Summary
여기에서는 인간 대동맥 벽에서 평활근 세포의 생체 내 생체 역학적 변형을 복제하기 위해 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온 칩 모델을 개발했습니다.
Abstract
종래의 2차원 세포 배양 기술 및 동물 모델은 인간 흉부 대동맥류 및 박리(TAAD)의 연구에 사용되어 왔다. 그러나, 인간 TAAD는 때때로 동물 모델에 의해 특성화될 수 없다. 임상 인간 연구와 동물 실험 사이에는 치료 약물의 발견을 방해 할 수있는 명백한 종 차이가 있습니다. 대조적으로, 종래의 세포 배양 모델은 생체 내 생체 역학적 자극을 시뮬레이션할 수 없다. 이를 위해 최근 몇 년 동안 미세 가공 및 미세 유체 기술이 크게 발전하여 생체 역학적 미세 환경을 복제하는 유기체 온 칩 모델을 구축하기위한 새로운 기술을 제공합니다. 이 연구에서는 TAAD에서 중요한 역할을 하는 인간 대동맥 평활근 세포(HASMC)가 경험하는 주기적 변형의 진폭 및 빈도를 포함하여 대동맥 생체역학의 병태생리학적 매개변수를 시뮬레이션하기 위해 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온어칩(HASMC-OOC) 모델을 개발했습니다. 이 모델에서 HASMC의 형태는 모양이 길어지고 변형 방향에 수직으로 정렬되었으며 정적 기존 조건보다 변형 조건에서 더 수축적인 표현형을 나타냅니다. 이것은 천연 인간 대동맥 벽의 세포 방향 및 표현형과 일치했습니다. 또한, 이첨판 대동맥판막 관련 TAAD(BAV-TAAD) 및 삼첨판 대동맥판막 관련 TAAD(TAV-TAAD) 환자 유래 1차 HASMC를 사용하여 TAAD에서 HASMC 특성을 복제하는 BAV-TAAD 및 TAV-TAAD 질환 모델을 구축했습니다. HASMC-OOC 모델은 TAAD의 발병기전을 추가로 탐구하고 치료 표적을 발견하기 위해 동물 모델을 보완하는 새로운 시험관 내 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
흉부 대동맥류 및 박리(TAAD)는 높은 이환율 및사망률과 관련된 대동맥벽의 국부적인 확장 또는 박리입니다1. 인간 대동맥 평활근 세포 (HASMC)는 TAAD의 발병 기전에 중요한 역할을합니다. HASMC는 말기 분화 세포가 아니며 HASMC는 높은 가소성을 유지하여 다른 자극에 반응하여 표현형을 전환 할 수 있습니다2. HASMC는 주로 생체 내에서 리드미컬한 인장 변형을 받으며, 이는 평활근 형태학적 변화, 분화 및 생리적 기능을 조절하는 핵심 요소 중 하나입니다3,4. 따라서 HASMC 연구에서 주기적 변형의 역할은 무시할 수 없습니다. 그러나 기존의 2D 세포 배양은 생체 내에서 HASMC가 경험하는 주기적 변형의 생체 역학적 자극을 복제할 수 없습니다. 또한, 동물 TAAD 모델의 구성은 이첨판 대동맥 판막 (BAV) 관련 TAAD와 같은 일부 유형의 TAAD에는 적합하지 않습니다. 또한 임상 인간 연구와 동물 실험 사이의 종 격차는 무시할 수 없습니다. 임상 실습에서 제약 번역을 방해합니다. 따라서, 대동맥 질환의 연구에서 생체 내 생체역학적 환경을 시뮬레이션하기 위한 보다 복잡하고 생리학적 시스템에 대한 절실한 요구가 존재한다.
생물 의학 연구 및 약물 개발에 사용되는 동물 실험은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 윤리적으로 의심 스럽습니다. 또한 동물 연구 결과는 인간 임상 시험 5,6에서 얻은 결과를 예측하지 못하는 경우가 많습니다. 인간 전임상 모델의 부족과 임상 시험의 높은 실패율로 인해 클리닉에 효과적인 약물이 거의 없어 의료 비용이 증가했습니다7. 따라서 동물 모델을 보완 할 다른 실험 모델을 찾는 것이 시급합니다. 미세 가공 및 미세 유체 기술은 최근 몇 년 동안 크게 발전하여 기존 2D 세포 배양 기술의 단점을 해결하고 생리 연구 및 약물 개발을 위한 보다 현실적이고 저렴하며 효율적인 체외 모델을 구축하는 오가노이드 온어칩 모델을 구축하기 위한 새로운 기술을 제공합니다. 미세 유체 장치를 사용하여 조직 또는 기관의 주요 기능을 복제하기 위해 다양한 자극을 가진 마이크로 미터 크기의 챔버에서 살아있는 세포를 배양하기 위해 장기 온 칩이 설정됩니다. 이 시스템은 단일 또는 다중 미세 유체 마이크로 채널로 구성되며, 관류 챔버에서 배양 된 한 종류의 세포가 한 조직 유형의 기능을 복제하거나 다공성 막에서 배양 된 다른 세포 유형을 사용하여 서로 다른 조직 간의 인터페이스를 재현합니다. 환자 유래 세포와 결합된 미세유체 기반 오가노이드는 마우스와 인간 질병 모델 간의 큰 종 차이를 해소하고 질병 메커니즘 연구 및 약물 발견을 위한 기존 2D 세포 배양의 단점을 극복하는 고유한 이점이 있습니다. 지난 몇 년 동안 미세 유체 공학의 급속한 발전으로 연구자들은 복잡한 생체 내 생물학적 매개 변수를 복제하는 시험관 내 장기 온 칩 (OOC) 모델의 유용성을 깨달았습니다8. 이러한 미세유체 오가노이드는 주기적 변형률, 전단 응력 및 액체 압력과 같은 체외 생체역학 환경을 시뮬레이션하여 3차원(3D) 세포 배양 환경을 제공합니다. 현재까지 폐9, 신장10, 간 11, 장 12 및 심장 13과 같은 기관에서 생체 역학적 자극을 시뮬레이션하기 위해 여러 OOC 모델이 확립되었지만 인간 대동맥 질환 연구에는 널리 적용되지 않았습니다.
이 연구에서는 TAAD 환자 유래 1차 HASMC에 적용되는 생체모방적 기계적 힘과 리듬을 제어할 수 있는 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온어칩(HASMC-OOC) 모델을 제시합니다. 이 칩은 채널로 에칭 된 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)의 3 층 두꺼운 판과 2 개의 상용화 된 매우 유연한 PDMS 멤브레인으로 구성됩니다. HASMC는 PDMS 막에서 배양됩니다. 칩의 중간에 있는 채널은 세포 배양을 위한 배양 배지로 채워진다. 칩의 상단 및 하단 채널은 PDMS 멤브레인의 기계적 인장 변형의 리듬과 주파수를 제어 할 수있는 진공 압력 공급 시스템에 연결됩니다. HASMC가 경험하는 리드미컬한 변형은 HASMC-OOC에서 시뮬레이션할 수 있으며, 기존의 2D 배양 시스템으로는 기능적으로 달성할 수 없는 조직 또는 기관의 생체역학적 미세 환경을 복제할 수 있습니다. 고해상도, 실시간 이미징 및 생체 역학적 미세 환경의 장점으로 살아있는 세포의 생화학적, 유전 및 대사 활성을 조직 발달, 장기 생리학, 질병 병인학, 분자 메커니즘 및 바이오마커 식별, 심혈관 질환 및 대동맥 질환에 대해 연구할 수 있습니다. 조직 특이적 세포 및 환자 세포와 결합된 이 시스템은 약물 스크리닝, 개인화된 의학 및 독성 테스트에 사용할 수 있습니다. 이 HASMC-OOC 모델은 대동맥 질환의 발병기전을 연구하기 위한 새로운 시험관내 플랫폼을 제공한다.
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Protocol
인간 대동맥 검체는 중산 병원, 푸단대학교 윤리위원회(NO. B2020-158). 대동맥 표본은 푸단 대학교 중산 병원에서 상행 대동맥 수술을받은 환자로부터 수집되었습니다. 참여 전에 모든 환자로부터 서면 사전 동의를 얻었습니다.
1. 일차 인간 대동맥 평활근 세포 분리
- 상행 대동맥의 오른쪽 측면 부위를 멸균 PBS, 1x-2x로 씻으십시오.
- 두 개의 안과 겸자로 조직의 내막과 외막 층을 제거하고 배지 층을 유지하여 세포를 수확합니다.
- 미디어 층을 10cm 배양 접시에 놓고 가위로 작은 조각 (2-3mm)으로 자릅니다. 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 평활근 세포 배양액(SMCM) 5mL를 추가합니다.
- 멸균 점 적기로 작은 조직을 배양 병에 넣고 조직을 고르게 펴십시오. 배양 배지를 가능한 한 많이 버린 다음 병을 거꾸로 뒤집습니다.
- 거꾸로 된 배양 병에 2mL의 SMCM을 넣고 37 ° C의 인큐베이터 (5 % CO 2)에1-2 시간 동안 놓은 다음 천천히 오른쪽을 위로 돌리고 SMCM 2mL를 더 추가합니다.
- 5-7 일 배양 후 SMCM을 4mL의 신선한 SMCM으로 교환하십시오. 일반적으로 산발성 평활근 세포는 약 2주 후에 사라집니다.
- SMCM을 천천히 버리고 매체를 변경할 때 천천히 추가하십시오. 현미경 스테이션으로 이동할 때 배양 병을 천천히 운반하십시오. 그렇지 않으면 조직이 떠 다니고 세포가 천천히 자랍니다.
- 세포가 약 80% 컨플루언스에 도달하면 2mL의 PBS로 세척하고 2mL의 0.25% 트립신으로 분해한 다음 4mL의 신선한 SMCM이 있는 두 개의 새로운 배양 병으로 나눕니다.
- 평활근 세포에 대한 4가지 다른 특이적 마커(CNN1, SM22)14의 면역형광 분석을 통해 세포를 식별합니다.
2. PDMS 칩의 제조
- PDMS를 중합하려면 경화제 (B 성분)를베이스 (A 성분)에 A : B = 10 : 1 w / w의 중량비로 첨가하고 복합체를 5 분 동안 완전히 혼합하십시오. 볼륨은 연구의 필요성에 따라 다릅니다.
- 준비된 PDMS 겔을 진공 추출 탱크에 30-60 분 동안 넣고 압력을 -0.8 mPa 이하로 유지하십시오.
알림: 높은 압력은 PDMS 젤 내부의 작은 기포의 추출이 불충분하여 칩 제조의 다음 단계에 영향을 미칩니다. - CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 100mm × 40mm × 8mm 외부 프레임 구조와 70mm × 6mm × 4mm 채널로 금형을 설계합니다.
- 맞춤형은 고정밀 컴퓨터 수치 제어 조각 기계를 사용하여 3 층의 금형을 만듭니다. 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 플레이트를 사용하여 금형 프레임과 마이크로채널을 조각한 다음 다른 PMMA 플레이트에 붙입니다.
- 준비된 PDMS 젤을 100mm × 40mm × 6mm 외부 프레임 및 70mm × 6mm × 4mm 채널이 있는 몰드에 부은 다음 70°C에서 1-2시간 동안 가교결합합니다.
- 금형에서 가교 PDMS 슬래브를 떼어내고 상용화된 PDMS 멤브레인을 100mm × 40mm 섹션으로 절단합니다.
- PDMS 표면 활성화를 위해 3개의 준비된 PDMS 슬래브 및 2개의 PDMS 멤브레인을 산소 플라즈마로 5분 동안 처리합니다. 다음과 같은 특정 설정을 적용하십시오 : 공정 가스로서의 실내 공기; -100 kPa로 설정된 압력; 전류는 180--200 Ma로 설정됩니다. 200V로 설정된 전압; 처리 시간 5 분.
- 1mm 구멍 펀처를 사용하여 3개의 PDMS 슬래브에 구멍을 뚫어 PDMS 칩의 공기 및 중간 마이크로 채널의 입구와 출구를 만듭니다.
- 공기 채널 PDMS 슬래브 (최상층)-PDMS 멤브레인-중간 채널 PDMS 슬래브 (중간 층)-PDMS 멤브레인-공기 채널 PDMS 슬래브 (하단 층)의 순서로 3 개의 PDMS 슬래브와 2 개의 PDMS 멤브레인을 함께 결합합니다. 입체 현미경에서 4x로 이 단계를 수행하여 공기 마이크로채널을 중간 마이크로채널과 완전히 겹칩니다.
- 조립된 PDMS 칩을 70°C 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.
- 내경 1mm와 길이 3cm의 라텍스 호스를 여러 개 준비하십시오. 준비된 호스의 한쪽 끝에 외경 1mm, 길이 1cm의 스테인리스 스틸 바늘을 삽입한 다음 호스의 다른 쪽 끝에 루어를 삽입하여 PDMS 칩의 공기 및 중간 마이크로 채널에 연결된 튜브를 만듭니다.
- 준비된 튜브를 PDMS 칩의 공기 및 중간 마이크로 채널의 배출구와 입구에 삽입합니다.
3. PDMS 칩 표면 처리 및 살균
- 2mL 주사기를 사용하여 PDMS 칩의 배지 마이크로채널에 80mg/mL 마우스 콜라겐 2mL를 주입하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 배양 후 채널에서 콜라겐을 제거하고 2mL 주사기로 다시 수집합니다. 콜라겐 코팅된 PDMS 칩을 60°C 인큐베이터에 밤새 넣는다.
- PDMS 칩을 UV 멸균기에 1시간 이상 넣습니다. 세포 실험을 준비하기 위해 멸균된 PDMS 칩을 울트라클린 벤치에 놓습니다.
4. PDMS 칩의 세포 파종 및 세포 연신 과정
- 37°C의 5%CO2 인큐베이터에서 2% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 평활근 세포 배지(SMCM)를 사용하여 환자로부터 배양 4 x 105차 인간 평활근 세포(HASMC)를 배양한다.
- HASMC 밀도가 80%에 도달하면 SMCM을 버리고 2mL의 PBS로 세포를 세척합니다.
- 0.25% 트립신 1mL를 사용하여 세포를 2분 동안 분해하고 100 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 1mL의 새로운 SMCM에 재현탁시킨다. 8mL의 SMCM을 사용하여 10cm 배양 접시에서 세포를 배양합니다.
- 세포분석기를 사용하여 세포 수를 계산하고 2 x 105 cells/mL의 최종 농도에서 세포를 사용합니다.
- 콜라겐 코팅 및 멸균된 PDMS 칩 배지 마이크로채널에 2mL의 PBS를 천천히 붓고 나중에 2mL 주사기를 사용하여 버립니다.
- 총 2mL의 2 x 105 cells/mL HASMC 현탁액을 2mL 주사기를 사용하여 PDMS 칩의 배지 마이크로채널에 천천히 붓습니다. 그런 다음 PDMS 칩의 입구와 출구에서 Luer를 닫습니다. PDMS 칩을 37°C의 인큐베이터(5%CO2)에 1일 동안 넣는다.
- 셀이 PDMS 칩의 PDMS 멤브레인에 부착된 후 거의 24시간 후에 PDMS 칩의 공기 마이크로 채널 출구를 진공 컨트롤러 시스템에 연결합니다. 세포가 부착되면 부유 된 둥근 세포와 대조적으로 현미경으로 길고 정상적인 세포 형태를 볼 수 있습니다.
- 솔레노이드 밸브와 진공 펌프를 켭니다. 진공 조절기를 열고 압력 수준을 7.18 ± 0.44% 변형률의 경우 10kPa로, 17.28% ± 0.91% 변형률의 경우 15kPa로 조정합니다.
- 제어 시스템의 매개 변수가 설정된 후 PDMS 칩을 37 ° C의 인큐베이터 (5 % CO2)에 넣고 24 시간 동안 늘립니다.
5. 기계 제어 시스템의 준비
- 여러 솔레노이드 밸브, 진공 필터, 진공 조절기, 진공 펌프, 연동 펌프 및 솔레노이드 밸브를 제어하는 프로그래밍 가능한 로직 컨트롤러 (PLC)를 준비하십시오.
- PLC 컨트롤러를 프로그래밍하고 켜기/끄기 시간 간격을 1Hz로 설정합니다. 솔레노이드 밸브를 프로그래밍된 컨트롤러에 연결합니다.
- 진공 펌프의 입구를 진공 필터에 연결 한 다음 진공 필터의 출구를 진공 조절기에 연결합니다. 진공 조절기의 출구를 솔레노이드 밸브에 연결하고 마지막으로 솔레노이드 밸브의 출구를 PDMS 칩의 공기 마이크로 채널 출구에 연결합니다.
- 배양 배지 교체 및 약물 취급을 위해 연동 펌프의 출구를 PDMS 칩의 배지 마이크로 채널 입구에 연결하고 연동 펌프의 입구를 배지 마이크로 채널 PDMS 칩의 출구에 연결합니다.
- 레귤레이터에 의한 변형률의 진폭과 마이크로 컨트롤러에 의한 변형률 주파수를 조정합니다.
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Representative Results
HASMC-OOC 모델은 진공 제어 시스템, 순환 시스템 및 PDMS 칩과 HASMC-OOC 모델의 회로도 설계로 구성됩니다(그림 1). 진공 제어 시스템은 진공 펌프, 솔레노이드 밸브 및 PLC 컨트롤러로 구성됩니다. 순환 시스템으로 작용하기 위해 연동 펌프를 사용하여 세포 배양 배지를 새로 고치고 약물을 추가했습니다. PDMS 칩은 2개의 진공 챔버와 세포 성장을 위한 SMCM으로 채워진 중간 챔버로 구성되었다. 칩 구조의 설계에 따라, PMMA 몰드를 제조하고, 3개의 PDMS 슬래브를 몰드에 붓고 70°C에서 2시간 동안 가교하여 제조하였다. 플라즈마로 처리한 후, 3개의 PDMS 슬래브와 2개의 PDMS 멤브레인을 함께 결합시켰다(그림 2). PDMS 칩을 준비할 때 칩의 PDMS 멤브레인 상에서 HASMC를 배양하고 PDMS 칩을 진공 제어 시스템과 순환 시스템에 연결하였다. 전체 시스템의 개략도는 보충 그림 1에 나와 있습니다. PDMS 칩 파라미터는 도 3A에 도시되어 있고, PDMS 멤브레인의 기계적 특성은 도 3B에 도시되어 있다. PDMS 멤브레인의 인장 변형률을 정량화하기 위해 0kPa, 10kPa, 15kPa, 20kPa, 25kPa 및 30kPa의 진공 압력으로 미세 유체 모델의 단면도에서 PDMS 멤브레인의 실시간 변형을 캡처했습니다. 또한 2mm, 4mm 및 6mm의 다양한 배양 채널 너비에서 PDMS 멤브레인의 변형 크기를 평가하기 위해 길이 변화를 측정했습니다(그림 3C-E). 6mm 폭의 마이크로채널을 PDMS 칩에 사용하였다. 결과는 10kPa의 진공 압력이 0.44% 변형± 7.18을 유도하고 15kPa가 0.91% 변형± 17.28을 유도하는 것으로 나타났습니다(그림 3E).
PDMS 칩에서 HASMC 세포주(CRL1999)의 세포 생존율을 확인하기 위해, 세포를 배양한 후 3일과 5일에 LIVE/DEAD 분석을 수행하였다. 결과는 세포 생존율이 3일째 및 5일째에 90%보다 높은 것으로 나타났다(도 4A). PDMS 칩에서 CRL1999의 세포골격(F-actin) 염색은 정상적인 세포 형태와 24시간 동안 연신한 후 균주에 수직으로 정렬된 세포를 보여주었다(도 4B-C). 수축성 마커 SM22 및 CNN1의 면역형광 염색은 리듬 변형의 24시간 후에 HASMC-OOC를 사용하여 수행하였다(도 4D-E). 시작하기 위해, 2mL의 PBS를 채널 내로 천천히 붓고 2mL 주사기로 버렸다. 이어서, 2mL의 4%(v/v) 파라포름알데히드를 채널에 붓고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, 0.2%(v/v) Triton X-100 2mL를 2mL 주사기로 채널에 붓고 실온에서 15분 동안 배양하였다. 이어서 2mL의 PBS를 채널 내로 천천히 붓고 세포를 세척한 후 2mL 주사기로 버렸습니다. 다음으로, 2mL의 5%(w/v) 소 혈청 알부민을 채널에 천천히 붓고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, 1mL의 SM22 또는 CNN1 항체를 채널에 천천히 붓고 4°C에서 밤새 배양하였다. 인큐베이션 후, 1 mL의 염소 항-토끼 2차 항체를 채널에 천천히 붓고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 1mL의 DAPI 용액을 채널에 천천히 붓고 실온에서 10분 동안 배양하였다. 결과는 변형 조건에서 SM22 및 CNN1의 형광 강도가 정적 조건에서보다 높다는 것을 보여주었습니다(그림 4F). 정적 조건과 비교하여 HASMC의 SM22 및 CNN1 유전자는 균주 조건에서 상향 조절되었습니다(그림 4G). 이러한 데이터는 CRL1999가 균주 방향에 수직으로 정렬되고 수축 표현형이 정적 조건에서의 기존 세포 배양보다 변형 조건에서 더 두드러진다는 것을 시사했습니다.
이첨판 대동맥 판막 관련 TAAD (BAV-TAAD) 및 삼첨판 대동맥 판막 관련 TAAD (TAV-TAAD) 환자 유래 원발성 HASMC를 사용하여 BAV-TAAD 및 TAV-TAAD 질환 모델을 구축했다. BAV-TAAD 및 TAV-TAAD 환자 유래 1차 HASMC의 F-액틴 염색 결과는 정상적인 세포 형태와 24시간 동안 연신 후 균주 방향에 수직으로 정렬된 세포를 보여주었습니다(그림 5A-B). 면역형광 염색 결과, BAV-TAAD 및 TAV-TAAD 환자 유래 1차 HASMC에서 SM22 및 CNN1 발현이 정적 조건에서보다 균주 조건에서 더 높았다는 것을 보여주었습니다(그림 5C-G,I). BAV-TAAD 및 TAV-TAAD 환자 유래 1차 HASMC에서 SM22 및 CNN1의 유전자 발현 수준은 정적 조건과 대조적으로 균주 조건 하에서 상향조절되었다(그림 5H,J). PDMS 칩에서 BAV-TAAD 및 TAV-TAAD 환자 유래 1차 HASMC의 이러한 결과는 HASMC 세포주 CRL1999의 결과와 일치했으며, 이는 환자 유래 1차 HASMC와 HASMC-OOC 모델의 조합이 TAAD에서 HASMC 특성을 복제한다는 것을 나타내며, 이는 질병의 분자 메커니즘 및 약물 스크리닝에 대한 추가 조사를 위한 BAV-TAAD 및 TAV-TAAD 시험관 내 질병 모델을 제공합니다.
그림 1: HASMC-OOC 시스템의 개략도 설계. 이 시스템은 진공 제어 시스템, 순환 시스템 및 PDMS 칩으로 구성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PDMS 칩 준비 절차 PDMS 겔을 PMMA 몰드에 붓고, 70°C에서 1-2시간 동안 가교결합시켰다. 이어서, 3개의 PDMS 슬래브 및 2개의 PDMS 멤브레인을 5분 동안 플라즈마로 처리하고 함께 접합시켰다. 마지막으로, 준비된 PDMS 칩을 멸균하고, 2 x 105 cells/mL HASMC 현탁액의 농도를 PDMS 칩의 배지 마이크로채널에 천천히 부었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PDMS 칩의 세부 파라미터 및 기계적 특성. (A) PDMS 칩의 세부 파라미터. PDMS 슬래브 크기는 100mm × 40mm × 6mm였고, 마이크로채널 크기는 70mm × 6mm × 4mm였다. (B) 상용 PDMS 멤브레인의 파라미터. 2mm(C), 4mm(D) 및 6mm(E)의 마이크로채널 폭에 대해 서로 다른 진공 압력에서 PDMS 멤브레인의 계산된 연신 진폭. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 주기적 변형 조건에서 HASMC의 세포 형태, 방향 및 표현형 변화. (a) PDMS 칩 상에서 배양한 후 3일째 및 5일째에 HASMC 세포주(CRL1999)에서의 LIVE/DEAD 분석의 대표 이미지. (B) 정적 및 변형 조건 하에서 CRL1999의 F- 액틴 염색. (C) 정적 및 변형 조건 하에서 CRL1999의 세포 방향. 정적 및 변형 조건하에서 CRL1999에서 SM22(D) 및 CNN1(E)의 면역형광 염색의 대표 이미지. (F) SM22 및 CNN1의 면역형광 염색의 상대적 강도. (g) 정적 및 균주 조건 하에서 CRL1999에서 SM22 및 CNN1 mRNA 발현. n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, 양측 스튜던트 t-검정 을 사용하여 두 그룹을 비교하였다. 데이터는 평균 ± SD를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: BAV-TAAD 및 TAV-TAAD 환자 유래 HASMC-OOC의 세포 형태 및 표현형 변화. 정적 및 변형 조건에서 BAV-TAAD (A) 유래 1차 HASMC 및 TAV-TAAD(B) 유래 1차 HASMC의 F-액틴 염색 대표 이미지. 정적 및 변형 조건에서 BAV-TAAD (C) 유래 1 차 HASMC 및 TAV-TAAD (D) 유래 1 차 HASMC에서 SM22 면역 형광 염색. 정적 및 변형 조건 하에서 BAV-TAAD (E) 유래 1 차 HASMC 및 TAV-TAAD (F) 유래 1 차 HASMC에서 CNN1의 면역 형광 염색의 대표 이미지. (G) BAV-TAAD 유래 1차 HASMC에서 SM22 및 CNN1 면역형광 염색의 상대적 강도. (H) 정적 및 변형 조건 하에서 BAV-TAAD 유래 1차 HASMC에서 SM22 및 CNN1 mRNA 발현. (I) TAV-TAAD 유래 1차 HASMC에서 SM22 및 CNN1 면역형광 염색의 상대적 강도. (J) 정적 및 변형 조건 하에서 TAV-TAAD 유래 1차 HASMC에서 SM22 및 CNN1 mRNA 발현. n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, 양측 스튜던트 t-검정 을 사용하여 두 그룹을 비교하였다. 데이터는 평균 ± SD를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 장비 준비의 개략도 지침. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
미세유체 기술의 급속한 발전과 함께, 시험관내에서 하나 이상의 기관의 생물학적 기능 및 구조를 복제할 수 있는 OOC 모델이 최근 몇 년 동안 생물학, 의학 및 약리학15에 응용하기 위해 등장했습니다. OOC는 질병 메커니즘을 탐구하고 전임상 약물 번역 8,16을 촉진하는 데 필수적인 인간 생리적 미세 환경의 주요 기능을 시뮬레이션 할 수 있습니다. OOC는 아직 초기 단계에 있으며 OOC의 설계를 최적화하려면 더 많은 입력이 필요하지만 최근 몇 년 동안 많은 진전이있었습니다17,18. 다른 3차원 세포 배양 모델과 달리 OOC는 조직 발달 및 장기 기능 유지에 필수적인 인체의 생체역학적 매개변수를 모방할 수 있습니다. 심혈 관계의 기관과 조직은 생체 내에서 유체 흐름 유도 전단 및 주기적 장력을 지속적으로 받게됩니다. 따라서, 심혈관계의 시험관내 세포 실험은 생체내 연구에서 얻어진 것과 유사한 현실적인 실험 결과를 얻기 위해 이러한 생체역학적 파라미터를 제공하는 실험 플랫폼에서 수행될 필요가 있다.
이 연구에서는 HASMC가 적용되는 생체 역학적 변형의 매개 변수를 정밀하게 제어 할 수있는 HASMC-OOC를 확립했습니다. 세포가 적용되는 유체 속도와 유체 전단을 제어 할 수있을뿐만 아니라 다양한 패턴의 순환 변형의 진폭, 주파수 및 리듬을 정밀하게 제어 할 수 있습니다. OOC 분야에서 사용 된 많은 재료 중에서 PDMS는 가장 널리 채택 된 19,20,21 중 하나입니다. PDMS는 투명하고, 유연하며, 생체적합성 및 통기성이 있으며, 이러한 특성은 미세유체 칩(19) 분야에서의 그의 광범위한 사용에 기여한다. 적용된 압력 변화는 PDMS를 변형시켜 수축 및 이완의 기계적 힘을 얻을 수 있으며 PDMS의 투과성은 칩 상의 세포 배양 환경이 인큐베이터에서 37°C에서 5%CO2의 배양 조건과 일치할 수 있음을 보장합니다. 따라서 PDMS는 세포에 제어된 기계적 힘을 제공할 뿐만 아니라 정상적인 세포 성장에 적합한 배양 환경을 제공합니다. 우리의 실험 결과는 PDMS 칩에서 배양 된 세포의 형태와 활성이 2D 배양 조건과 일치한다는 것을 보여 주며, 이는 PDMS가 생체 적합성임을 나타냅니다.
생체 모방 생체 내 생리 조건 하에서, 대동맥 벽의 HASMC는 약 9 % 22의 순환 변형을받습니다. 고혈압, 대동맥 확장 및 대동맥류와 같은 병리학적 상태에서 HASMC는 16%23 이상의 주기적 변형을 받습니다. PDMS 칩의 인장 특성을 특성화하여 실험 결과, 10kPa의 진공압력이 7.18 ± 0.44% 변형률 유도 및 15 kPa 유도 17.28 ± 0.91% 변형률임을 보여준다. 또한, 스트레인의 주파수 및 유체 전단 응력은 이러한 PDMS 칩 시스템에 의해 제어될 수 있다. BAV-TAAD 및 TAV-TAAD 환자 유래 1차 HASMC를 사용하여 이러한 대동맥 질환의 분자 메커니즘 및 약물 스크리닝을 이 HASMC-OOC in vitro 모델을 사용하여 수행할 수 있으며, 이는 다양한 대동맥 질환의 질병 발병기전을 복제할 수 있습니다. 이 시스템을 사용하여 BAV-TAAD의 발병 기전을 연구하기 위한 질병 모델을 확립했으며 미토콘드리아 융합 활성화제가 병든 세포에서 미토콘드리아 기능 장애를 부분적으로 구제할 수 있음을 밝혔습니다(24).
HASMC-OOC는 Ingber의 작품9에서 폐 칩의 영감과 참조를 기반으로 설계되었습니다. 그들의 장치는 폐에서 폐포의 생리적 호흡 운동을 복제했으며 칩은 상부 및 하부 중간 채널, 다공성 PDMS 멤브레인 및 2 개의 측면 진공 챔버의 3 개 층으로 구성되었습니다. 측면 진공 챔버는 고급 미세 유체 장비를 갖춘 전문 실험실에서만 만들 수 있습니다. 보다 일반적인 실험실 조건에서 조립할 수 있도록 진공 챔버를 칩의 상단과 하단에 배치했습니다. 두 스트레칭 접근법 모두 유사한 기능을 가지므로 실험실 조건 및 연구 요구에 따라 칩 구조를 선택할 수 있습니다. 또한 인간 대동맥의 관형 구조를 구조적으로 확립하고 더 복잡한 생물학적 분석 및 실험 분석을 수행하기 위해 세포에서 더 많은 생물학적 샘플을 얻기 위해 중간 중간 채널, 2개의 PDMS 멤브레인, 상단 및 하단 진공 챔버로 구성된 더 큰 채널을 가진 5층 PDMS 칩을 구축했습니다. 두 개의 PDMS 멤브레인과 PDMS 칩의 대형 채널은 세포 배양 면적을 최대 8.4cm2까지 증가시켜 단백질 분석을 위한 충분한 샘플을 제공했습니다. 이전에보고 된 플랫폼은 주로 뇌 동맥, 말초 혈관 또는 기타 동맥 질환과 같은 경미한 동맥 질환을 조사하는 데 중점을 두었습니다25,26. 대동맥은 직경 25-35mm의 큰 혈관이며, 대동맥의 튜니카 매체는 주로 높은 인장 변형을받는 평활근 세포로 구성됩니다. 대동맥 병증의 병리학은 대동맥 벽의 리모델링, 평활근 세포 사멸 및 표현형 전환과 관련이 있으며, 모두 기계적 스트레스에 의해 조절 될 수 있습니다. 따라서 환자 유래 HASMC와 인장 변형률은 HASMC-OOC의 성공을위한 필수 구성 요소입니다. 그러나이 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. HASMC-OOC는 인간 대동맥의 생체 내 미세 환경을 더 잘 시뮬레이션하고 이러한 세포 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 HASMC, 대동맥 내피 세포 및 섬유아세포를 포함한 공동 배양된 혈관 세포를 활용하지 않았습니다. HASMC는 리드미컬한 변형을 경험하지만 세포는 여전히 세포외 기질을 모방하지 못하는 평평한 PDMS 막에서 배양됩니다. 향후 연구에서는 미세 유체 칩과 3D 바이오 프린팅 기술을 결합하여 이러한 한계를 극복 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는이 작업이 상하이시 과학 기술위원회 (20ZR1411700), 중국 국립 자연 과학 재단 (81771971) 및 상하이 항해 프로그램 (22YF1406600)의 보조금으로 지원되었음을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
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