Summary
Die Peel-Blot-Technik ist eine Kryo-EM-Gittervorbereitungsmethode, die die Trennung von mehrschichtigen und konzentrierten biologischen Proben in einzelne Schichten ermöglicht, um die Dicke zu reduzieren, die Probenkonzentration zu erhöhen und die Bildverarbeitung zu erleichtern.
Abstract
Die Peel-Blot-Kryo-EM-Gittervorbereitungstechnik ist eine deutlich modifizierte Rückinjektionsmethode mit dem Ziel, eine Reduzierung der Schichten von mehrschichtigen Proben zu erreichen. Diese Entfernung von Schichten vor dem Einfrieren kann dazu beitragen, die Probendicke auf ein Niveau zu reduzieren, das für die Kryo-EM-Datenerfassung geeignet ist, die Probenebenheit zu verbessern und die Bildverarbeitung zu erleichtern. Die Peel-Blot-Technik ermöglicht die Trennung von mehrschichtigen Membranen in einzelne Schichten, von geschichteten 2D-Kristallen in einzelne Kristalle und von gestapelten, blattartigen Strukturen löslicher Proteine, die ebenfalls in einzelne Schichten getrennt werden können. Die hohe Probendicke dieser Probentypen stellt häufig unüberwindliche Probleme für die Kryo-EM-Datenerfassung und Kryo-EM-Bildverarbeitung dar, insbesondere wenn der Mikroskoptisch für die Datenerfassung geneigt werden muss. Darüber hinaus können Gitter mit hohen Konzentrationen jeder dieser Proben für eine effiziente Datenerfassung vorbereitet werden, da die Probenkonzentration vor der Gittervorbereitung erhöht und die Peel-Blot-Technik angepasst werden kann, um eine dichte Verteilung der einschichtigen Probe zu erreichen.
Introduction
Die Peel-Blot-Technik wurde entwickelt, um gestapelte zweidimensionale Kristalle von Membranproteinen in einzelne Schichten zu trennen, um entsprechend dünne Proben für die Kryo-EM 2D- und 3D-Datenerfassung zu erhalten und die Bildverarbeitung zu erleichtern1. Das Protokoll eignet sich in ähnlicher Weise für andere Arten von mehrschaligen Proben sowie zum Erreichen hoher Probenkonzentrationen beider Probentypen auf dem Gitter, ohne die Dicke in Z zu erhöhen.
Die Reduktion der Probenschichten auf eine Schicht wird durch die Anwendung einer Kombination aus Kapillardruck und Scherkräften in einem Protokoll erreicht, das die Rückinjektionsmethode2 wesentlich erweitert und modifiziert. Ein erster Löschschritt führt zu einem dichten Sandwiching und einer Haftung auf dem Kohlenstofffilm und einem Gitterstab auf beiden Seiten der mehrschichtigen Probe während des Blottings auf Submikron anstelle der Porengröße von 20-25 μm Filterpapier bei der Rückinjektionsmethode. Die Trennung oder das Ablösen einer einzelnen Schicht erfolgt, wenn die Trennung der Sandwichschichten erzwungen wird, sobald das Gitter vertikal auf einen Trehalose-Tropfen gedrückt wird, wodurch der Kohlenstofffilm vom Gitterstab weggedrückt wird (Abbildung 1). Die Neupositionierung der Kohlenstofffolie weg von der ursprünglichen Kontaktstelle mit der Gitterstange erfolgt im nächsten Schritt, wenn das Gitter erneut auf Submikron-Filterpapier abgetupft wird. Die Anzahl der Iterationen dieser Schritte kann für bestimmte Proben optimiert werden. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um die Probenkonzentrationen zu erhöhen und gleichzeitig eine Aggregation in Z zu vermeiden. Aufgrund der Abhängigkeit von der Haftung an Gitterstab und Kohlenstofffilm sowie der kraftvollen Trennung ist dieser Ansatz möglicherweise nicht für hochzerbrechliche Moleküle wie bestimmte empfindliche und/oder instabile Proteine und Proteinkomplexe geeignet.
Die Peel-Blot-Technik erfordert weder spezielle Ausrüstung noch teure Vorräte. Die Anwendbarkeit auf bestimmte Proben erfordert jedoch eine sorgfältige Berücksichtigung biologischer Parameter. Die Entscheidung ist für 2D-Kristalle einfacher, da Kohlenstofffilm erforderlich ist, um die Ebenheit zu gewährleisten, aber die Manipulation über die Peel-Blot-Technik kann die biologische Integrität der Probe oder die kristalline Ordnung beeinträchtigen. Die Eignung der Peel-Blot-Technik für einzelne Partikel ist auf diejenigen beschränkt und kann für diejenigen getestet werden, die Kohlenstofffilm benötigen und stabil gegen Manipulation sind. Proben mit kritischen biologischen Wechselwirkungen zwischen Schichten sind aufgrund der Störung solcher Wechselwirkungen möglicherweise nicht für die Charakterisierung mit Hilfe der Peel-Blot-Technik geeignet.
Die Peel-Blot-Technik ("Peel-Blot") wird am schnellsten durch Testen und Screening mit negativen Flecken oder ungefärbten Proben durch TEM bei Raumtemperatur optimiert. Sobald die optimale Anzahl von Peel-Blot-Iterationen identifiziert wurde, kann die Zeit bis zur Kontrolle der Dicke vor der Vitrifikation bestimmt werden.
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Protocol
1. Vorbereitungsschritte für die Peel-Blot-Technik
HINWEIS: Zur Vorbereitung müssen die folgenden Elemente nebeneinander platziert werden.
- Stapeln Sie zwei Stück Filterpapier im Porenformat 20-25 μm (siehe Materialtabelle).
- Legen Sie eine ~8 cm x 10 cm lange Paraffinfolie mit dem Papier nach oben neben das Filterpapier.
- Legen Sie ein Stück Submikron-Filterpapier auf zwei weitere Stücke Filterpapier #4 (Abbildung 1-1).
- Positionieren Sie die Antikapillarzange mit dem gebeugten Bein nach oben und dem geraden Bein nach unten. Wählen Sie dann ein Raster mit 600 Mesh und der glatten/glänzenden Seite nach oben. Legen Sie die Pinzette auf eine Petrischale oder eine andere erhöhte Oberfläche, um den Kontakt des sauberen Gitters mit anderen Gegenständen zu vermeiden.
- Entfernen Sie das Papier von der Paraffinfolie und ziehen Sie an den Seiten (~5 mm), um einen kleinen Rand zu erzeugen. Pipettieren Sie zwei 150 μL Tropfen 4% Trehalose-Lösung ~1-2 cm von einer kurzen Seite des Paraffinfilms und ~1 cm auseinander auf dem Paraffinfilm.
- Gießen Sie auf einer separaten Bank oder auf dem Boden flüssigen Stickstoff in einen kleinen Polystyrolschaumbehälter (siehe Materialtabelle).
ACHTUNG: Lassen Sie sich im richtigen Umgang mit Handschuhen und Gesichtsschutz schulen, um Erfrierungen zu vermeiden. - Stellen Sie einen kleinen Kryo-EM-Gitterbehälter in den flüssigen Stickstoff und decken Sie den Styroporschaumbehälter mit fusselfreien Tüchern ab.
2. Platzieren der Kohlenstofffolie auf dem Gitter
- Verwenden Sie die Dumont #5 Pinzette (siehe Materialtabelle), um den Kohlenstofffilm vom Glimmer zu schweben, indem Sie eine Seite des Glimmers in einem leichten Winkel nach unten (~ 20 ° -40 °) auf einem der Tropfen Trehalose-Lösung berühren und die Wasserspannung langsam vom Kohlenstofffilm abheben lassen, indem Sie den Glimmer nach unten bewegen. Geben Sie den Glimmer frei, sobald der Kohlenstofffilm auf der Oberfläche des Tröpfchens schwimmt.
- Untersuchen Sie den Kohlenstofffilm visuell, um die Verwendung von Kohlenstoff mit Schäden in Form von Brüchen zu vermeiden.
- Führen Sie das Gitter, das von der Antikapillarzange gehalten wird, in einem Winkel (~ 20 ° -30 °) in einen Trehalose-Tropfen an einer Position neben und dann zentriert unter dem Kohlenstofffilm ein. Nehmen Sie den Kohlenstofffilm auf (Abbildung 1-2).
- Halten Sie das Gitter in der gleichen Ausrichtung und senken Sie es langsam auf die Oberfläche des zweiten Tropfens Trehalose, ohne die Oberflächenspannung des Tropfens zu brechen, um unnötigen Kohlenstofffilm zu entfernen, der sich möglicherweise um den Rand des Gitters zur rauen Seite gewickelt hat.
3. Trennung von mehrschichtigen 2D-Kristallen in einzelne Schichten
- Drehen Sie die Antikapillarzange (siehe Materialtabelle), und legen Sie sie mit der Kohlenstoffseite des Gitters nach unten auf eine Petrischale (Abbildung 1-3).
- Pipettieren Sie 1,3 μl der Probe in den leichten Trehalose-Meniskus auf dem Gitter. Pipetten Sie die Lösung ~ 8-10 mal, um die Trehalose und die Probe auf beiden Seiten des Gitters zu mischen und zu verteilen.
- Während Sie die Lösung für 1 Minute inkubieren, pipetten Sie einen oder mehrere 1,7 μL Tropfen Trehalose-Lösung auf die Paraffinfolie.
- Drehen Sie das Gitter wieder in seine ursprüngliche Position, wobei der Kohlenstofffilm nach oben zeigt.
- Verwenden Sie die Antikapillarzange, um das Gitter auf das Submikron-Filterpapier zu drücken (Abbildung 1-4). Sobald die Lösung vom Filterpapier absorbiert wurde und der Kohlenstofffilm flach liegt, warten Sie 3s, bevor Sie das Gitter anheben und senkrecht auf den 1,7 μL Tropfen Trehalose-Lösung bewegen (Abbildung 1-5).
HINWEIS: Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals für stark gestapelte Proben, oder das Raster wird für die Vitrifikation in den nächsten Schritten vorbereitet. - Tupfen Sie das Raster auf den beiden Filterpapierstücken ab, und heben Sie dann das Raster vom Filterpapier ab (Abbildung 1-6). Nach ca. 13 s, je nach Feuchtigkeit und Probenpuffer, tauchen Sie das Gitter in den flüssigen Stickstoff im kleinen Styroporbehälter und legen Sie das Gitter in den Kryo-EM-Gitterbehälter oder übertragen Sie es direkt zum Kryo-EM-Screening oder zur Datenerfassung.
HINWEIS: Um das Protokoll schnell zu optimieren, färben Sie das abgeschlitzte Gitter bei diesem Schritt negativ, anstatt es in flüssigen Stickstoff zu tauchen. Färben Sie die Probe negativ, indem Sie 3 μL 1% Uranylacetat auf das Gitter auftragen, das Gitter für 30 s inkubieren und mit einem zerrissenen Stück 20-25 μm porengroßes Filterpapier abtupfen. Gitter aus 2D-Kristallen, die in Trehalose, Tannin oder Glukose verglast sind, werden routinemäßig zur Vitrifikation von Hand getaucht, da Trehalose, Tannin und Glukose die Bildung von kristallinem Eis mit Raten verhindern, die für das Eintauchen von Hand verwendetwerden 2.
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Representative Results
Ein erfolgreiches Peel-Blot-Experiment führt zu einzelnen Probenschichten mit oft hohen Konzentrationen. Es ist zu erwarten, dass einige Regionen in den meisten Rasterquadraten immer noch mehrere Schichten enthalten, insbesondere bei einer geringeren Anzahl von Iterationen der Peel-Blot-Schritte. Die Mehrheit der Gitterquadrate wird jedoch ausgedehnte Regionen von Einzelschichten enthalten, wie sie für 2D-Kristalle der menschlichen Leukotrien-C4-Synthase (Abbildung 2) und Liposomen (hinzugefügt in Schritt 3.2, Abbildung 3) beobachtet wurden. Zusätzliche Peel-Blot-Schritte müssen möglicherweise für Proben getestet werden, die nicht die gewünschte Reduzierung der Schichten zeigen.
Der wichtigste Indikator für ein erfolgreiches Peel-Blot-Experiment wird die Datenqualität und biologische Integrität sein, die nach hochauflösender Kryo-EM-Datenerfassung und Bildverarbeitung beobachtet werden. Die Dateninterpretation muss eine sorgfältige Berücksichtigung potenzieller Schäden oder Verzerrungen von Kontaktbereichen zwischen Schichten beinhalten.
Bereiche des EM-Gitters, in denen das Peel-Blotting stattgefunden hat, weist typischerweise eine höhere Probenkonzentration auf als Bereiche, in denen es nicht aufgetreten ist. Dieser scheinbare Konzentrationseffekt wird durch die Haftung der mehrschichtigen Probe sowohl an der Kohlenstofffilm- als auch an den Gitterstaboberflächen verursacht, gefolgt von einer zusätzlichen Haftung an beiden Oberflächen während der Peel-Blot-Vorbereitung, wenn sie sich wiederholt trennen, leicht neu positionieren und wieder Kontakt aufnehmen. Das Ergebnis ist, dass die verschiedenen Schichten der ursprünglichen mehrlamellaren Probe über eine größere laterale Fläche verteilt sind (Abbildung 3 und Abbildung 4). Diese Bereiche können sogar größere 2D-Kristalle oder Membranen enthalten. Beide Phänomene lassen sich leicht beobachten und in Bereichen vergleichen, in denen eine "Peelzone" an einen Bereich angrenzt, der nicht vom Peel-Blot-Schritt betroffen ist (Abbildung 3). Die Bilder in den Abbildungen 2-4 wurden unter niedrig dosierten Bedingungen bei einer Beschleunigungsspannung von 120 kV mit einem Transmissionselektronenmikroskop aufgenommen (siehe Materialtabelle).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Peel-Blot-Technik. Die ersten beiden Schritte (1-2 und 1-3) und der letzte Schritt (1-6) der Peel-Blot-Technik basieren auf der Rückinjektionsmethode 2 und die Zwischenschritte folgen dem Peel-Blot-Protokoll (modifiziert von Johnson et al.1). In Schritt 1 werden (A) zwei Stücke 20-25 μm porengroßes Filterpapier gestapelt, (B) neben ein Stück Paraffinfolie mit zwei Tropfen Trehalose-Lösung und (C) ein Stück Submikron-Filterpapier auf zwei weiteren Stücke Filterpapier. In Schritt 2 (A) wird der Kohlenstofffilm auf dem ersten Trehalose-Tröpfchen abgeschweben und (B) mit einer Antikapillarzange aufgenommen, wonach er an der Oberfläche des zweiten Tröpfchens (nicht gezeigt) berührt wird, ohne die Oberflächenspannung zu brechen, um überschüssigen Kohlenstofffilm von der Peripherie zu entfernen. In Schritt 3 (A) werden die Pinzetten, die das Gitter halten, um 180° gedreht (die Kohlenstofffilmseite des Gitters zeigt nun nach unten) und (B) wird die Probe in den Meniskus der Trehalose pipettiert. In Schritt 4 wurde das Gitter mit dem Kohlenstofffilm nach oben wieder in die ursprüngliche Ausrichtung gedreht und die Probe wird langsam auf das Submikron-Filterpapier abgesenkt. Das Gitter wird angehoben und in Schritt 5 senkrecht auf einen 1,7 μL Tropfen Trehalose-Lösung abgesenkt. Die Schritte 4 und 5 werden als "Peel-Blotting" bezeichnet und können je nach Stapelmenge drei oder mehr Mal iteriert werden. Die Anzahl der Iterationen muss möglicherweise für verschiedene Beispiele optimiert werden. In Schritt 6 (A) wird die Probe auf zwei Schichten 20-25 μm porengroßem Filterpapier abgetupft, bevor (B) von Hand in flüssigen Stickstoff getaucht wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Eine 2-D-Kristallprobe, die der Peel-Blot-Methode unterzogen wurde. Der Bereich links vom Pfeil wurde weitgehend auf einschichtige 2D-Kristalle in einem Kontaktbereich zwischen Kohlenstofffilm und Gitterbalken reduziert, der abgezogen und dann verschoben wurde, während der Bereich rechts vom Pfeil nicht in einem Bereich lag, der vom Peel-Blot betroffen war. Die abgeschälten Bereiche können leicht ausgewählt werden und werden auf dem größten Teil des Gitters beobachtet. Die gezeigten 2D-Kristalle sind gestapelte und einschichtige 2D-Kristalle der humanen Leukotrien-C4-Synthase. Der Maßstabsbalken entspricht 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Liposomen, die dem Peel-Blot ausgesetzt sind. Der Peel-Blot kann erfolgreich angewendet werden, um die Ränder kollabierter Liposomen und Vesikel zu unterbrechen, um zu Regionen mit großen, meist einschichtigen Phospholipid-Doppelschichten zu führen, wie in der unteren Hälfte des Bildes beobachtet. Die obere Hälfte befand sich nicht in einer Kontaktzone zwischen dem Gitterbalken und dem Kohlenstofffilm und enthält somit komplette Liposomen mit zwei Phospholipid-Doppelschichten. Der Maßstabsbalken entspricht 1 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Der Peel-Blot-Footprint. Das Rasterquadrat eines 400-Mesh-Rasters zeigt den Fußabdruck (mit "B" gekennzeichnet) des Rasterbalkens und der resultierenden Peel-Blott-Bereiche sowie die Bereiche (mit "C" gekennzeichnet), die nicht mit einem Rasterbalken in Kontakt standen oder weniger Peel-Blot-Iterationen unterzogen wurden. Der Maßstabsbalken entspricht 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Ablöschen eines EM-Gitters, das durch Rückinjektion auf einem Submikron-Filterpapier unter Verwendung eines zu dünnen Kohlenstofffilms vorbereitet wurde. Bilder sind Einzelbilder aus einem Video (siehe Video 1), die bei (A) dem ersten Kontakt mit der Membran, (B) 1000 ms nach dem Kontakt und (C) 2000 ms nach dem Kontakt aufgenommen wurden. Der Pfeil zeigt Gitterquadrate an, in denen der Kapillardruck den Kohlenstofffilm zerrissen hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: Das Raster wird für den Peel-Blot-Schritt auf das Submikron-Filterpapier gelegt. Die Kohlenstofffolie wird langsam und fest in Richtung von links unten nach rechts oben auf das Gitter gesaugt, wodurch die Probe zwischen Gitterstab und Kohlenstofffilm dicht eingeklemmt wird. Der Kohlenstofffilm und damit einzelne Probenschichten werden in jedem nachfolgenden Peel-Blot-Schritt verschoben, was eine Optimierung mit zusätzlichen Iterationen für höher geschichtete Proben ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Der Peel-Blot ist eine leistungsstarke Methode, um das Stapeln und die Dicke von mehrschichtigen 2D-Kristallen und ähnlichen Proben für die Kryo-EM-Datenerfassung und Bildverarbeitung zu überwinden. Eine Entscheidung über die Verwendung des Peel-Blots basiert auf biologischen Parametern der Probe und muss ebenfalls bewertet werden, sobald ein 3D-Kryo-EM-Modell verfügbar ist. Die biologische Bedeutung von Kontakten und die potenzielle Flexibilität von Kontaktregionen werden bei dieser Bewertung besonders wichtig sein.
Die Anzahl der Peel-Blots wird zunächst durch Beobachtung nach der Standardvorbereitung des negativen Färbegitters ermittelt, wobei übermäßige Schichten oder Dicken alternative Strategien zur Standard-Kryo-EM-Gittervorbereitung erfordern. Dünne mehrschichtige Kristalle, die im Register gestapelt sind, können direkt für microED3 oder FIB-gefräst im Falle dickerer Kristalle4 verwendet werden. Der Peel-Blot ist bei zweischichtigen 2D-Kristallen normalerweise nicht erforderlich, da die Schichten einzeln oder zusammen verarbeitet werden können, wenn sich die Schichten im Register5 befinden. Es könnte jedoch möglicherweise von Vorteil sein, um beide Seiten von 2D-Kristallen des Membranproteins Liganden oder Inhibitoren auszusetzen, einmal in Lösung vor dem Peel-Blotting und einmal nach dem letzten Peel-Blotting-Schritt. Darüber hinaus kann die Reduzierung großer, wohlgeordneter doppelschichtiger 2D-Kristalle eine Elektronenbeugung 6,7 ermöglichen. Mehrschichten, entweder induziert oder biologisch vorkommend, von 2D-Kristallen aus Membran- und löslichen Proteinen werden die wahrscheinlichsten Ziele für den Peel-Blot sein, obwohl das Protokoll auf eine Reihe von Proben angewendet werden kann und dazu dient, verschiedene Proben für Kryo-EM zu konzentrieren (Abbildung 4).
Ersttests mit negativer Färbung reduzieren den Zeit- und Kostenaufwand für die Optimierung der Proben drastisch, da das Einfrieren, die Vorbereitung von Kryo-EM-Probenhaltern, die Übertragung auf eine Kryo-EM und die Verwendung einer Kryo-EM nicht erforderlich sind. Lediglich die Trocknungszeit vor dem Gefrierschritt muss separat optimiert werden. Die Trocknungszeit ist identisch oder sehr ähnlich der Zeit, die zum Trocknen eines Standard-Rückinjektionsgitters derselben Probe verwendet wird1.
Während 600-Mesh-Gitter im Allgemeinen zu einer guten Konservierung des Kohlenstofffilms führen, können eine erhöhte Anzahl von Peel-Blot-Iterationen und dünnere Kohlenstofffilmschichten zu einem erhöhten Kohlenstofffilmbruch führen (Abbildung 5). Gestapelte 2D-Kristalle, Liposomen und geschichtete Proben großer Arrays löslicher Proteine können erfolgreich getrennt werden (Abbildungen 2-4).
Die Probe wird sorgfältig durch Kryo-EM ausgewertet, um sicherzustellen, dass nachteilige Auswirkungen auf die Probenqualität vermieden werden. Dies kann durch Bildverarbeitung erreicht werden, um Bilder von gestapelten und ungestapelten Kristallen zu vergleichen. Sowohl zu Bewertungszwecken als auch zur Erreichung des Ziels eines 3D-Modells wird die Bildverarbeitung über die in Focus8,9 verfügbaren 2dx-Programme durchgeführt, die auch Einzelpartikelansätze implementieren, um Gitterunvollkommenheiten und Proteinheterogenität zu beheben, mit der Möglichkeit, die inhärente Qualität der ursprünglichen 2D-Kristalle dramatisch zu erhöhen10.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Ein Teil dieser Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss HL090630 (ISK) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
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- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
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- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
