Summary
本协议描述了一种注射蜱虫胚胎的方法。胚胎注射是遗传操作产生转基因系的首选技术。
Abstract
蜱虫可以传播各种病毒、细菌和原生动物病原体，因此被认为是具有医学和兽医重要性的载体。尽管蜱传疾病的负担越来越大，但由于将遗传转化工具应用于功能研究蜱的独特生物学的挑战，对蜱虫的研究仍然落后于昆虫病媒。遗传干预在减少蚊媒疾病方面越来越受到关注。然而，这种干预措施的发展需要通过注射胚胎来稳定地转化种系。螯合物（包括蜱虫）缺乏这种胚胎注射技术。几个因素，例如蜱胚胎上的外部厚蜡层、硬绒毛膜和高卵内压力，是以前阻碍蜱虫胚胎注射方案发展的一些障碍。目前的工作已经克服了这些障碍，这里描述了一种用于黑腿蜱（ 肩突硬 蜱）的胚胎注射技术。该技术可用于递送组分，如CRISPR/Cas9，以实现稳定的种系转化。
Introduction
蜱是具有医学和兽医重要性的载体，能够传播各种病毒、细菌、原生动物病原体和线虫1，2。在美国东部，黑腿蜱，肩突硬蜱，是莱姆病（LD）病原体伯氏螺旋体伯氏疏螺旋体的重要载体。美国每年报告的LD病例超过40万例，使其成为美国最大的媒介传播传染病1。除伯氏双歧杆菌外，肩突双歧杆菌还传播其他六种微生物，包括四种细菌（嗜吞噬细胞无形体、蛋黄孢杆菌、宫本双歧杆菌和穆氏埃立克体）、一种原生动物寄生虫（小巴贝虫）和一种病毒（波瓦桑病毒），使这种蜱虫物种成为主要的公共卫生问题3 .虽然近年来蜱传疾病变得越来越普遍，但由于蜱的独特生物学以及与应用遗传和功能基因组工具相关的挑战，对蜱虫的研究已经落后于其他节肢动物媒介，如蚊子4，5。
基因编辑技术，特别是CRISPR / Cas9，现在已经使功能基因组学研究在非模式生物中变得可行。为了在生物体中产生可遗传的突变，胚胎注射仍然是递送改变种系6，7，8，9的构建体的首选方法。然而，直到最近 4，蜱虫卵被认为太难甚至不可能在不杀死胚胎的情况下注射10，11。鸡蛋上厚厚的蜡层、坚硬的绒毛膜和高卵内压力是阻止蜱虫胚胎注射的一些主要障碍。成年，血饲肩胛骨I.在3-4周内沉积一窝多达2，000个卵12（约100个卵/天）。卵单独产下，每个卵都涂有蜡，蜡是由母亲的腺体器官13，14，15的突起或“角”分泌的。这种蜡可以保护鸡蛋免受干燥，并含有抗菌化合物15。为了成功注射蜱虫卵，重要的是要去除蜡层，软化绒毛膜，并使卵干燥以降低卵内压力，以使注射不会不可逆转地损害卵。了解胚胎注射对成功种系转化的至关重要性，开发了肩胛弧菌方案，可用于递送 CRISPR/Cas9 构建体并产生稳定的种系突变4.除了对肩胛蜱研究的贡献外，该协议还可以针对其他蜱物种进行优化。
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Protocol
肩突硬蜱 成虫要么从俄克拉荷马州立大学（OSU）购买，要么在内华达大学里诺分校（UNR）饲养（IACUC协议#21-001-1118）。
1. 制备用于胚胎采集的雌性蜱虫
注意：要收集适当年龄的卵子，同步产卵很重要。虽然蜱虫的产卵线索尚不清楚，但在标准昆虫条件下（27°C温度和>90%相对湿度（RH））， 肩突蜱 雌性在宿主脱离后约8天开始产卵。该时间表可以通过在4°C下储存充满雌性来延长。 我们将血液喂养的雌性储存在4°C长达8周，对产卵没有任何负面影响。对于每种昆虫，可能需要修改这些条件。
- 将所有充满的雌性储存在4°C，>90%RH中，内衬有湿滤纸的6夸脱塑料盒中，直到用于显微注射。
- 注射前一周，将雌性从4°C转移到27°C培养箱中以开始产卵。
- 当雌性开始产卵时（将它们移动到27°C后3-4天），使用细尖画笔去除任何卵，并为雌性准备Gené的器官（蜡腺）消融术。
注意：Gené的器官从骷髅和头鳞之间的区域（口器的背基部）延伸，口器在腹体表面弯曲（平行于表面），一旦产卵，延伸的Gene器官就会覆盖卵子（图1）。在Gené的器官切除或排空蜡之前产下的卵子将具有蜡涂层，不适合注射，必须丢弃。 - 要移除或清空Gené的器官，请使用粘土将充血的雌性放置在显微镜下的载玻片上，以便在腹侧和背侧都可以看到口器（图1B，C）。
- 按照先前发布的协议16 ，使用实验室中用钨丝制造的细镊子和钨针仔细戳破刀和口器之间的区域（针头也可以商业购买，并连接到显微解剖探针，参见 材料表）。
- 用钨针在里面工作，将蜡腺拉出（图1D，E）。移除腺体可能需要几分钟。使用实验室湿巾擦去任何液体蜡分泌物。
注意：腺体也可以从口器正下方的腹侧移除;通过用针和镊子向后伸向黄臜。在口器周围涂上硅胶也可以阻止Gene的器官外翻，可以用来代替去除或排空蜡（与法国INRAE的Ladislav Simo博士的个人交流）。充血的蜱虫不会停留在双面胶带上。使用粘土“襁褓”蜱虫有助于在操作过程中将它们保持在适当的位置。用镊子夹住蜱虫，用钨针夹住蜱虫，用钨针进行解剖。腹侧部分更容易用针刺穿，是作者的首选。
- 要排空腺体，请按照步骤1.4中提到的排列妊娠滴答声。小心地刺穿背侧口器后面的区域，并使用镊子在腹侧施加压力。
注意：或者，没有必要去除蜡腺;清空腺体的蜡将持续几天。产卵雌性在口器周围有一个白色区域，指示蜡腺的位置，可以作为参考。- 放置无绒实验室湿巾的边缘，并去除从穿刺部位流出的液体蜡。确保避免血淋巴分泌，与略带黄色粘稠的蜡相比，血淋巴是一种透明液体。可能需要5-10分钟，直到大部分蜡被去除。
- 操作后，将雌性置于27°C（>90%RH）的培养箱中，并让它们恢复1-2天。
注意：接受治疗的雌性通常需要 1-2 天才能恢复并再次开始产卵。 - 当雌性再次开始产卵时，使用细画笔收集新鲜沉积的卵（产卵后0-18小时），并将它们放入1.5mL微量离心管中。
注意：如果随着时间的推移使用来自同一雌性的卵子，如果没有去除腺体，则必须在产卵 4-5 天后重复此过程。
2. 显微注射的胚胎治疗
- 在含有0-18小时龄鸡蛋的管中加入~200μL（或足够的体积以覆盖鸡蛋，取决于鸡蛋的数量）的5%（重量/体积）苯扎氯铵/水（参见 材料表）。用画笔轻轻旋转鸡蛋5分钟，以避免鸡蛋沉降到管子底部（有关详细信息，请参阅Sharma等人4）。使用微量移液管除去上清液，将卵子留在管中。
注意：苯扎氯铵对皮肤和眼睛有腐蚀性，请戴手套和护目镜。 - 将 ~200 μL 蒸馏 （DI） 水加入装有鸡蛋的管中，用画笔旋转，并使用微量移液管从微量离心管中取出水。再次用去离子水重复洗涤。
- 用去离子水洗涤后，加入~200μL的5%（w / v）氯化钠（NaCl），并用画笔轻轻旋转5分钟。5分钟后从管中取出溶液，并用去离子水清洗鸡蛋两次。
- 在含有鸡蛋的微量离心管中加入 ~100 μL 的 1% （w/v） NaCl 溶液。将卵子保存在1%（w / v）NaCl溶液中，直到它们用于注射。
- 大约一个小时后开始显微注射。这个时间表有助于鸡蛋的适当干燥并防止它们破裂。
注意：鸡蛋可以在1%（w / v）NaCl溶液中保存7-8小时，而不会显着影响存活。如果卵子难以注射或破裂，则卵子干燥不足，可以用5%（w / v）NaCl进一步处理5分钟。
3.注射针的制备
- 按照制造商的说明将铝硅酸盐毛细管玻璃（带灯丝，请参阅 材料表）插入拔针器。
- 将拔针器调整为以下设置：热量：575，拉力：20，速度：50，时间：200，压力：700。
- 激活拔针器的拉动功能，并对其他针重复该过程。
- 将拉针插入干净的培养皿中的建模者粘土线中来储存。
- 使用微型装载机尖端将注射混合物装入针头（参见 材料表）。
注意：用于蜱虫和蚊子胚胎注射的针头比较如图 2所示。
4. 显微注射的载玻片设置
- 使用双面胶带将两个玻璃显微镜载玻片粘合在一起，留出约0.5厘米的间隙以支撑对齐卵子并防止它们在注射过程中滚动（图3A）。
- 在载玻片之间间隙的双面胶带上涂上一块透明薄膜敷料（见 材料表）。确保薄膜敷料与间隙完美对齐。
5. 胚胎显微注射
- 使用单毛画笔在幻灯片设置（上图）上一次对齐 8-10 个鸡蛋。
注意：与垂直于滑动边缘的较长轴对齐的鸡蛋（图3B）比纵轴平行于边缘对齐的鸡蛋更容易注射（图3C）。垂直方向的鸡蛋（图3B）可以更好地承受注射，从而提高存活率。 - 将带有对齐鸡蛋的载玻片放在复合显微镜的载物台上。使用一块不起毛的擦拭布去除储存它们的 1% NaCl 溶液。
- 将填充的注射针连接到连接到显微操纵器的显微注射器上（参见 材料表）。
- 使用微量注射器上的高压设置（>5，000 hPa）将针头轻轻摩擦在鸡蛋表面上，从而打开针头。
- 打开针头后，根据针头的开口降低微量注射器的压力（1，000-2，500 hPa）。
注意：较小的开口需要相对较高的压力，而较大的开口将需要较低的压力。这是为了控制注入的构建体的体积。根据针头开口的大小，注射量将在1-5 pL之间变化。 - 尽快以10°-15°角注射载玻片上的所有鸡蛋，并立即将载玻片移至衬有湿纸的培养皿中的高湿度条件。一旦注射卵子，它们就开始干燥。
注意：一次注射少量卵子会增加注射成功率和存活概率。针头确实会被胚胎反流堵塞。如果针尖仍然锋利，为了清除堵塞的针头，请将针头移动到添加到载玻片边缘的 1% NaCl 小液滴中。毛细管作用将去除小堵塞物。如果针已经变钝，请更换它。
6. 胚胎注射后护理
- 将装有注射胚胎的载玻片放入衬有湿滤纸的大培养皿中。
注意：关键是不要打扰鸡蛋至少5-6小时。这使得注射伤口能够正确密封。激动时注射伤口可能会打开，细胞质可能会开始渗出，导致卵子死亡。 - 5-6小时后，将一小滴去离子水加入透明薄膜敷料中，并附有注射的胚胎。用画笔轻轻地置换鸡蛋。将鸡蛋转移到一个小培养皿（10厘米）中，然后将它们浸入去离子水中。
注意：薄膜敷料允许注射后轻松取出卵子。当水滴被添加到薄膜敷料中时，鸡蛋将开始随着水一起移动。 - 将鸡蛋浸没在水中，并将培养皿放入培养箱中的6夸脱塑料盒中，温度为27°C，RH为>90%。
- 定期检查卵，头几天每天检查一次，然后每3-4天检查一次，直到幼虫开始孵化。
注意：如果在显微注射过程中损坏了大量卵子，一周后轻轻排出去离子水将防止死鸡蛋上的真菌生长。 - 当幼虫开始从注射的胚胎中孵化时（注射后21-25天，目前的实验室设置），每天检查它们，并将任何孵化的幼虫转移到顶部有屏幕的玻璃小瓶中。幼虫可以在水下孵化并存活~1-2周。
- 如果卵注射了可能导致可见表型的结构，则筛查幼虫4 。
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Representative Results
本文描述了肩胛骨I.的成功胚胎注射方案。产卵的雌性保持在高湿度下，以避免部分打蜡的卵干燥。通过消融妊娠雌性的基因器官（蜡腺）来去除蜡层以注射蜱胚胎（图1A-E）。我们使用颈部较短的铝硅酸盐玻璃针（图2）。这种形状非常适合蜱卵注射，因为它比用于昆虫卵注射的长颈（锥形）针头可以更好地承受压力。滴虫卵的球形需要在后台使用滑动平台（图3A），以避免在针插入过程中将蜱卵从载玻片上滚下来。肩突I.的早期胚胎发育是未知的，因此生殖细胞形成的时间和位置也是未知的。因此，我们选择在发育早期（12-18小时大）注射卵子，发现将卵子的较长轴垂直于载玻片边缘可以提高存活率（图3B，C）。使用这个方案，注射了数千个鸡蛋。在这些注射的卵中，高达8.5%存活，幼虫孵化（表1）。经过治疗但未注射的卵子存活率要高得多（高达70%），这表明改善注射（通过时间，注射部位或针头）可能会提高卵子存活率。该方案是为在胚胎发生早期（12-18小时）注射卵子而开发的;然而，这可用于长达 10 天的鸡蛋，用 NaCl 和苯扎氯铵处理时间更长。
图1： 肩胛骨I. Gené器官的操作 。 （A）基因器官示意图。上图：吉恩的器官在胫骨下。底部：外翻的腺体和口器向下折叠。（B）用粘土固定的显微镜下的饱满雌性。（C）雌性在产卵过程中在腹面移动她的口器以延长吉恩的器官。黄色箭头显示白色斑块，可用作Gene器官位置的参考。这些区域在产卵2-3周的雌性中可见。（D，E）Gene的器官（ D 中的小气泡， E中的延伸）在颅骨和头盖之间可见。Gené器官的角随着口器向下弯曲而延伸（E）。蓝色箭头显示插入钨针以去除腺体的位置。 请点击此处查看此图的大图。
图2：玻璃注射针的形状比较。 中间的用于蜱虫胚胎。 请点击此处查看此图的大图。
图3：注射的卵子对齐 。 （A）用于胚胎注射的载玻片设置。连接显微镜载玻片，使用双面胶带留下间隙，并将透明薄膜敷料放置在胶带上。鸡蛋在载玻片的边缘对齐。（B）鸡蛋与垂直于载玻片边缘的长轴的最佳对齐。（C）鸡蛋与平行于载玻片设置边缘的长轴对齐效果较差。 请点击此处查看此图的大图。
| 注入构建体 | 产卵后的时间 | 注射的卵子数量 | 孵化的幼虫数量 | 存活率 |
| sgRNA + Cas9 | ≤12小时 | 2,396 | 147 | 6.14 |
| 基因 1 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12小时 | 3, 135 | 269 | 8.58 |
| 基因 2 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12小时 | 2, 460 | 139 | 5.65 |
| 基因 3 | ||||
| 沃尔巴克氏体 | ≥ 24小时（24-36小时） | 1, 765 | 72 | 4.08 |
| sgRNA + Cas9 | 48-60 小时 | 191 | 5 | 2.62 |
| 基因 2 |
表1： 肩胛硬蜱中成功的卵注射和幼虫孵化。
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Discussion
这是第一个成功注射早期蜱虫胚胎的方案。已经实现了~4%-8%的存活率，这与其他成熟的昆虫模型中的胚胎注射相当5。
由于这是最初的协议，预计该协议将进一步完善并专门针对单个蜱物种。特别是，注射时间因物种而异，取决于胚胎发生，尤其是细胞化的时间。初步数据表明， 肩胛骨I. 卵在产卵后的前24小时内不会经历快速核分裂，几天后发生细胞化（未发表的数据）。我们已经将该协议用于质粒递送4，CRISPR介导的基因敲除4和细菌递送（沃尔巴克氏体）（表1）。预计这种胚胎注射方案将提供产生转基因蜱虫的机会，并使基因敲除和敲入研究在任何实验室中都是可行的。这将证明对加速探索蜱生物学和蜱-病原体-宿主界面的研究很有价值。
协议中的关键步骤
在产卵后24小时内收集卵子很重要，因为该方案已针对早期胚胎进行了标准化。如果在此时间之后收集卵子，则需要更长时间的苯扎氯铵和NaCl处理，并且老年鸡蛋的存活率较低（表1）。绒毛膜随着时间的推移而变硬，使得难以对超过24小时的卵子进行显微注射的受控干燥。人们注意到，一次注射较少的卵子有助于存活，因为当从 1% NaCl 溶液中取出时，处理过的鸡蛋往往会迅速干燥。如果卵子干燥过多，它们会死亡，但如果干燥不当，它们会在显微注射过程中破裂。因此，对于不同的蜱虫种类或菌株，优化适当的干燥时间是必要的。此外，在高湿度条件下进行显微注射后保持鸡蛋不受干扰至关重要。
局限和未来方向
一旦胚胎脱蜡，它们往往会迅速干燥，因此必须快速进行将它们对齐在载玻片上并注射的过程。速度和准确性的快速提高只能通过不断的练习和耐心来实现。我们未来的工作将集中在提高注射后胚胎的存活率，并确定生殖细胞形成的时间，以确保可遗传的突变。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢Channa Aluvihare和Yonus Gebermicale，ITF，UMD在协议开发的初始阶段提供的见解和支持。钨针是David O'Brochta，ITF，UMD的慷慨礼物。我们感谢Ladislav Simo博士在 I. ricinus 中测试了该协议，并进行了有见地的讨论。该项目由NIH-NIAID R21AI128393和纽约普利茅斯山基金会资助至MG-N，内华达大学向AN提供启动资金，国家科学基金会对MG-N和AN的资助编号2019609，以及IGTRCN向AS提供的点对点资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
