente usata del tessuto fisicamente sezionato. L'uso della microscopia a foglio di luce per visualizzare i cervelli chiari aumenta notevolmente la velocità di acquisizione rispetto alla microscopia confocale. Sebbene queste immagini producano grandi quantità di dati strutturali cerebrali, la maggior parte degli strumenti computazionali che eseguono la quantificazione delle caratteristiche nelle immagini di tessuto eliminato si limitano a contare popolazioni cellulari sparse, piuttosto che tutti i nuclei.

Qui, dimostriamo NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un gruppo di strumenti di analisi, per quantificare tutti i nuclei e i marcatori nucleari all'interno delle regioni annotate di un cervello di topo postnatale giorno 4 (P4) dopo la pulizia e l'imaging su un microscopio a foglio di luce. Descriviamo la risonanza magnetica (MRI) per misurare il volume del cervello prima del restringimento causato dalle fasi di disidratazione della pulizia dei tessuti, la pulizia dei tessuti utilizzando il metodo iDISCO +, inclusa l'immunomarcatura, seguita dalla microscopia a foglio luminoso utilizzando una piattaforma disponibile in commercio per visualizzare il cervello dei topi a risoluzione cellulare. Dimostriamo quindi questa pipeline di analisi delle immagini utilizzando NuMorph, che viene utilizzato per correggere le differenze di intensità, cucire le tessere dell'immagine, allineare più canali, contare i nuclei e annotare le regioni del cervello attraverso la registrazione agli atlanti disponibili pubblicamente.

Abbiamo progettato questo approccio utilizzando protocolli e software disponibili pubblicamente, consentendo a qualsiasi ricercatore con il microscopio e le risorse computazionali necessarie di eseguire queste tecniche. Questi strumenti di pulizia dei tessuti, imaging e calcolo consentono la misurazione e la quantificazione dell'organizzazione tridimensionale (3D) dei tipi di cellule nella corteccia e dovrebbero essere ampiamente applicabili a qualsiasi progetto di studio su topi wild-type/knockout.

Introduzione

L'imaging dell'intero cervello con risoluzione di una singola cellula è una sfida importante nelle neuroscienze. Le immagini cerebrali a risoluzione cellulare consentono un'analisi dettagliata e la mappatura a livello di sistema dei circuiti cerebrali e di come tali circuiti siano interrotti da fattori di rischio genetici o ambientali per disturbi neuropsichiatrici, comportamento cellulare negli embrioni in via di sviluppo e circuiti neurali nel cervello adulto ^1,2,3. Esistono diversi metodi istologici che consentono immagini ad alta risoluzione del cervello 3D ricostruito; t....