Summary
Soyma-leke tekniği, kalınlığı azaltmak, numune konsantrasyonunu artırmak ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için çok katmanlı ve konsantre biyolojik numunelerin tek katmanlara ayrılmasını sağlayan bir kriyo-EM ızgara hazırlama yöntemidir.
Abstract
Soyulmuş leke kriyo-EM ızgara hazırlama tekniği, çok katmanlı numunelerin katmanlarında bir azalma sağlamak amacıyla önemli ölçüde modifiye edilmiş bir geri enjeksiyon yöntemidir. Dalma donmasından önce katmanların bu şekilde çıkarılması, numune kalınlığının kriyo-EM veri toplama için uygun bir seviyeye düşürülmesine, numune düzlüğünün iyileştirilmesine ve görüntü işlemenin kolaylaştırılmasına yardımcı olabilir. Soyma lekesi tekniği, çok katmanlı membranların tek katmanlara, katmanlı 2D kristallerin tek kristallere ve çözünür proteinlerin istiflenmiş, tabaka benzeri yapılarının da aynı şekilde tek katmanlara ayrılmasına izin verir. Bu tür numunelerin yüksek numune kalınlığı, özellikle mikroskop aşamasının veri toplama için eğilmesi gerektiğinde, kriyo-EM veri toplama ve kriyo-EM görüntü işleme için sıklıkla aşılmaz sorunlar ortaya çıkarmaktadır. Ayrıca, bu numunelerden herhangi birinin yüksek konsantrasyonlu ızgaraları, ızgara hazırlamadan önce numune konsantrasyonu artırılabildiğinden ve soyma lekesi tekniği, tek katmanlı numunenin yoğun bir dağılımına neden olacak şekilde ayarlanabildiğinden, verimli veri toplama için hazırlanabilir.
Introduction
Soyma lekesi tekniği, kriyo-EM 2D ve 3D veri toplama için uygun derecede ince numuneler elde etmek ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için istiflenmiş iki boyutlu membran proteinleri kristallerini tek katmanlara ayırmak için geliştirilmiştir1. Protokol, diğer çok katmanlı numune tipleri için ve ayrıca Z'deki kalınlığı arttırmadan ızgarada her iki numune tipinin de yüksek numune konsantrasyonlarına ulaşmak için benzer şekilde uygundur.
Numune katmanlarının bir katmana indirgenmesi, kılcal basınç ve kesme kuvvetlerinin bir kombinasyonunun, geri enjeksiyon yöntemi2'yi önemli ölçüde genişleten ve değiştiren bir protokolde uygulanmasıyla elde edilir. İlk lekeleme adımı, geri enjeksiyon yöntemindeki 20-25μm filtre kağıdı gözenek boyutu yerine mikron altı üzerinde lekeleme sırasında sıkı sandviçleme ve karbon filme ve çok katmanlı numunenin her iki tarafında bir ızgara çubuğuna yapışma ile sonuçlanır. Tek bir tabakanın ayrılması veya soyulması, ızgara bir trehaloz damlasına dikey olarak bastırıldıktan sonra sandviçlenmiş tabakaların ayrılmasının zorlanması üzerine gerçekleşir ve karbon filmi ızgara çubuğundan uzaklaştırır (Şekil 1). Karbon filmin ızgara çubuğu ile orijinal temas noktasından uzağa yeniden konumlandırılması, ızgara bir kez daha mikron altı filtre kağıdı üzerinde lekelendiğinde bir sonraki adımda gerçekleşir. Bu adımların yineleme sayısı belirli örnekler için en iyi duruma getirilebilir. Ayrıca, protokol, Z'de agregasyondan kaçınırken numune konsantrasyonlarını arttırmak için kullanılabilir. ızgara çubuğuna ve karbon filme yapışmanın yanı sıra güçlü ayırmaya bağlı olması nedeniyle, bu yaklaşım bazı hassas ve / veya kararsız proteinler ve protein kompleksleri gibi oldukça kırılgan moleküller için uygun olmayabilir.
Soyma lekesi tekniği ne özel ekipman ne de pahalı malzemeler gerektirir. Bununla birlikte, belirli numunelere uygulanabilirlik, biyolojik parametrelerin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirecektir. Düzlüğü sağlamak için karbon filmi gerektiğinden, 2D kristaller için karar daha kolaydır, ancak soyma-leke tekniği ile manipülasyon, numunenin biyolojik bütünlüğünü veya kristalin sırasını etkileyebilir. Soyulma lekesi tekniğinin tek parçacıklara uygunluğu, karbon film gerektiren ve manipülasyona kararlı olanlarla sınırlıdır ve bunlar için test edilebilir. Katmanlar arasında kritik biyolojik etkileşime sahip örnekler, bu tür etkileşimlerin bozulması nedeniyle soyma-leke tekniği yardımıyla karakterizasyon için uygun olmayabilir.
Soyma-leke tekniği ("soyma-leke"), oda sıcaklığında TEM tarafından negatif lekeli veya lekesiz numunelerle test edilerek ve taranarak en hızlı şekilde optimize edilir. Optimum sayıda soyulma-leke yinelemesi belirlendikten sonra, vitrifikasyondan önce kalınlığı kontrol etme süresi belirlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Peel-blot tekniği için hazırlık adımları
NOT: Hazırlık, aşağıdaki öğelerin birbirine bitişik olarak yerleştirilmesini gerektirir.
- İki parça 20-25 μm gözenek boyutunda filtre kağıdı istifleyin (bkz.
- Filtre kağıdının bitişiğine, kağıt yukarı bakacak şekilde ~8 cm x 10 cm uzunluğunda bir parafin film yerleştirin.
- İki adet #4 filtre kağıdının üzerine bir parça mikron altı filtre kağıdı yerleştirin (Şekil 1-1).
- Anti-kılcal forsepsleri, bükülmüş bacak yukarı bakacak ve düz bacak aşağı bakacak şekilde konumlandırın. Ardından, pürüzsüz/parlak tarafı yukarı bakacak şekilde 600 mesh ızgara seçin. Forsepsleri, temiz ızgaranın diğer öğelerle temasını önlemek için bir Petri kabına veya başka bir yükseltilmiş yüzeye yerleştirin.
- Kağıdı parafin filmden çıkarın ve küçük bir jant oluşturmak için kenarları (~ 5 mm) çekin. Pipet, parafin filmin kısa bir tarafından ~1-2 cm ve parafin filminde ~1 cm arayla% 4 trehaloz çözeltisinin iki 150 μL damlasıdır.
- Ayrı bir tezgahta veya zeminde, küçük bir polistiren köpük kaba sıvı azot dökün (bkz.
DİKKAT: Donma ısırmasını önlemek için eldiven ve yüz siperliği kullanarak doğru kullanım için eğitim alın. - Sıvı azotun içine küçük bir kriyo-EM ızgara kabı yerleştirin ve polistiren köpük kabı tüy bırakmayan mendillerle örtün.
2. Karbon filmin ızgaraya yerleştirilmesi
- Trehaloz çözeltisinin damlalarından birinde mikanın bir tarafına aşağı doğru hafif bir açıyla (~ 20 ° -40 °) dokunarak karbon filmini mikadan yüzdürmek için Dumont #5 forseps kullanın (bkz. Karbon film damlacığın yüzeyinde yüzdükten sonra mikayı serbest bırakın.
- Kırık şeklinde hasarlı karbon kullanmaktan kaçınmak için karbon filmi görsel olarak inceleyin.
- Anti-kılcal forseps tarafından bir açıyla (~ 20 ° -30 °) tutulan ızgarayı, karbon filme bitişik bir konumda bir trehaloz damlasına yerleştirin ve ardından karbon filmin altında ortalayın. Karbon filmi alın (Şekil 1-2).
- Izgarayı aynı yönde tutun ve ızgaranın kenarını kaba tarafa sarmış olabilecek gereksiz karbon filmi çıkarmak için damlanın yüzey gerilimini kırmadan ikinci trehaloz damlasının yüzeyine yavaşça indirin.
3. Çok katmanlı 2D kristallerin tek katmanlara ayrılması
- Anti-kılcal forsepsleri döndürün (bakınız Malzeme Tablosu) ve ızgaranın karbon tarafı aşağı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 1-3).
- Pipetten 1.3 μL'lik numune ızgaranın üstündeki hafif trehaloz menisküsün içine alınır. Trehaloz ve numuneyi ızgaranın her iki tarafına karıştırmak ve dağıtmak için çözeltiyi ~ 8-10 kez pipetleyin.
- Çözeltiyi 1 dakika boyunca inkübe ederken, pipet parafin filmine bir veya daha fazla 1.7 μL trehaloz çözeltisi damlatın.
- Karbon filmi yukarı bakacak şekilde ızgarayı orijinal konumuna geri döndürün.
- Izgarayı mikron altı filtre kağıdına bastırmak için kılcal forseps kullanın (Şekil 1-4). Çözelti filtre kağıdı tarafından emildikten ve karbon film düz durduğunda, ızgarayı kaldırmadan ve dikey olarak 1.7 μL trehaloz çözeltisi damlasına hareket ettirmeden önce 3 saniye bekleyin (Şekil 1-5).
NOT: Yüksek oranda yığılmış numuneler için bu adımı birden çok kez yineleyin veya sonraki adımlarda kılavuz vitrifikasyon için hazırlanır. - Izgarayı iki filtre kağıdı parçası üzerine dökün ve ardından ızgarayı filtre kağıdından kaldırın (Şekil 1-6). Yaklaşık 13 sn sonra, neme ve numune tamponuna bağlı olarak, ızgarayı küçük strafor kaptaki sıvı azota daldırın ve ızgarayı kriyo-EM ızgara kabına yerleştirin veya kriyo-EM taraması veya veri toplama için doğrudan aktarın.
NOT: Protokolü hızlı bir şekilde optimize etmek için, soyulmuş lekeli ızgarayı sıvı azota batırmak yerine bu adımda negatif olarak lekeleyin. Izgaraya 3 μL% 1 uranil asetat uygulayarak numuneyi negatif olarak lekeleyin, ızgarayı 30 s boyunca inkübe edin ve yırtık bir parça 20-25 μm gözenek boyutunda filtre kağıdı ile lekeleyin. Trehaloz, tanen veya glikozda vitrifiye edilen 2D kristallerin ızgaraları, trehaloz, tanen ve glikoz, elle daldırma2 için kullanılan oranlarda kristalin buz oluşumunu önlediğinden, vitrifikasyon için rutin olarak elle daldırılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı bir soyma lekesi deneyi, genellikle yüksek konsantrasyonlarda tek bir numune katmanı ile sonuçlanacaktır. Çoğu ızgara karesindeki bazı bölgelerin, özellikle soyulma lekesi adımlarının daha az sayıda yinelemesinde, hala birden fazla katman içermesi beklenir. Bununla birlikte, ızgara karelerinin çoğunluğu, insan lökotrienC4 sentazının (Şekil 2) ve lipozomların (adım 3.2, Şekil 3'te eklenmiştir) 2D kristalleri için gözlemlendiği gibi, tek katmanların geniş bölgelerini içerecektir. Katmanlarda istenen azalmayı göstermeyen numuneler için ek soyma lekesi adımlarının test edilmesi gerekebilir.
Başarılı bir peel-blot deneyinin en önemli göstergesi, yüksek çözünürlüklü kriyo-EM veri toplama ve görüntü işleme sonrasında gözlemlenen veri kalitesi ve biyolojik bütünlük olacaktır. Veri yorumlama, katmanlar arasındaki temas bölgelerinde olası hasar veya bozulmanın dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini içermelidir.
EM ızgarasının soyulma lekelenmesinin meydana geldiği bölgeleri, tipik olarak, oluşmadığı bölgelerden daha yüksek bir numune konsantrasyonu gösterir. Bu belirgin konsantre edici etki, çok katmanlı numunenin hem karbon filmine hem de ızgara çubuğu yüzeylerine yapışmasından kaynaklanır, ardından soyulma lekesi hazırlığı sırasında her iki yüzeye de tekrar tekrar ayrılırken, hafifçe yeniden konumlandırılırken ve tekrar temas ederken ek yapışma izler. Sonuç, orijinal çok katmanlı numunenin farklı katmanlarının daha geniş bir yanal alana yayılmasıdır (Şekil 3 ve Şekil 4). Bu bölgeler daha büyük 2D kristaller veya membranlar bile içerebilir. Her iki fenomen de kolayca gözlemlenir ve bir "soyma bölgesinin" soyulma-leke adımından etkilenmeyen bir alana bitişik olduğu alanlarda karşılaştırılır (Şekil 3). Şekil 2-4'teki görüntüler, düşük doz koşulları altında, bir iletim elektron mikroskobu ile 120 kV'luk hızlanan bir voltajda toplanmıştır (bkz.
Resim 1: Peel-blot tekniğinin şematik gösterimi. Peel-blot tekniğinin ilk iki adımı (1-2 ve 1-3) ve son adımı (1-6) sırt enjeksiyon yöntemi 2'ye dayanır ve ara adımlar peel-blot protokolünü takip eder (Johnson ve ark.1'den modifiye edilmiştir). Adım 1'de, (A) iki parça 20-25 μm gözenek boyutunda filtre kağıdı istiflenir, (B) iki damla trehaloz çözeltisi içeren bir parafin film parçasına bitişik ve (C) iki ek filtre kağıdı parçası üzerine bir parça mikron filtre kağıdı. Adım 2'de, (A) karbon film ilk trehaloz damlacığı üzerinde yüzdürülür ve (B) kılcal önleyici forsepslerle toplanır, daha sonra fazla karbon filmi çevreden çıkarmak için yüzey gerilimini kırmadan ikinci damlacığın yüzeyine (gösterilmez) dokunulur. Adım 3'te, (A) ızgarayı tutan forseps 180 ° döndürülür (ızgaranın karbon film tarafı şimdi aşağı bakmaktadır) ve (B) numune trehalozun menisküsüne pipetlenir. 4. adımda, ızgara karbon filmi yukarı bakacak şekilde orijinal yöne döndürüldü ve numune yavaşça mikron altı filtre kağıdına indirildi. Izgara yukarı kaldırılır ve adım 5'te dikey olarak 1.7 μL'lik bir trehaloz çözeltisi damlasına indirilir. Adım 4 ve 5 "soyulma lekeleme" olarak adlandırılır ve istifleme miktarına bağlı olarak üç veya daha fazla kez yinelenebilir. Yineleme sayısının farklı örnekler için optimize edilmesi gerekebilir. Adım 6'da, (A) numune iki kat 20-25 μm gözenek boyutunda filtre kağıdı üzerinde lekelenir, (B) sıvı azot içine elle daldırılmadan önce. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Soyma-leke yöntemine tabi tutulan 2 boyutlu kristal numune. Okun solundaki bölge, karbon film ile ızgara çubuğu arasındaki bir temas bölgesinde soyulmuş ve daha sonra kaydırılmış tek katmanlı 2B kristallere indirgenirken, okun sağındaki bölge soyulma lekesinden etkilenen bir bölgede değildi. Soyulmuş lekelenmiş bölgeler kolayca seçilebilir ve ızgaranın çoğunda gözlenir. Gösterilen 2D kristaller, insan lökotrien C4 sentazının istiflenmiş ve tek katmanlı 2D kristalleridir. Ölçek çubuğu 10 μm'ye karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Peel-lekeye maruz kalan lipozomlar. Peel-blot, çökmüş lipozomların ve veziküllerin kenarlarını kesmek için başarıyla uygulanabilir ve görüntünün alt yarısında gözlendiği gibi büyük, çoğunlukla tek katmanlı fosfolipid çift katmanlı bölgelere neden olur. Üst yarı, ızgara çubuğu ile karbon filmi arasında bir temas bölgesinde değildi ve bu nedenle iki fosfolipid çift katmanlı tam lipozomlar içeriyor. Ölçek çubuğu 1 μm'ye karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Soyulmuş leke ayak izi. 400 mesh ızgaranın ızgara karesi, ızgara çubuğunun ayak izini ("B" etiketli) ve sonuçta ortaya çıkan soyulmuş lekelenmiş bölgeleri ve ayrıca bir ızgara çubuğuyla temas etmeyen veya daha az soyulma lekesi yinelemesine maruz kalan bölgeleri ("C" etiketli) gösterir. Ölçek çubuğu 10 μm'ye karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Çok ince karbon film kullanarak, mikron altı bir filtre kağıdına geri enjeksiyonla hazırlanan bir EM ızgarasının lekelenmesi. Görüntüler, (A) membranla ilk temasta, (B) temastan 1000 ms sonra ve (C) temastan 2000 ms sonra çekilen bir videodan (bkz. Video 1) tek karelerdir. Ok, kılcal basıncın karbon filmi yırttığı ızgara karelerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Izgara, soyulma lekesi adımı için mikron altı filtre kağıdına yerleştirilir. Karbon film, sol alttan sağ üste doğru yavaşça ve sıkıca emilir, bu da ızgara çubuğu ile karbon film arasındaki numuneyi sıkıca sandviçler. Karbon film ve dolayısıyla bireysel numune katmanları, sonraki her soyulma lekesi adımında yer değiştirir ve daha yüksek katmanlı numuneler için ek yinelemelerle optimizasyona olanak tanır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Soyma lekesi, kriyo-EM veri toplama ve görüntü işleme için çok katmanlı 2D kristallerin ve benzeri numunelerin istiflenmesinin ve kalınlığının üstesinden gelmek için güçlü bir yöntemdir. Soyma lekesinin kullanımına ilişkin bir karar, numunenin biyolojik parametrelerine dayanacak ve ayrıca bir 3D kriyo-EM modeli mevcut olduğunda değerlendirme gerektirecektir. Temaslıların biyolojik önemi ve temas bölgelerinin potansiyel esnekliği bu değerlendirmede özellikle önemli olacaktır.
Soyulma lekelerinin sayısı başlangıçta standart negatif leke ızgarası hazırlığından sonra gözlem yoluyla belirlenecektir, burada aşırı katmanlar veya kalınlık standart kriyo-EM ızgara hazırlığına alternatif stratejiler gerektirecektir. Kayıt defterinde istiflenen ince çok katmanlı kristaller, daha kalın kristaller4 durumunda doğrudan microED3 veya FIB frezelenmiş olarak kullanılabilir. Kabuk lekesi genellikle çift katmanlı 2D kristaller için gerekli olmayacaktır, çünkü katmanlar kayıt5'teyken katmanlar ayrı ayrı veya birlikte işlenebilir. Membran proteini 2D kristallerinin her iki tarafını ligandlara veya inhibitörlere maruz bırakmak için potansiyel olarak yararlı olabilir, ancak bir kez soyma lekelemeden önce çözeltide ve bir kez de son soyulma lekeleme adımından sonra. Ek olarak, büyük, iyi sıralanmış çift katmanlı 2D kristallerin azaltılması, elektron kırınımına izin verebilir 6,7. 2D membran kristallerinin ve çözünür proteinlerin indüklenmiş veya biyolojik olarak meydana gelen çok katmanları, protokol bir dizi örneğe uygulanabilse ve kriyo-EM için çeşitli numunelerin konsantre edilmesine hizmet etse de, soyulma lekesi için en olası hedefler olacaktır (Şekil 4).
Negatif leke ile yapılan ilk test, numuneleri dondurma, kriyo-EM numune tutucularının hazırlanması, kriyo-EM'ye aktarma ve kriyo-EM kullanımı gerekmediğinden optimize etmek için gereken zamanı ve maliyeti önemli ölçüde azaltacaktır. Sadece dondurma adımından önceki kuruma süresinin ayrı ayrı optimize edilmesi gerekecektir. Kuruma süresi, aynı numunenin standart bir geri enjeksiyon ızgarasını kurutmak için kullanılan zamanla aynı veya çok benzer olacaktır1.
600 örgülü ızgaralar genellikle karbon filmin iyi bir şekilde korunmasına neden olurken, artan sayıda soyulma-leke yinelemesi ve daha ince karbon film katmanları karbon filmi kırılmasının artmasına neden olabilir (Şekil 5). İstiflenmiş 2D kristaller, lipozomlar ve büyük çözünür protein dizilerinin katmanlı örnekleri başarıyla ayrılabilir (Şekil 2-4).
Numune, numune kalitesi üzerindeki olumsuz etkilerden kaçınılmasını sağlamak için kriyo-EM tarafından dikkatlice değerlendirilir. Bu, yığılmış ve istiflenmemiş kristallerin görüntülerini karşılaştırmak için görüntü işleme ile elde edilebilir. Hem değerlendirme amacıyla hem de bir 3D modelin hedefine ulaşmak için, görüntü işleme, orijinal 2D kristallerin doğal kalitesi10 üzerinde çarpıcı bir şekilde artış olasılığı ile kafes kusurlarını ve protein heterojenliğini ele almak için tek parçacık yaklaşımlarını da uygulayan Focus 8,9'da bulunan 2dx programları aracılığıyla gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışmanın bir kısmı NIH hibesi HL090630 (ISK) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
