Die Peel-Blot-Technik: Eine Kryo-EM-Probenvorbereitungsmethode zur Trennung einzelner Schichten von mehrschichtigen oder konzentrierten biologischen Proben

Zusammenfassung

Die Peel-Blot-Technik ist eine Kryo-EM-Gittervorbereitungsmethode, die die Trennung von mehrschichtigen und konzentrierten biologischen Proben in einzelne Schichten ermöglicht, um die Dicke zu reduzieren, die Probenkonzentration zu erhöhen und die Bildverarbeitung zu erleichtern.

Zusammenfassung

Die Peel-Blot-Kryo-EM-Gittervorbereitungstechnik ist eine deutlich modifizierte Rückinjektionsmethode mit dem Ziel, eine Reduzierung der Schichten von mehrschichtigen Proben zu erreichen. Diese Entfernung von Schichten vor dem Einfrieren kann dazu beitragen, die Probendicke auf ein Niveau zu reduzieren, das für die Kryo-EM-Datenerfassung geeignet ist, die Probenebenheit zu verbessern und die Bildverarbeitung zu erleichtern. Die Peel-Blot-Technik ermöglicht die Trennung von mehrschichtigen Membranen in einzelne Schichten, von geschichteten 2D-Kristallen in einzelne Kristalle und von gestapelten, blattartigen Strukturen löslicher Proteine, die ebenfalls in einzelne Schichten getrennt werden können. Die hohe Probendicke dieser Probentypen stellt häufig unüberwindliche Probleme für die Kryo-EM-Datenerfassung und Kryo-EM-Bildverarbeitung dar, insbesondere wenn der Mikroskoptisch für die Datenerfassung geneigt werden muss. Darüber hinaus können Gitter mit hohen Konzentrationen jeder dieser Proben für eine effiziente Datenerfassung vorbereitet werden, da die Probenkonzentration vor der Gittervorbereitung erhöht und die Peel-Blot-Technik angepasst werden kann, um eine dichte Verteilung der einschichtigen Probe zu erreichen.

Einleitung

Die Peel-Blot-Technik wurde entwickelt, um gestapelte zweidimensionale Kristalle von Membranproteinen in einzelne Schichten zu trennen, um entsprechend dünne Proben für die Kryo-EM 2D- und 3D-Datenerfassung zu erhalten und die Bildverarbeitung zu erleichtern¹. Das Protokoll eignet sich in ähnlicher Weise für andere Arten von mehrschaligen Proben sowie zum Erreichen hoher Probenkonzentrationen beider Probentypen auf dem Gitter, ohne die Dicke in Z zu erhöhen.

Die Reduktion der Probenschichten auf eine Schicht wird durch die Anwendung einer Kombination aus Kapillardruck und Scherkräften in einem Protokoll erreicht, das....

Protokoll

1. Vorbereitungsschritte für die Peel-Blot-Technik

HINWEIS: Zur Vorbereitung müssen die folgenden Elemente nebeneinander platziert werden.

1. Stapeln Sie zwei Stück Filterpapier im Porenformat 20-25 μm (siehe Materialtabelle).
2. Legen Sie eine ~8 cm x 10 cm lange Paraffinfolie mit dem Papier nach oben neben das Filterpapier.
3. Legen Sie ein Stück Submikron-Filterpapier auf zwei weitere Stücke Filterpapier #4 (Abbildung 1-1).
4. Positionieren Sie die Antikapillarzange mit dem gebeugten Bein nach oben und dem geraden Bein nach unten.....

Ergebnisse

Ein erfolgreiches Peel-Blot-Experiment führt zu einzelnen Probenschichten mit oft hohen Konzentrationen. Es ist zu erwarten, dass einige Regionen in den meisten Rasterquadraten immer noch mehrere Schichten enthalten, insbesondere bei einer geringeren Anzahl von Iterationen der Peel-Blot-Schritte. Die Mehrheit der Gitterquadrate wird jedoch ausgedehnte Regionen von Einzelschichten enthalten, wie sie für 2D-Kristalle der menschlichen Leukotrien-C4-Synthase (Abbildung 2) und Liposomen (hinzugefügt in Schritt 3.2,.......

Diskussion

Der Peel-Blot ist eine leistungsstarke Methode, um das Stapeln und die Dicke von mehrschichtigen 2D-Kristallen und ähnlichen Proben für die Kryo-EM-Datenerfassung und Bildverarbeitung zu überwinden. Eine Entscheidung über die Verwendung des Peel-Blots basiert auf biologischen Parametern der Probe und muss ebenfalls bewertet werden, sobald ein 3D-Kryo-EM-Modell verfügbar ist. Die biologische Bedeutung von Kontakten und die potenzielle Flexibilität von Kontaktregionen werden bei dieser Bewertung besonders wichtig sein.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
600-Mesh-Gitter	SPI	2060-C-XA
Anti-Kapillar-Pinzette	Ted Pella	510-5
Kohlenstoff zur Beschichtung von Glimmer
Cryo-EM			Kryo-EM-Gitter können bei 120 kV oder 200 kV gesiebt werden. Hochauflösende Daten werden bei 300 kV gesammelt.
Dumpont #5 Pinzette	Ted Pella	5622
Gitterbox für Kryo-EM-Lagerung	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Flüssigstickstoff
Glimmer	Ted Pella	56	Der Glimmer ist kohlenstoffbeschichtet und in Quadrate geschnitten, die etwas größer sind als ein TEM-Gitter. Die Kohlenstoffdicke muss möglicherweise optimiert werden, um dünnen Kohlenstoff zu vermeiden, der bei mehreren Schälklecksen leicht bricht.
Negativfärbung			1-2% Uranylacetat ist für viele Proben geeignet. Andere Flecken wie Phosphowolframsäure können substituiert werden.
Parafilm
Polystyrol-Behälter			Wird zum Verglasen des Peel-Blot-Gitters verwendet. Ein Versandbehälter aus Styropor kann zu diesem Zweck recycelt und mit Aluminiumfolie ausgekleidet werden.
Submikron-Filterpapier	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmissionselektronenmikroskop	JEOL	JEM-1400	Jedes TEM, das mit einer Beschleunigungsspannung von 80-120 kV betrieben wird, eignet sich für das Screening von negativ gefärbten Gittern.
Trehalose			Bereiten Sie eine 4%ige Trehalose-Lösung vor.
Whatman #4 Filterpapier	MilliporeSigma	WHA1004150	Dies entspricht dem 20-25 μ m Filterpapier im Porenformat im Protokoll.