Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التعلم الترابطي الانعكاسي وتكوين الذاكرة عن طريق إقران مادتين كيميائيتين في Caenorhabditis elegans

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64137
Automatic Translation
1, 1, 1
1Information Processing Biology Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

لقد طورنا سابقا بروتوكولات ل Caenorhabditis elegans لتشكيل ذكريات ترابطية قصيرة وطويلة المدى من خلال التدريب الجماعي والمتباعد ، على التوالي. هنا ، يتم وصف بروتوكولات مفصلة لتكييف C. elegans عن طريق إقران 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك كمحفزات مشروطة وغير مشروطة ، على التوالي ، لتشكيل ذاكرة ترابطية مكروهة.

Abstract

الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans هي كائن نموذجي جذاب لدراسة التعلم والذاكرة على المستويين الجزيئي والخلوي بسبب بساطة نظامها العصبي ، الذي تم إعادة بناء مخططات الأسلاك الكيميائية والكهربائية بالكامل من الصور المجهرية الإلكترونية التسلسلية للمقاطع الرقيقة. هنا ، نصف بروتوكولات مفصلة لتكييف C. elegans من خلال التدريب الجماعي والمتباعد لتشكيل الذاكرة قصيرة المدى (STM) والذاكرة طويلة المدى (LTM) ، على التوالي. من خلال إقران 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك كمحفزات مشروطة وغير مشروطة ، على التوالي ، تم تدريب C. elegans بنجاح لتشكيل STM الترابطي المكروه و LTM. بينما انجذبت الحيوانات الساذجة إلى 1-بروبانول ، لم تعد الحيوانات المدربة تنجذب أو ضعيفة جدا إلى 1-بروبانول. كما هو الحال في الكائنات الحية الأخرى مثل Aplysia و Drosophila ، تلعب "جينات التعلم والذاكرة" أدوارا أساسية في تكوين الذاكرة. على وجه الخصوص ، مستقبلات الغلوتامات من نوع NMDA ، معبرا عنها في ستة أزواج فقط من الخلايا العصبية البينية في C. elegans ، مطلوبة لتشكيل كل من STM و LTM ، ربما كعامل مصادفة. لذلك ، قد يكون تتبع الذاكرة موجودا بين الخلايا العصبية البينية.

Introduction

التعلم والذاكرة أمران حيويان للحيوانات للبقاء على قيد الحياة والتكاثر من خلال التنقل بكفاءة في البيئات المتغيرة. C. elegans هو كائن نموذجي جذاب لدراسة التعلم والذاكرة على المستويين الجزيئي والخلوي بسبب بساطة نظامه العصبي ، الذي تم إعادة بناء مخططات الأسلاك الكيميائية والكهربائية بالكامل من الصور المجهرية الإلكترونية التسلسلية للأقسام الرقيقة1،2،3.

يتعلم C. elegans ربط درجة حرارة الزراعة بالمجاعة ويهاجر بعيدا عن درجة حرارة نموه بذاكرة مكروهة تدوم لعدة ساعات 4,5. يؤدي تكييف C. elegans مع كلوريد الصوديوم (NaCl) في غياب الطعام إلى انخفاض في الانجذاب الكيميائي نحو كلوريد الصوديوم6،7،8. عند إقرانه بالطعام ، يتم تعزيز جاذبية البوتانون نتيجة للتعلم الفاتح للشهية9،10،11. على الرغم من تفسير هذه الظواهر على أنها التعلم الترابطي والذاكرة 10,12 ، إلا أن التمييز بين التعلم الترابطي والتوعية غير الترابطية والتعود والتكيف غير واضح في نموذج التعلم والذاكرة C. elegans 13,14. في الواقع ، أظهرت الحيوانات المشروطة بالبيوتانون والحرمان من الطعام (التكييف المكروه) اقتران مكتئب للخلية العصبية الحسية للبيوتانون AWC ON لاستهداف الخلايا العصبية عن طريق إشارات الأنسولين من الخلايا العصبية الأخرى ، بما في ذلك الخلايا العصبية البينية AIA ، بينما أظهرت الحيوانات المشروطة بالبيوتانون والطعام (التكييف الفاتح للشهية) اقتران معزز ل AWCON لاستهداف الخلايا العصبية15 . تسبب إشارات الأنسولين تغيرات في التعبير الجيني الناجم عن EGL-4 النووي ومنظمات النسخ الأخرى16,17. وبالتالي ، فإن هذا التعلم والذاكرة المكروهة والشهية لها أوجه تشابه مع التعود والتوعية غير الترابطية ، على التوالي ، للخلايا العصبية الحسية قبل المشبكية في منعكس الانسحاب الخيشومي في Aplysia18,19.

من خلال إقران مادتين كيميائيتين مثل التحفيز المشروط (CS) والتحفيز غير المشروط (الولايات المتحدة) ، قمنا نحن وآخرون بتطوير بروتوكولات لتكييف C. elegans لتشكيل التعلم الترابطي والذاكرة دون استخدام الطعام أو الجوع مثل الولايات المتحدة20،21،22،23. في هذه الدراسة ، تم تعديل البروتوكولات لتكييف الحيوانات مع 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 4.0) مثل CS والولايات المتحدة ، على التوالي ، للتعلم المكروه والذاكرة قصيرة المدى (STM) والذاكرة طويلة المدى (LTM). تنجذب C. elegans الساذجة إلى 1-بروبانول24 وتصدها حمض25. عندما تكون مشروطة بمزيج من 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 4.0) ، لم تعد C. elegans تنجذب أو ضعيفة جدا إلى 1-بروبانول.

Protocol

1. وصفات

  1. ألواح أجار NGM (الخطوة 2.1.)
    1. لتحضير ألواح NGM مقاس 6 سم ، قم بإذابة 2.5 جم من الببتون و 3 جم من كلوريد الصوديوم و 17 جم من الآجار في 850 مل من H 2 O منزوع الأيونات بشكل مضاعف(ddH2O). ارفع الحجم الإجمالي إلى 972 مل باستخدام ddH2O.
    2. بعد التعقيم ، تبرد إلى ~ 65 °C وأضف 1 مل من 5 مجم / مل من الكوليسترول المذاب في الإيثانول ، و 1 مل لكل من 1 M CaCl2 و 1 M MgSO4 ، و 25 مل من 1 M فوسفات البوتاسيوم (درجة الحموضة 6.0). بعد الخلط جيدا ، وزع 8 مل لكل منها إلى 6 سم (في قطر) أطباق بتري.
    3. الحفاظ على لوحات مع أغطية على مقعد في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 يوم ، ومن ثم الاحتفاظ بها في البلاستيك في غرفة باردة حتى الاستخدام.
  2. تحضير وسط Luria-Bertani (LB) (الخطوة 2.1.) عن طريق إذابة 10 جم من التربتون و 5 جم من مستخلص الخميرة و 10 جم من كلوريد الصوديوم في 1 لتر من ddH2O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 مع 5 N NaOH (عدة قطرات) وتعقيمه عن طريق التعقيم.
    1. تحضير لوحات LB بإضافة 15 غرام من أجار إلى وسط LB. بعد التعقيم ، تبرد إلى ~ 60 درجة مئوية ووزع 12 مل لكل منها إلى 9 سم (في قطر) أطباق بتري. احتفظ بالأطباق في الأواني البلاستيكية في غرفة باردة حتى الاستخدام.
  3. لعمل جامع (الخطوة 2.4) ، قم بتوصيل شبكة من النايلون (حجم شبكة 30 ميكرومتر) بقاع أنبوب أسطواني أكريليك شفاف (طوله 3.5 سم ، قطره الخارجي 3 سم ، سمك الجدار 2 مم) بالغراء.
  4. لصنع محلول جيلاتيني مائي بنسبة 0.25٪ (الخطوة 2.4) ، قم بإذابة 0.25 جم من الجيلاتين في 100 مل من ddH2O. تعقيم عن طريق التعقيم.
  5. لوحات فحص الانجذاب الكيميائي (الخطوة 5.1.)
    1. لصنع ألواح أجار لمقايسة الانجذاب الكيميائي ، قم بإذابة 15 جم من الآجار في 993 مل من ddH2O عن طريق التعقيم ، وقم بتبريد المحلول إلى ~ 65 °C.
    2. بعد ذلك ، أضف 5 مل من فوسفات البوتاسيوم 1M المعقم (الرقم الهيدروجيني 6.0) ، و 1 مل من 1 M CaCl2 ، و 1 مل من 1 M MgSO4 إلى محلول أجار. يتم تعقيم كل هذه الحلول بشكل منفصل عن طريق التعقيم.
    3. وزعي 10 مل من المحلول المختلط على طبق بتري 6 سم. ضع هذه الأطباق ذات الأغطية على مقعد في RT لمدة يومين ، ثم ضعها على مناشف ورقية مبللة في الأواني البلاستيكية في RT حتى الاستخدام. يمكن استخدام هذه اللوحات لمدة تصل إلى 10 أيام.
  6. لجعل عازلة مقايسة الانجذاب الكيميائي (الخطوة 5.4.) ، امزج 5 مل من 1 M فوسفات البوتاسيوم (درجة الحموضة 6.0) ، 1 مل من 1 M CaCl 2 ، 1 مل من 1 M MgSO4 ، و 993 مل من ddH2O. تعقيم كل هذه الحلول بشكل منفصل عن طريق التعقيم.
  7. لعمل محلول خليط 40 مل CS / US (1٪ مائي 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 4.0]) (الخطوة 3.1. والخطوة 4.1.) ، أضف 0.4 مل من 1-بروبانول المطلق و 4 ميكرولتر من 5 M HCl (0.1 mM عند التركيز النهائي) إلى 39.6 مل من ddH2O. احتفظ بالمحلول عند RT.
  8. لجعل ddH2O ، عالج ماء الصنبور 2x بأنظمة تنقية المياه (راجع جدول المواد).
  9. تحضير مزرعة سائلة (OD600 = ~ 0.7) من الإشريكية القولونية OP50 عن طريق تلقيح مستعمرة جديدة بعود أسنان إلى 10 مل من وسط LB والتحضين عند 37 درجة مئوية لمدة 7-8 ساعات. يمكن أن تؤثر البكتيريا المزروعة لفترة أطول على نتيجة التكييف ، ربما بسبب المستقلبات الثانوية.

2. إعداد متزامن C.  ايليجانس

  1. باستخدام الطرق القياسية26 ، قم بزراعة الحيوانات على ألواح NGM مقاس 6 سم (الخطوة 1.1.). يتم تحضير ألواح NGM عن طريق نشر 0.2 مل من مزرعة سائل E. coli OP50 في وسط LB (انظر الخطوة 1.9 .) والتحضين عند RT لمدة لا تزيد عن 24 ساعة (يمكن أن تؤثر البكتيريا القديمة على نتيجة التكييف).
    ملاحظة: التعلم والذاكرة C. elegans حساسة للغاية للضغوط الميكانيكية والكيميائية ودرجة الحرارة. لذلك ، يوصى بشدة بزراعة الحيوانات ، والحفاظ على جميع الكواشف بما في ذلك الماء ، وإجراء جميع الفحوصات في RT بين 17 درجة مئوية و 20 درجة مئوية. يجب تجنب التحفيز البدني والميكانيكي مثل الدوامة ، والماصات الخشنة ، والطرد المركزي. يجب استخدام 1-بروبانول طازج كل 3 أشهر على الأطول لسبب غير معروف. الأهم من ذلك ، يجب زراعة الحيوانات مع الكثير من الطعام لأن الجوع يمكن أن يؤثر بشكل خطير على نتيجة التكييف.
  2. في اليوم 1 ، اختر وضع خمسة جاذبية جيدة التغذية (ضع المزيد من الحيوانات الطافرة التي تضع البيض ببطء) على كل من لوحات NGM الأربعة مقاس 6 سم مع منتقي دودة البلاتين ، واتركها تضع ~ 50 بيضة لمدة 3 ساعات في RT للحصول على مجموعة متزامنة من الحيوانات البالغة. توقف عن وضع البيض عن طريق إزالة الحيوانات الأم من الأطباق باستخدام منتقي دودة البلاتين.
    ملاحظة: يجب الاحتفاظ بالأطباق المصنفة في RT لتقليل الضغط على الحيوانات.
  3. قم بزراعة الحيوانات في RT لمدة 5 أيام تقريبا ، وهو الوقت الذي تستغرقه الحيوانات للوصول إلى مرحلة البلوغ الناضجة ، وليس مرحلة الشباب.
    ملاحظة: يجب تعديل فترة الاستزراع بين 4.5 أيام و 5.5 أيام اعتمادا على الظروف لأن الحيوانات البالغة الأصغر سنا أكثر حساسية للمواد الكيميائية المستخدمة في التكييف من الحيوانات البالغة الناضجة (الشكل التكميلي 1). بعد التكييف ، قد تظهر الحيوانات البالغة الأصغر سنا قيم مؤشر الانجذاب الكيميائي (CI).
  4. اجمع ~ 200 بالغ في جامع (انظر الخطوة 1.4.) عن طريق غسل كل طبق ب 1 مل من الجيلاتين المائي بنسبة 0.25٪ (الخطوة 1.4.) يمنع هذا الجيلاتين المائي التصاق الحيوانات بسطح البلاستيك مثل أطراف الماصة.
  5. اغسل الحيوانات في المجمع باستخدام ddH 2 O (الخطوة 1.8.) عن طريق تحريك المجمع برفق شديد لأعلى ولأسفل 2x في ~ 10 مل من ddH 2 O. كرر هذه العملية مرتين أكثر(3x في المجموع) مع ~ 10 مل من ddH2O لكل منهما لمنع التلوث البكتيري.
    ملاحظة: يؤثر التلوث البكتيري بشكل خطير على الانجذاب الكيميائي للحيوانات.

3. التدريب الشامل للتعلم الترابطي قصير المدى والذاكرة

ملاحظة: انظر الشكل 1 للاطلاع على سير عمل التدريب الشامل.

  1. اغمر برفق جامع الحيوانات الذي يحتوي على ~ 200 في 40 مل من خليط من 1٪ 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 4.0 بعد الخلط مع 1-بروبانول ؛ انظر الخطوة 1.7.) في طبق تبلور لمدة ~ 1 ثانية.
    ملاحظة: بالنسبة للحيوانات الضابطة ، افعل الشيء نفسه ولكن اغمس فقط في 1٪ مائي 1-بروبانول. سيكون من الأفضل معاملة الحيوانات مع حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 4.0) فقط كعنصر تحكم آخر.
  2. اغسل الحيوانات في المجمع عن طريق غمر المجمع برفق شديد 1x في 10 مل من ddH2O في بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار.
    ملاحظة: يجب أن تكون خطوة الغسيل هذه لطيفة جدا وأن تتم فقط 1x لأن الغسيل المكثف قد يمنع التعلم.
  3. كرر الخطوات 3.1. و 3.2. 10x دون انقطاع (الفاصل الزمني بين التجارب [ITI] ، 0 دقيقة).
    ملاحظة: استخدم ddH2O الطازج في كل مرة في RT.
  4. ضع المجمع على عشب E. coli OP50 على طبق NGM مقاس 6 سم لمدة 10 دقائق في RT حتى تستريح الحيوانات.
  5. اغسل الحيوانات في المجمع باستخدام ddH 2 O عن طريق تحريك المجمع برفق شديد لأعلى ولأسفل 2x في ~ 10 مل من ddH 2 O. كرر هذه العملية مرتين أكثر(3x في المجموع) مع ~ 10 مل من ddH2O لكل منهما لمنع التلوث البكتيري.
  6. انتقل إلى اختبار الانجذاب الكيميائي كما هو موضح أدناه (الخطوة 5).

4. التدريب المتباعد للتعلم الترابطي طويل الأجل والذاكرة

ملاحظة: انظر الشكل 2 للاطلاع على سير عمل التدريب المتباعد.

  1. اغمر بلطف جامع يحتوي على ~ 200 في 40 مل من خليط من 1٪ 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 4.0 بعد الخلط مع 1-بروبانول ؛ انظر الخطوة 1.7.) في طبق بلوري لمدة ~ 1.0 ثانية.
    ملاحظة: افعل الشيء نفسه مع 1٪ مائي 1-بروبانول فقط كعنصر تحكم. سيكون من الأفضل معاملة الحيوانات مع حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 4.0) فقط كعنصر تحكم آخر.
  2. اغسل الحيوانات في المجمع عن طريق غمر المجمع لفترة وجيزة جدا 1x في 10 مل من ddH2O في بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار.
    ملاحظة: يجب أن يكون هذا الغسيل قصيرا جدا لأن الغسيل المكثف قد يمنع التعلم.
  3. ضع المجمع على عشب E. coli OP50 على طبق أجار NGM في طبق بتري بقطر 6 سم (بقطر) لمدة 10 دقائق في RT حتى تستريح الحيوانات.
    ملاحظة: هذا الراحة لمدة 10 دقائق حيث أن ITI أمر بالغ الأهمية للحيوانات لتوحيد الذكريات لتشكيل LTM.
  4. كرر الخطوات 4.1.-4.3. 10x.
  5. اغسل الحيوانات في المجمع باستخدام ddH 2 O عن طريق تحريك المجمع برفق شديد لأعلى ولأسفل 2x في ~ 10 مل من ddH 2 O ، والذي يتم الاحتفاظ به فيRT. كرر هذه العملية 2x أكثر (3x في المجموع) مع ~ 10 مل من ddH2O لكل منهما لمنع التلوث البكتيري.
  6. انتقل إلى فحص الانجذاب الكيميائي كما هو موضح أدناه (الخطوة 5.).

5. فحص الانجذاب الكيميائي

  1. قم بإعداد ألواح أجار لفحص الانجذاب الكيميائي في أطباق بتري بلاستيكية مقاس 6 سم (انظر الخطوة 1.5.).
  2. نقل الحيوانات في المجمع (الخطوة 2.5) ، والتي يتم وضعها على سطح مستو من غطاء طبق بتري البلاستيكي ، إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل مع 1 مل من الجيلاتين المائي بنسبة 0.25٪ باستخدام طرف ماصة منشور مع فتحة >1 مم (قطر داخلي).
    ملاحظة: من المهم استخدام طرف ماصة مقطوع لتقليل إجهاد القص على الحيوانات.
  3. قم بإزالة المادة الطافية من الأنبوب بعد أن تستقر الحيوانات في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية لمدة ~ 1 دقيقة (لا تعمل بالطرد المركزي).
  4. أعد تعليق الحيوانات برفق في 1 مل من مخزن مقايسة الانجذاب الكيميائي (انظر الخطوة 1.6.) واتركها تستقر عن طريق الجاذبية إلى قاع الأنبوب لمدة ~ 1 دقيقة (لا تعمل بالطرد المركزي). قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية عن طريق سحب العينات.
  5. في هذه الأثناء ، بقعة قطرية 4 ميكرولتر لكل من 5٪ مائي 1-بروبانول في مكانين وبقعة 4 ميكرولتر لكل من ddH2O في مكانين آخرين بنفس الطريقة ، كما هو موضح في الشكل 3A. بالنسبة لمقايسة الانجذاب الكيميائي للمتحولات التي لديها حساسية أقل ل 1-بروبانول ، حدد تركيزات أعلى من 1-بروبانول المائي الذي ينتج عنه ~ 0.6 قيم مؤشر الانجذاب الكيميائي (CI) للمتحولات الساذجة ، كما هو موضح في الجدول التكميلي 1.
    ملاحظة: من المهم إكمال إجراءات الإكتشاف في أسرع وقت ممكن. بقعة 5٪ مائي 1-بروبانول لأن 1٪ مائي 1-بروبانول أضعف من أن يجذب الحيوانات في مقايسة الانجذاب الكيميائي. في المقابل ، استخدم 1٪ مائي 1-بروبانول للتكييف لأن الحيوانات المعالجة بتركيزات أعلى من 1-بروبانول مائي من 1٪ تظهر قيم CI أقل.
  6. بقعة 6 ميكرولتر أجزاء من تعليق الحيوان في عازلة مقايسة الانجذاب الكيميائي (الخطوة 5.4.) تحتوي على ~ 60 حيوانا في وسط ثلاث لوحات لمقايسة الانجذاب الكيميائي باستخدام طرف ماصة منشور مع فتحة ~ 1.0 مم (القطر الداخلي). قم بإزالة السائل قدر الإمكان باستخدام فتيل أنسجة المختبر دون لمس الحيوانات ووضع غطاء على اللوحة.
    ملاحظة: من المهم إكمال هذه الإجراءات في أسرع وقت ممكن.
  7. اسمح للحيوانات بالتحرك بحرية على الطبق لمدة 10 دقائق في RT ، ثم انقل الطبق إلى طبق بتري زجاجي على الثلج لمدة 3 دقائق لإيقاف الانجذاب الكيميائي. ثم احتفظ بالطبق في الثلاجة حتى حساب عدد الحيوانات على اللوحة.
  8. احسب عدد الحيوانات في أربعة أقسام، باستثناء تلك الموجودة في الدائرة المركزية، تحت المجهر المجسم، واحسب مؤشر الانجذاب الكيميائي (C.I.) باستخدام المعادلة الموضحة في الشكل 3 ب. من قيم CI ، احسب قيم مؤشر التعلم (L.I.) كفرق بين قيمة C.I. للحيوانات المرجعية وقيمة C.I. للحيوانات المشروطة (L.I. = C.I.reference- C.I.conditioned).
    ملاحظة: قيمة C.I. للحيوانات المرجعية (C.I.reference) هي القيمة المتوسطة لقيم C.I. للحيوانات المشروطة ب 1٪ مائي 1-بروبانول فقط.

Representative Results

تم تكييف C. elegans من خلال التدريب الجماعي لتشكيل ذاكرة ترابطية مكروهة قصيرة المدى عن طريق إقران 1٪ مائي 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 4.0) مثل CS والولايات المتحدة ، على التوالي. وفقا للبروتوكول الموصوف أعلاه ، تمت تربية الحيوانات المتزامنة على مقعد عند RT من 18 درجة مئوية لمدة 5 أيام وتم غسلها بلطف شديد 2x مع ddH2O عند RT من 18 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم تكييف الحيوانات بمزيج من 1٪ مائي 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 4.0) لمدة 1 ثانية. قمنا أيضا بتدريب الحيوانات باستخدام ddH2O فقط ، و 1٪ مائي 1-بروبانول فقط ، وحمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 4.0) فقط كمراجع. بعد التكييف ، تم غسل الحيوانات 1x مع ddH2O. كررنا التكييف 10x دون انقطاع (لا ITIs). تم تحقيق التكييف الناجح من خلال تكرار الإجراء أكثر من 7x حتى 10x. أدى تكييف أكثر من 10x إلى تعلم أقل كفاءة21. بعد التدريب ، استقرت الحيوانات على طعام بكتيري لمدة 10 دقائق عند RT (18 درجة مئوية). بعد غسلها باستخدام ddH2O 3x ، تم نقل الحيوانات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق عن طريق تعليق الجيلاتين المائي بنسبة 0.25٪ واستقر في القاع عن طريق الجاذبية. بعد إزالة المادة الطافية قدر الإمكان ، تم إعادة تعليق الحيوانات برفق في مخزن مقايسة الانجذاب الكيميائي ثم سمح لها بالاستقرار في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية.

بعد إزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية ، تم رصد تعليق الحيوان على الدائرة المركزية للوحة فحص الانجذاب الكيميائي ، والتي تم الاحتفاظ بها عند RT من 18 درجة مئوية ، ثم سمح للحيوانات بالتحرك بحرية على اللوحة لمدة 10 دقائق عند RT من 18 درجة مئوية. تم حساب قيم CI باستخدام المعادلة الموضحة في الشكل 3B. كما هو موضح في الشكل 4 أ ، لم تعد الحيوانات المشروطة بمزيج 1٪ 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك تنجذب إلى 5٪ 1-بروبانول المرقط على ألواح أجار لفحص الانجذاب الكيميائي ، في حين أن الحيوانات الساذجة والمرجعية انجذبت بالمثل إلى 5٪ 1-بروبانول. بعد التدريب الجماعي (الخطوة 3.) ، لم تعد الذاكرة تلاحظ في غضون 3 ساعات20. علاوة على ذلك ، كانت الذاكرة التي شكلها التدريب الجماعي حساسة للصدمة الباردة20. توضح هذه النتائج أن C. elegans نجحت في تشكيل STM المكروه من خلال التدريب الجماعي.

تم تكييف الحيوانات أيضا من خلال التدريب المتباعد 10x مع 10 دقائق ITI بين خطوات التدريب (الخطوة 4.). خلال ITI ، تم وضع المجمع مع الحيوانات على العشب البكتيري على لوحة NGM 6 سم عند RT من 18 درجة مئوية. لم تعد الحيوانات المشروطة بالتدريب المتباعد بمزيج من 1٪ مائي 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 4.0) تنجذب إلى 5٪ 1-بروبانول مقارنة بالحيوانات المعالجة ب 1٪ 1-بروبانول فقط ، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 4.0) فقط ، أو ddH2O فقط (الشكل 4 ب). بعد التدريب المتباعد ، احتفظت الحيوانات بالذاكرة لأكثر من 12 ساعة20,21. علاوة على ذلك ، لم تتشكل الذاكرة عندما عولجت الحيوانات بمثبطات الترجمة أو النسخ وكانت مقاومة للصدمة الباردة20,21. لذلك ، نجحت C. elegans في تشكيل LTM المكروه عن طريق التدريب المتباعد.

درسنا أيضا آثار الطفرات في "جينات التعلم والذاكرة" على تكوين STM و LTM. يشفر جين crh-1 عامل النسخ في كل مكان بروتين ربط عنصر استجابة cAMP (CREB) ، ويشفر glr-1 و nmr-1 α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) - النوع و N-methyl-D-aspartate (NMDA) - وحدات فرعية لمستقبلات الغلوتامات ، على التوالي ، ويشفر stau-1 بروتين Staufen المرتبط بالحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل. تلعب هذه الجينات أدوارا أساسية في التكييف الكلاسيكي في C. elegans و Drosophila و Aplysia والفئران. باستخدام خليط من 1٪ مائي 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 4.0) ، كان تكوين STM و LTM يعتمد على جميع الجينات (الأشكال 5 أ ، ب).

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي تجريبي للتدريب الجماعي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: رسم تخطيطي تجريبي للتدريب المتباعد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: فحص الانجذاب الكيميائي ومؤشر الانجذاب الكيميائي. (أ) تمثيل تخطيطي للوحة مقايسة الانجذاب الكيميائي. تم فصل أطباق بتري (قطرها 6 سم) إلى أربع مناطق كما هو موضح ، وتم رصد 4 ميكرولتر لكل منها 5٪ مائي 1-بروبانول أو ddH 2 O قطريا في مكانين لكل منهما ، على بعد2سم من المركز. (ب) تم حساب قيم مؤشر الانجذاب الكيميائي من المعادلة الموضحة بحساب عدد الحيوانات في المنطقتين "أ" و "ب" بعد الانتهاء من الانجذاب الكيميائي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: قيم مؤشر الانجذاب الكيميائي للحيوانات المكيفة بالمواد الكيميائية. تم تكييف الحيوانات البرية المتزامنة من النوع N2 بمواد كيميائية يشار إليها بواسطة (A) التدريب الجماعي 10x أو (B) التدريب المتباعد 10x. يتم عرض المخططات الانسيابية لبروتوكولات التدريب الجماعي والمتباعد المستخدمة في الشكل 1 والشكل 2 ، على التوالي. بعد التكييف ، كانت الحيوانات حرة في التحرك لمدة 10 دقائق على صفيحة أجار 6 سم لفحص الانجذاب الكيميائي عند RT من 18 درجة مئوية. تم حساب قيم CI باستخدام المعادلة الموضحة في الشكل 3B. وترد بيانات هذا الرقم في الجدول التكميلي 1. تم إعادة رسم البيانات من الحيوانات الساذجة في كلا لوحتي الشكل. يظهر مخطط الشريط الربع 1 والمتوسط والربع 3. تشير العلامات النجمية (* P < 0.05) إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية تحددها ANOVA أحادية الاتجاه متبوعة باختبار المقارنة المتعددة ل Dunnett. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تعلم قيم مؤشر الحيوانات الطافرة المكيفة. تم تكييف الحيوانات البرية المتزامنة من النوع N2 والحيوانات الطافرة المشار إليها بمزيج من 1٪ مائي 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 4.0) بواسطة (A) التدريب الجماعي 10x أو (B) التدريب المتباعد 10x. يتم عرض المخططات الانسيابية لبروتوكولات التدريب الجماعي والمتباعد المستخدمة في الشكل 1 والشكل 2 ، على التوالي. بعد التكييف ، كانت الحيوانات حرة في التحرك لمدة 10 دقائق على صفيحة أجار 6 سم لفحص الانجذاب الكيميائي عند RT من 18 درجة مئوية. وترد بيانات هذا الرقم في الجدول التكميلي 2. يظهر مخطط الشريط الربع 1 والمتوسط والربع 3. تشير العلامات النجمية (* P < 0.05) إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية تحددها ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار المقارنة المتعددة ل Dunnett. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: الحيوانات البالغة الصغيرة حساسة للمعالجة الكيميائية. اليوم 4 واليوم 5 تم تدريب الحيوانات البرية N2 من النوع بعد الفقس على الكتلة 10x مع HCl ، درجة الحموضة 4.0 ، دون انقطاع ثم تم فحصها من أجل الانجذاب الكيميائي إلى 5٪ مائي 1-بروبانول. القضبان تعني ± S.E.M. (ن = 19). تشير العلامات النجمية (* P < 0.05) إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية تحددها ANOVA ثنائية الاتجاه متبوعة باختبار Tukey-Kramer البعدي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: البيانات المقابلة للشكل 4. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 2: البيانات المقابلة للشكل 5. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

في الدراسة الحالية ، تم الاحتفاظ بجميع الكواشف عند RT ~ 18 °C في المتوسط ، وتم تربية الحيوانات على مقعد في RT لتجنب الإجهاد للحيوانات. علاوة على ذلك ، تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية في RT. تم تربية الحيوانات في البداية في حاضنة عند 20 درجة مئوية ثم تكييفها على مقعد عند ~ 24 درجة مئوية باستخدام الكواشف في RT. في ظل هذه الظروف ، كانت نتائج التكييف متغيرة للغاية. عند انخفاض RT ، تنمو C. elegans ببطء ويجب زراعتها لفترة أطول من 20 درجة مئوية حتى تصل الحيوانات إلى مرحلة البلوغ الناضجة ، حيث أن الحيوانات البالغة الأصغر سنا أكثر حساسية للمواد الكيميائية المستخدمة في التكييف من الحيوانات البالغة الناضجة وقد تظهر قيم CI أقل.

الخطوة الأكثر أهمية للتكييف الناجح هي غسل الحيوانات باستخدام ddH2O مباشرة بعد كل معالجة كيميائية. لذلك ، يجب تقليل الضغوط الميكانيكية ودرجة الحرارة باستخدام أطراف الماصة المنشورة ، والحفاظ على الكواشف في RT ، وغسل الحيوانات بلطف شديد عن طريق تحريك جامع الحيوانات ببطء شديد لأعلى ولأسفل في ddH2O. قد يؤثر الغسيل الشامل للحيوانات في كل مرة بعد التكييف على التعلم والذاكرة. تؤثر ظروف لوحات فحص الانجذاب الكيميائي أيضا بشدة على النتائج. لوحات جافة جدا أو رطبة جدا تمنع الحركة السلسة للحيوانات. تم إعداد اللوحات كما هو موضح في الخطوة 1.; الصفيحة الجيدة هي الصفيحة التي يمتص فيها الآجار تماما بقع 4 ميكرولتر من ddH2O أو 5٪ مائي 1-بروبانول في حوالي 5 دقائق بعد اكتشافها. كما هو موضح أعلاه ، فإن أعمار الحيوانات ضرورية أيضا لتكييف ناجح. الحيوانات البالغة من العمر حساسة للمعالجة الميكانيكية والكيميائية ، مما يؤدي إلى نتائج متغيرة ، على الرغم من أن الحيوانات المسنة جدا قد لا تكون مناسبة للتكييف أيضا.

تعتمد مدة صلاحية 1-بروبانول على العلامات التجارية والكثير وهي أقل من 3 أشهر في RT. عندما تزداد قيم CI للحيوانات الساذجة سوءا ، يوصى باستخدام 1-بروبانول طازج لفحص التكييف والانجذاب الكيميائي.

لم يتأثر تكوين الذاكرة عن طريق التدريب الجماعي بمعالجة الحيوانات بمثبطات الترجمة (سيكلوهيكسيميد وأنيسوميسين) ومثبط النسخ (أكتينومايسين د) ، في حين تم تثبيط تكوين الذاكرة بواسطة التدريب المتباعد بشكل ملحوظ بواسطة مثبطات20,21. علاوة على ذلك ، اضمحلت الذاكرة الأولى بسبب الصدمة الباردة ، بينما تم الاحتفاظ بالأخيرة لفترة أطول من الأولى وكانت مقاومة للصدمة الباردة. توضح هذه النتائج أن الأول هو STM والأخير هو LTM ، على التوالي20,21. ومع ذلك ، قد تتكون الذاكرة التي يشكلها التدريب الجماعي من STM والذاكرة متوسطة المدى (متوسطة المدى) لأن STM تعتمد بشكل ضعيف على عامل نسخ CREB (الشكل 5 أ). هذا يتفق مع النتيجة التي تم الاحتفاظ بها STM لأكثر من 1 ساعة20,21. يعتمد تكوين كل من STM و LTM بشكل كبير على nmr-1 ، والذي يتم التعبير عنه فقط في ستة أزواج من الخلايا العصبية (AVA ، AVD ، AVE ، RIM ، AVG ، و PVC) في C. elegans27,28. في هذه الخلايا العصبية ، لذلك ، قد تعمل مستقبلات NMDA ككاشف مصادفة جزيئية لإشارات 1٪ مائية 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (pH 4.0) للدونة المشبكية ، حيث يمكن أن ينتج التقوية المشبكية المطلوبة لكل من STM و LTM عن إطلاق عرضي للخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي29،30،31،32،33. لذلك ، قد تتشكل الذاكرة الترابطية المكروهة بين الخلايا العصبية البينية.

يجب أن تكون الطرق الموضحة في الدراسة الحالية قابلة للتطبيق على التعلم الشمي الفاتح للشهية والذاكرة الترابطية قصيرة المدى وطويلة المدى باستخدام 1-nonanol مثل CS وكلوريد البوتاسيوم مثل US21. من المثير للاهتمام مقارنة الدوائر العصبية التي تشارك في تكوين ذكريات شهية ومكروهة.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نحن ممتنون لتاكاشي موراياما وإي-إيتشيرو سايتا وإيو فين تشانغ وهيتومي أوتاكي على مساعدتهم الفنية وتعليقاتهم على المخطوطة. تم توفير السلالات من قبل مركز Caenorhabditis Genetics Center ، الذي يموله المركز الوطني لموارد الأبحاث (NCRR). تم دعم هذا العمل بتمويل من معهد أوكيناوا للعلوم والتكنولوجيا جامعة الدراسات العليا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL beaker HARIO B-500-H32
10 µL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-104-96RS-Q
0.2 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific TTW110RS-Q
1.0 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-111-R100NS-Q
1.5 mL plastic tubes Eppendorf 0030120086
2 mL plastic tubes Eppendorf 0030120094
10 mL Serological pipettes As One 2-5237-04
50 mL Serological pipettes As One 2-5237-06
6-well cell culture plate Costar 3516
Aron Alpha (Glue for plastic) Toagosei High Speed EX
Autoclave Tomy Digital Biology SX-300
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Bottle top 0.2 µm filter units Thermo Fisher Scientific 566-0020
Bunsen burner EISCO SKU CH0089A
Calcium chloride dihydrate Nacalai Tesque 06730-15
C. elegans mutant strains Caenorhabditis Genetics Center
Cholesterol Wako Pure Chemical Industries 034-03002
Clear acrylic cylindrical pipe Asahi Kasei 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness)
Crystallizing dish Pyrex 3140-80
Dental burner Phoenix-Dent APT-3
Di-potassium hydrogen phosphate Nacalai Tesque 28726-05
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center
Electric pipetter Drummond Scientific 4-000-101
Gelatin Wako Pure Chemical Industries 073-06295
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) As One  Trade FLAT Mark
Heating magnetic stirrer Thermo Fisher Scientific SP131324
Hydrochloric acid Nacalai Tesque 37345-15
Incubator SANYO MIR-553
Kimwipes S-200 Nippon Paper Crecia 62011
Laboratory coat TOYO LINT FREE FH240C
Magnesium sulfate heptahydrate Nacalai Tesque 21002-85
Magnetic stirrer bar SANSYO 93-5412
Metal spatula FUJIFILM Wako 647-06531
Nitrile gloves Kimberly-Clark KC100
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) SEFAR NY30-HD
P10 pipetman Gilson F144802
P200 pipetman Gilson F123600
P1000 pipetman Gilson F123602
pH meter HORIBA  Navi F-52
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) IWAKI SH90-15E
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) SARSTEDT 82.1194.500
Plastic weighing boats As One 1-5233-01
Platinum wire for a worm pick Nilaco PT-351265
1-Propanol SIGMA-ALDRICH 279544
Potassium dihydrogen phosphate Nacalai Tesque 28721-55
Safety goggles Kimberly-Clark #25646
Sodium chloride Nacalai Tesque 31320-05
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tooth picks
Water purification sysytem Merck Elix Essential 10 UV
Water urification sysytem Merck Milli-Q Synthesis A10
Weighing balance METTLER  TOREDO
Wild type C. elegans strain N2 Caenorhabditis Genetics Center

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
  2. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  3. Witvliet, D., et al. Connectomes across development reveal principles of brain maturation. Nature. 596, 257-261 (2021).
  4. Hedgecock, E. M., Russell, R. L. Normal and mutant thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (10), 4061-4065 (1975).
  5. Mohri, A., et al. Genetic control of temperature preference in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 169 (3), 1437-1450 (2005).
  6. Wen, J. Y. M., et al. Mutations that prevent associative learning in C. elegans. Behavioral Neuroscience. 111 (2), 354-368 (1997).
  7. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Biology. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  8. Tomioka, M., et al. The insulin/PI3-kinase pathway regulates salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. Neuron. 51 (5), 613-625 (2006).
  9. Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. Journal of Neuroscience. 27 (4), 741-750 (2007).
  10. Kaufman, A. L., Ashraf, J. M., Corces-Zimmerman, M. R., Landis, J. N., Murphy, C. T. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biology. 8 (5), 1000372 (2010).
  11. Stein, G. M., Murphy, C. T. C. elegans positive olfactory associative memory is a molecularly conserved behavioral paradigm. Neurobiology of Learning and Memory. 115, 86-94 (2014).
  12. Rahmani, A., Chew, Y. L. Investigating the molecular mechanisms of learning and memory using Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 159 (3), 417-451 (2021).
  13. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook. 25, 1-29 (2006).
  14. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3184-3191 (2005).
  15. Cho, C. E., Brueggemann, C., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Parallel encoding of sensory history and behavioral preference during Caenorhabditis elegans olfactory learning. eLife. 5, 14000 (2016).
  16. Juang, B. T., et al. Endogenous nuclear RNAi mediates behavioral adaptation to odor. Cell. 154 (5), 1010-1022 (2013).
  17. Neal, S. J., et al. Feeding state-dependent regulation of developmental plasticity via CaMKI and neuroendocrine signaling. eLife. 4, 10110 (2015).
  18. Castellucci, V. F., Kandel, E. R. A quantal analysis of the synaptic depression underlying habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5004-5008 (1974).
  19. Klein, M., Kandel, E. R. Mechanism of calcium current modulation underlying presynaptic facilitation and behavioral sensitization in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (11), 6912-6916 (1980).
  20. Amano, H., Maruyama, I. N. Aversive olfactory learning and associative long-term memory in Caenorhabditis elegans. Learning & Memory. 18 (10), 654-665 (2011).
  21. Nishijima, S., Maruyama, I. N. Appetitive olfactory learning and long-term associative memory in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 80 (2017).
  22. Morrison, G. E., Wen, J. Y. M., Runciman, S., vander Kooy, D. Olfactory associative learning in Caenorhabditis elegans is impaired in lrn-1 and lrn-2 mutants. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 358-367 (1999).
  23. Morrison, G. E., vander Kooy, D. A mutation in the AMPA-type glutamate receptor, glr-1, blocks olfactory associative and nonassociative learning in Caenorhabditis elegans. Behavioral Neuroscience. 115 (3), 640-649 (2001).
  24. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  25. Sambongi, Y., et al. Caenorhabditis elegans senses protons through amphid chemosensory neurons: Proton signals elicit avoidance behavior. Neuroreport. 11 (10), 2229-2232 (2000).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  27. Brockie, P. J., Madsen, D. M., Zheng, Y., Mellem, J., Maricq, A. V. Differential expression of glutamate receptor subunits in the nervous system of Caenorhabditis elegans and their regulation by the homeodomain protein UNC-42. Journal of Neuroscience. 21 (5), 1510-1522 (2001).
  28. Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T., Madsen, D. M., Maricq, A. V. The C. elegans glutamate receptor subunit NMR-1 is required for slow NMDA-activated currents that regulate reversal frequency during locomotion. Neuron. 31 (4), 617-630 (2001).
  29. Gustafsson, B., Wingstrom, H. Physiological mechanisms underlying long-term potentiation. Trends in Neuroscience. 11 (4), 156-162 (1988).
  30. Kauer, J. A., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. A persistent postsynaptic modification mediates long-term potentiation in the hippocampus. Neuron. 1 (10), 911-917 (1988).
  31. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: Long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
  32. Bailey, C. H., Giustetto, M., Huang, Y. Y., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Is heterosynaptic modulation essential for stabilizing Hebbian plasticity and memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 11-20 (2000).
  33. Miyashita, T., et al. Mg2+ block of Drosophila NMDA receptors is required for long-term memory formation and CREB-dependent gene expression. Neuron. 74 (5), 887-898 (2012).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 184 ،
التعلم الترابطي الانعكاسي وتكوين الذاكرة عن طريق إقران مادتين كيميائيتين في <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shibutani, M., Vibulyaseck, S.,… More

Shibutani, M., Vibulyaseck, S., Maruyama, I. N. Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (184), e64137, doi:10.3791/64137 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter