Summary
Den nåværende protokollen beskriver de kontrollerte mikrobladskrapene på overflaten av leddbrusk etter å ha destabilisert musekneet ved å kutte det mediale miniscotibial ligamentet. Denne dyremodellen presenterer en akselerert form for slitasjegikt (OA) egnet for å studere osteofyttdannelse, osteosklerose og tidlig stadium smerte.
Abstract
Artrose er den mest utbredte muskel- og skjelettsykdommen hos personer over 45 år, noe som fører til en økende økonomisk og samfunnsmessig kostnad. Dyremodeller brukes til å etterligne mange aspekter av sykdommen. Denne protokollen beskriver destabiliserings- og bruskskrapemodellen (DCS) av posttraumatisk artrose. Basert på den mye brukte destabiliseringen av den mediale menisken (DMM) -modellen, introduserer DCS tre riper på bruskoverflaten. Den nåværende artikkelen fremhever trinnene for å destabilisere kneet ved å transektere det mediale meniskotibiske ligamentet etterfulgt av tre forsettlige overfladiske riper på leddbrusk. De mulige analysemetodene ved dynamisk vektbærende, mikrocomputertomografi og histologi er også demonstrert. Selv om DCS-modellen ikke anbefales for studier som fokuserer på effekten av slitasjegikt på brusk, muliggjør den studier av slitasjegiktutvikling i et kortere tidsvindu, med spesielt fokus på (1) osteofyttdannelse, (2) osteoartrittisk og skadesmerter, og (3) effekten av bruskskader i hele leddet.
Introduction
Artrose (OA) er den mest utbredte muskel- og skjelettsykdommen hos personer over 45 år, med over 8,75 millioner som søker behandling i Storbritannia1. Den økende forekomsten av sykdommen har ført til økte økonomiske og samfunnsmessige kostnader, er en stor bidragsyter til funksjonshemming og reduserer livskvaliteten for pasienter1. Uten behandlinger tilgjengelig, er det et presserende behov for å akselerere forskning for å forstå utviklingen og utviklingen av sykdommen. Sykdommen er kompleks og også multifaktoriell i sin natur. De viktigste kliniske målingene av sykdommen er smerte og leddmobilitet2, og OA påvirker alle vevene i leddet, ikke bare brusk3. En av hovedutfordringene med å forstå OA er at det kan ta år, noen ganger tiår, fra første presentasjon / skade til symptomatisk sykdomsprogresjon med smerte og immobilitet.
Modellering av slitasjegikt hos gnagere har forbedret vår kunnskap om OA-patofysiologi ved å tillate oss å forstå initiering og progresjon i en mye kortere tidsramme og med en detaljert undersøkelse av vevene som er involvert. Det finnes mange murine modeller av slitasjegikt, fra genmodifiserte dyr til kirurgiske inngrep modeller. Den mest brukte murine modellen av posttraumatisk OA er destabilisering av medial menisk (DMM) 4,5. En advarsel av modellen er variabiliteten mellom ulike operatører. Erfarne kirurger kan utføre prosedyren med minimal leddskade, mens uerfarne operatører utsetter leddkapselen i lengre perioder og forårsaker skade på brusk. Denne variasjonen i prosessen påvirker alvorlighetsgraden av modellen, med flere innledende skader som fører til økt bruskskadescore og osteofyttdannelse. For å redusere variabiliteten mellom operatører og etterligne bruskskader fra klinisk inngrep, utvikles en modifisert versjon av denne modellen, hvorved kontrollert tilleggsskade på bruskoverflaten i form av tre overfladiske riper påføres6. Dette gjør det også mulig å modellere OA-progresjonen som følge av bruskskader forårsaket av noen kliniske inngrep. Sammenlignet med standard DMM-modellen, resulterer den direkte induserte bruskskaden i konsekvent akselerert utstående osteofyttdannelse, økt bruskskade og betennelse og målbar surrogatsmerte hos hannmus.
Denne modellen er spesielt egnet for studier av tidlig stadium posttraumatisk OA, med fokus på osteofyttdannelse, smertepresentasjon (hos hannmus), synovitt og tidlige endringer i beinparametere. Konsistensen av osteofyttdannelse i denne modellen gjør det relevant å studere beinreparasjon og endokondral ossifikasjon siden osteofyttdannelse er en reparasjonsprosess via endokondral ossifikasjon7. Modellen etterligner også skader introdusert direkte til brusk under kliniske inngrep, for eksempel artroskopiske kirurgiske prosedyrer, og dermed er den også egnet for studier av effekten av bruskskader på hele leddet.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Ethical Review Panel ved University of Glasgow og University of the West of Scotland, og utført i henhold til Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (UK) retningslinjer. 10 uker gamle C57Bl6/J hannmus, som veide rundt 25 g, ble brukt i denne studien. Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell).
1. Forberedelse av dyr
MERK: Vurder musekjønn i forhold til formålet med studien, da posttraumatiske OA-modeller viser viktige forskjeller avhengig av kjønn 8,9,10.
- Sørg for at bedøvelsesreagenset (2% isofluran) er klart.
MERK: Injiserbar anestesi kan også brukes11. Gitt den raske varigheten av operasjonen, anbefales bruk av inhalasjonsbedøvelse. - Bruk en egen humbug-operert alderstilpasset gruppe som kirurgisk kontroll.
MERK: Det kontralaterale kneet må ikke brukes som en kirurgisk kontroll (humbugoperasjon på det kontralaterale benet). Dette kan ha problemer når det gjelder dyrevelferd, og det vil sannsynligvis påvirke gang- og gangmålinger. Det kontralaterale kneet normaliserer indre beinparametere12 og fungerer som en parvis sammenligning på fremkalte smertetester13. - Bruk skjelettmodne mus.
MERK: Det meste av litteraturen induserer OA ved 8-12 ukers alder. I denne studien er musene 10 uker gamle.
2. Preoperativ omsorg (utført av en kirurgisk assistent)
- Hvis de transporteres fra et annet anlegg, la mus tilpasse seg sitt nye miljø minst 1 uke før kirurgisk inngrep.
- Utfør kirurgi i et passende utpekt sterilt rom, og sørg for at alle overflater er sterile (f.eks. Bruk sterile gardiner for å dekke operasjonsområder).
MERK: Operasjonen er aseptisk. - Ordne og plasser sterile instrumenter på sterile gardiner.
- Vei musen.
- Induser anestesi ved å introdusere musen i et bedøvelsesbur og deretter introdusere 2% isofluoran i opptil 15 minutter ved hjelp av en standard bedøvelsesrigg (se Materialtabell).
MERK: Buret må ikke ha "rest" anestesi før musen innføres. - Når den er bedøvet, ta musen ut av bedøvelseskammeret og klipp pelsen over kneet, forsiden og laterale sider fra midten av skinnen til midten av låret med små hårklippere.
MERK: Valget av bakbens kne er opp til operatørens preferanse på hvilken side de finner lettere å gjennomføre operasjonen. Denne protokollen opererte på venstre ben. - Forsikre deg om at musen er fullstendig bedøvet (reagerer ikke på å klemme foten).
- Desinfiser huden ved å påføre antibakteriell hudrens (f.eks. klorhexidin eller iodofor, se Materialtabell) på barbert eksponert hud.
- For analgesi, administrer 0,05 mg / kg buprenorfin subkutant.
- Plasser musen på dorsalsiden, la kneet betjenes oppover, og plasser musenesen i dysen som er koblet til bedøvelsesriggen.
- Dekk musen med en steril drapering med en liten nøkkelhullsåpning.
- Plasser benet som skal opereres med kneet bøyd på mindre enn 90 °, med patellarbåndet vendt oppover og foten immobilisert med kirurgisk tape.
3. Destabilisering av den mediale meniskprosedyren etterfulgt av bruskskrape
- Juster mikroskopet for å fokusere på patellarligamentet.
- Klyp huden på kneet på sidesiden med taggete tang (se Materialfortegnelse), lag et lite kutt parallelt med den distale patellar-senen ved hjelp av kirurgisk saks, introduser saksen og utvid kuttet til ca. 1 cm. Flytt huden over til medialsiden, og utsett patellarbåndet og det proksimale tibialplatået (figur 1).
- Med et nummer 11-blad, gjør du et snitt langs medialsiden av patellarligamentet, fra toppen til bunnen av ligamentet (figur 1A). Når du når bunnen av patellarbåndet, vri bladet 90 ° og forleng snittet bort fra patellarligamentet mot medialsiden for å få tilgang til leddkapselen.
MERK: Blødning kan oppstå i dette eller de påfølgende trinnene. Hvis blødning oppstår, bruk en steril bomullspinne og trykk noen sekunder (5 til 30 s). - Klem patellar ligamentet med stump spiss tang og roter håndleddet for å flytte patellar ligamentet til lateral side, akkurat nok til å eksponere infrapatellar fett pad (IFP).
MERK: For å minimere skade på patellarbåndet, må du ikke holde pinsetten for stramt, akkurat tilstrekkelig til å holde ligamentet til siden. - Mens du fortsatt holder patellarbåndet lett, klemmer IFP med mikropinsett (se materialtabell) for å heve det og flytte det litt oppover. Dette gjør det mulig å visualisere det mediale meniskligamentet.
- Identifiser det mediale meniskotibiske ligamentet (MMTL) i den mediale menisken, som forankrer kranialhornet til den mediale menisken til det fremre tibialplatået (figur 1B).
- Unngå skade og langvarig bruskeksponering på tibialplatået eller lårkondylen.
- Skill MMTL forsiktig med liten 2 mm blad Vannas fjærsaks, og la den mediale menisken og andre leddbånd være intakte. På dette tidspunktet er det kirurgiske inngrepet for DMM-modellen fullført (figur 1C).
- Med en 3 mm mikrokirurgisk kniv, merk tre jevnt fordelte innrykk på tibial leddbrusk i en retning fra bakre til fremre del.
MERK: Skårene er ca. 1 mm lange og skader bare bruskoverflaten (figur 2D).- Ikke bruk overdreven kraft med bladet på brusk (dvs. sørg for at riper er overfladiske). Dette ekstra trinnet påfører bruskskader, noe som induserer DCS-modellen.
- Lukk huden med to eller tre små 7 mm metallklemmer med sårlukking eller absorberbare 6-0 subdermale kirurgiske suturer (se materialtabell).
MERK: Subdermale kirurgiske suturer er bedre da de unngår ytterligere inngrep, men de forlenger operasjonsvarigheten. Eksterne suturer øker risikoen for såråpning ved musens gnaging. - Identifiser det mediale meniskotibiske ligamentet i den mediale menisken for humbugoperasjon, men ikke kutt.
- For mus som bare mottar bruskskraper, gjør de tre overfladiske riper uten å kutte ligamentet.
MERK: Bytt hansker mellom hver mus og steriliser instrumenter via autoklav. Husk å sjekke at instrumentene er avkjølt før gjenbruk.
4. Postoperativ behandling
- Hvis blødning har oppstått (>50 uL), injiser 500 μL varm steril saltvann subkutant (på baksiden av musen).
MERK: Etter vår erfaring, selv om mus har mindre blødninger, er det aldri mer enn en liten dråpe, og dermed trenger ikke væsker å fylles på. - Etter operasjonen, plasser musen i et gjenopprettingsbur på et rent papirvev og tillat utvinning fra anestesi (5-10 min).
- Overfør de fullt bevisste musene til et rent bur med ferskt sengetøy etter operasjonen.
- I 72 timer etter kirurgisk inngrep, overvåke for tegn på smerte eller nød. Vær oppmerksom på:
- Endringer i kroppsvekt. Selv om kroppsvekten kan reduseres på den første og andre dagen, er dette vanligvis ikke mer enn 5% av den pre-kirurgiske kroppsvekten.
- Generell mangel på pleie eller overpleie rundt snittet.
- Tegn på generell helseforringelse, som bøyd holdning, ansiktsgrimaser og/eller unormal respirasjon.
- Sårinfeksjon som indikert ved hevelse, utslipp eller åpning av såret.
MERK: Infeksjon kan oppstå hvis operasjonssåret åpnes. Siden kirurgisk sårreparasjon (f.eks. utskifting av manglende metallklemmer eller omsuturering) er en regulert prosedyre, må du sørge for at relevant godkjenning innhentes før reparasjoner utføres.
- Fjern metallklemmer mellom 5-7 dager etter operasjonen.
- Vedlikehold mus vanligvis 2-52 uker postoperativt, avhengig av studiedesign.
- Evaluer smerte/gange når som helst i løpet av studien.
MERK: Denne studien bruker dynamisk vektbæring som beskrevet i trinn 5.1. - Avliving av dyret etter godkjent metode, i henhold til nasjonale lisensavtaler, lokale retningslinjer og forsøksgodkjenning.
MERK: I denne studien ble dyrene avlivet via ekssanguinasjon (hjertepunksjon) under terminal anestesi etterfulgt av cervikal dislokasjon14.
5. Evaluering av osteoartrittisk sykdom
- Mål dynamisk vektbæring som en surrogatmåling av smerte ved å følge trinnene nedenfor.
MERK: Siden mus er byttedyr, har de en tendens til å skjule smerteadferd. Dette gjør måling av smerte vanskelig. Det er mange måter å måle fremkalt smerte på, for eksempel Von Frey15 og ganganalyse16. Denne studien målte differensialbelastningen mellom det opererte osteoartrittbenet og det uopererte kontrollbenet på en trykkmatte mens musen var i bur (se tabell over materialer, figur 2A).- Vei musen. Ta og kalibrer trykkmatten i henhold til produsentens spesifikke instruksjoner (se Dynamisk vektbærende utstyr i Materialfortegnelse). Introduser musen i buret.
- Registrer bevegelse og potetrykk av musen i buret i 5 minutter. Analyser innhentede data for å validere 1 min, etter produsentens instruksjoner.
MERK: Produsentens automatiserte analyse av DWB-programvare (se dynamisk vektbærende utstyr i Materialfortegnelse) gir målinger på hver pote i forhold til den totale kroppsvekten, mengden av den validerte tiden som hver pote forble på matten, og en estimering av matteområdet okkupert av hver pote. Dette gjør det mulig å beregne differensialbelastningen mellom de to bakpotene, differensialbelastningen mellom for- og bakpote, en økning av frontpotebelastningen (hvis den samme musen er målt over en periode), tiden som brukes på å løfte OA-benet i forhold til det kontralaterale benet og poteoverflaten.
- Kvantifisere forkalket vev gjennom mikrocomputertomografi (μCT).
MERK: Selv om subchondral bone osteosklerose og osteofyttdannelse kan måles i histologiske seksjoner, gir μCT muligheten til å kvantifisere tredimensjonalt. Oppløsningen av bildeopptak i μCT ved 5 μm er tilstrekkelig, da dette tillater visualisering av mindre strukturer som osteofytter, selv om jo høyere oppløsning, jo bedre.- Fest kneleddene i 4% paraformaldehydoppløsning i 24 timer, og overfør deretter til 70% EtOH.
- Skann kneleddene i en μCT-skanner.
MERK: I denne studien ble prøvene skannet på en μCT-skanner (se materialtabell) med et 0,5 aluminiumfilter satt til 50 kV og 200 μA. Prøvene ble undersøkt med en voxelstørrelse på 4,5 μm; 2 μm, 0,2° rotasjonsvinkel for bildebehandling og 0,5° rotasjonsvinkel for kvantifisering. - Rekonstruer skanninger for å tillate 3D-visualisering. Skanningene som presenteres her ble rekonstruert ved hjelp av kompatibel programvare (se materialtabell).
- Analyser subchondral beinsklerose (figur 2B) ved å følge trinnene nedenfor.
- Velg et interessevolum (VOI) på 0,5 mm × 0,9 mm × 0,9 mm i midten av lasten på det mediale tibialplatået17.
- Normaliser mot musens indre beinfenotype ved å analysere det uopererte benet.
- Bestem subchondral bentetthet og mikroarkitektur ved å velge en region av interesse (ROI) som avgrenser trabekulær struktur i tibial epifysen, den subkondrale platen eller det totale subkondrale beinet i den todimensjonale koronale visningen av stabelen ved hjelp av CTan-programvare (se Materialtabell).
MERK: Etter hvert som sykdommen utvikler seg, blir separasjonen mellom subchondralplaten og subchondral trabekulær region vanskeligere å skille mellom. Det anbefales deretter å analysere området av subchondral bein valgt fra fellesrommet til vekstplaten.
- Kvantifiser osteofytter (figur 2C) ved å følge trinnene nedenfor.
- Identifiser osteofytter i de rekonstruerte tredimensjonale bildestablene ved hjelp av CTvol-programvare (se materialtabell).
MERK: Mineraliserte osteofytter er fremspring som ligner på vevd bein synlig på medialsiden av subchondralbenet18. Et eksempel på disse er angitt med gule piler i figur 2C. - Tell manuelt antall identifiserte osteofytter i medialsiden av kneleddet.
- Mål osteofyttvolumet i 2D sekvensiell bildeanalyse (ved hjelp av CT-analysatoren) ved å avgrense kanten av osteofytter manuelt, utstikkende fra den subkondrale platen som interesseområde (ROI) for analyse.
- Beregn osteofyttbentetthet som forholdet mellom benvolum over osteofyttvolum ved hjelp av CT-analysatorprogramvaren (se Materialtabell).
- Identifiser osteofytter i de rekonstruerte tredimensjonale bildestablene ved hjelp av CTvol-programvare (se materialtabell).
- Evaluer bruskskader og synovitt (figur 2D) i henhold til OARSI bruskskadescore19 og synovittscore20 på parafininnstøpte 6 μm-seksjoner.
- Etter skanning avkalkes kneleddene i 10 % EDTA ved 4 °C i minst 2 uker, og skifter oppløsning to ganger i uken.
- Bygg inn prøver i parafin. For behandlinger og inkubasjonsperioder, se Tilleggsfil 1.
- Klipp 5 μm koronale seksjoner av parafininnstøpte prøver på en roterende mikrotom (se Materialtabell).
- Velg seksjoner i området der tibial- og lårkondylene møtes (figur 2D). Velg to seksjoner i tre like distanserte områder av skjøten.
MERK: Seksjoner skåret i denne studien ble valgt i områder 80-100 μm fra hverandre. - Flekkseksjoner med Safranin-O og Rask grønn (se Materialfortegnelse) ved å følge trinnene nedenfor.
- Deparaffiniser seksjoner ved å senke dem (i nevnte sekvens) i Xylen i 5 minutter (2x), 100% etanol i 2 min, 95% etanol i 2 min, 80% etanol i 2 minutter og 70% etanol i 2 min.
- Flekk med filtrert hematoksylin (se materialtabell) i 30 s. Skyll deretter i vann fra springen i 5 minutter (tre ganger).
- Vask med Scotts buffer (2 g natriumbikarbonat og 10 g magnesiumsulfat i 1 liter destillert vann) i 2 minutter. Skyll i "vann fra springen" i 5 minutter (tre ganger).
- Stain i 4 min med 0,2% Rask grønn. Dypp i 1% iseddik, fem ganger (nylaget hver økt). Skyll raskt i vann fra springen.
- Stain i 5 min med 0,5% Safranin-O. Skyll i 95% etanol. Dehydrer seksjoner i 100% etanol i 3 minutter etterfulgt av 3 minutter i Xylene.
- Skåringsavsnitt som angitt i Glasson m.fl. for brusk19 og Jackson m.fl. for synovitt20.
MERK: Andre metoder for kvantifisering eksisterer, for eksempel den datamaskinbaserte kvantifiseringen av Pinamont et al.21. - Valider poengsystemet med to forskjellige målscorere, blindet for eksperimentet.
Representative Results
Prosentvis belastning per totalkroppsvekt på det bakbetjente/OA-benet ble sammenlignet med kontralateralt/kontrollbenet. Selv om andre parametere også kan gi betydelige forskjeller, som økningen i frontpotebelastning etter kirurgisk inngrep, indikerer en konsekvent endring i bakpotebelastning en preferanse for å bruke det ene benet over det andre og er en mer direkte indikator på betydelig ubehag for musen på grunn av OA-utvikling. Det var ingen signifikante endringer i bakbensbelastning i DMM-modellen innen 8 uker etter induksjon, mens DCS-mus favoriserer kontralateral/kontrollbenet signifikant 2 uker etter intervensjon (figur 3A).
Subchondral bein ble analysert ved å fokusere på volumet under det mediale belastede området av tibialkondylen. Her vurderte vi bentettheten i dette området ved å bestemme prosentandelen mineralisert bein innenfor interesseområdet og beregnet forholdet mellom det kontralaterale og det ipsilaterale benet. Forholdet indikerer at begge modellene har økt bentetthet i den affiserte ekstremiteten (ratio over 1) 4 uker etter induksjon (figur 3B). Fremveksten av osteofytter er mer fremtredende i DCS-modellen, hvor det er en signifikant økning i antall og volum sammenlignet med DMM-modellen 2 uker etter intervensjon (figur 3C, D). DCS presenterer forhøyet bruskskade i mediale tibial- og lårben og synovitt (figur 3E,F) 4 uker etter induksjon.
Figur 1: Kirurgisk inngrep for å indusere posttraumatisk OA i mus. Sekvensielle bilder representerer de ulike stadiene av prosedyren. (A) Eksponering av leddkapsel som kutter overfladisk membran rundt kneet ved å sette inn et skalpellblad nummer 11 på medialsiden av patellarbåndet og bort fra ligamentet. Dette vil utsette den infrapatellære fettputen. (B) Identifikasjon og transseksjon av det mediale meniskotibiske ligamentet. For å identifisere ligamentet, flytt patellarbåndet mot sidesiden og skyv deretter fettputen oppover. Dette muliggjør visualisering av ligamentet som en liten horisontal hvit linje like over tibialkondylen (angitt her med en svart pil). For å kutte ligamentet, er det nedre bladet på fjærsaksen plassert under ligamentet, og pass på at brusk ikke skader. Beveg menisken mot medialsiden for å visualisere tibialkondylen. (C) Skrape overflaten av den eksponerte brusk og lukking av såret. For å skrape brusk, settes mikrobladet inn mot den bakre siden, hvor den kommer i kontakt med brusk og beveger seg deretter fremover mot den fremre delen av leddet. Når ripene er ferdige, trekk huden over kneet og lukk såret enten ved subdermal suturering eller med sårklemmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Evaluering av artrose i mus . (A) Dynamisk vektbæring består i å matche belastningen på en trykkmatte med den tilsvarende poten. Lasten uttrykkes deretter som en prosentandel av totalvekten. (B) Subchondral bein måles ved å velge et volum av interesse i belastningsområdet til den mediale tibialkondylen og velge subchondralplaten eller trabekulært bein. Disse bildene har en oppløsning på 4,5 μm. (C) Osteofytter identifiseres og kvantifiseres i en tredimensjonal visning av de oppkjøpte μCT-bildene. Volumet av osteofytter måles ved å velge en ROI som avgrenser kanten av osteofyten. Bentettheten beregnes som benvolumet per osteofyttvolum. Bildene som presenteres her ble tatt med en oppløsning på 2 μm, men kvantifisering gjøres vanligvis med en oppløsning på 4,5 μm. (D) Brusk og synovitt score er hentet fra 6 μm seksjoner farget med Safranin-O og Fast green. En koronal del av musekneet der alle kvadranter, merket med en svart boks, er synlige for scoring og en forstørrelse av medialsiden vises. Synovitten rundt den mediale siden av kneleddet er også synlig, spesielt over og under den forskjøvne menisken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representativ evaluering av OA i DMM- og DCS-modellene. (A) DWB målt opptil 8 uker etter induksjon på eksperimenter utført av samme ekspertoperatør. Belastning uttrykkes som et forhold mellom den betjente/OA-belastningen kontralateral/kontrollbelastningen. Parvise t-tester av begge bena er også vist i modellene Sham (grå), DMM (blå) og DCS (rosa). μCT-analyse 4 uker etter kirurgisk inngrep. (B) Subchondral bein ble analysert 4 uker etter kirurgisk inngrep og uttrykt som forholdet mellom ipsilateral over kontralateral % BV / TV. (C) Osteofyttnummer og (D) osteofyttvolum ble analysert 2 uker etter induksjon. Histologisk undersøkelse 4 uker etter induksjon av (E) bruskskade av medial tibial og femoral leddbrusk og (F) synovitt ble skåret med standardiserte metoder19,20. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± standardavvik, n ≥ 5. Data ble sammenlignet med gjentatte tiltak ANOVA med Šídák testkorreksjon (A), parret t-test (A) eller standard Student t-test (B-F). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns = ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1: Behandlings- og inkubasjonsbetingelse for parafininnbygging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
For å utføre kirurgisk induksjon av posttraumatisk slitasjegikt (PTOA), anbefales støtte fra en assistent sterkt (for eksempel å forberede musene mens operatøren fokuserer på operasjonen). Dette muliggjør aseptisk kirurgi, og reduserer dermed risikoen for infeksjoner og gjør intervensjonen mer effektiv i store eksperimenter. Det er lett å miste fokusplanet under operasjonen, så et mikroskop som inkluderer pedaler for fokusering er en verdifull funksjon for å opprettholde sterilitet gjennom hele operasjonen. Plasseringen av musen og kneet er avgjørende. Kneet må være vendt oppover og tilstrekkelig bøyd for å maksimere åpningen av kneleddet, noe som letter lettere tilgang til ligamentet for å introdusere mikrobladet for å skrape kondyloverflaten. Å identifisere MMTL kan være utfordrende, spesielt når fettputen er større enn vanlig eller det er en liten blødning. For å unngå blødninger, skyv fettputen oppover for å forhindre rifter og påfølgende blødning. Hvis fettputen er stor, kan dette ta litt lengre tid, men fortsett tålmodig å skyve den oppover.
MMTL er ganske nær tibialkondylen, så man må passe på å ikke skade brusk når man plasserer det nedre bladet på den buede fjærsaksen under MMTL. De buede bladene skal peke mot medialsiden og litt oppover, parallelt med kondylen. For best seksjonering av MMTL, sørg for at saksen er skarp. Kontroller at menisken kan bevege seg medialt etter kutting av leddbåndet, da det noen ganger gjenstår et lite vedlegg som trenger ytterligere kutting. Når du introduserer mikrobladet for å skrape kondylen, må det være vinkelrett på kondylen. Lag den første ripen nærmere midten av leddet, men pass på at du ikke skader det fremre korsbåndet. Beveg deg deretter mot medialsiden og deretter bak menisken. Ripene kan være synlige som svake hvite linjer på brusk. Fordi vi vanligvis bruker klips, utføres det første snittet på sidesiden, slik at klipsene er plassert på siden av beinet etter å ha lukket såret. Dette unngår at klipsene gnir kneet når musen gjenvinner bevegelsen. Ved bruk av suturer anbefales bruk av subdermale masker sterkt. Hvis du bruker eksterne masker, vil musene sannsynligvis gnave på stingene og åpne såret, noe som vil øke sjansene for infeksjon. Når det er gjort riktig, må denne operasjonen ikke ta mer enn 5-10 minutter, fra snitt til sårlukking, og dermed minimere eksponeringen av brusk og eventuelle ytterligere ukontrollerte skader som kan oppstå. Etter operasjonen gjenoppretter musene veldig raskt og kan nesten umiddelbart klatre inn i buret og bevege seg normalt. Hvis musene ikke er aktive, bør den aktuelle eksperten i enheten konsulteres.
For atferdsmessig evaluering av smerte ble dynamisk vektbæring vurdert. Imidlertid kan denne metoden betraktes som mindre følsom enn andre fremkalte smertetester, for eksempel von Frey-testing15. Det anbefales at mer enn én metode brukes til å overvåke og vurdere smerte. Endringene observert 2 uker etter intervensjon i DCS, selv om de er forbigående, indikerer en generelt redusert belastning av OA-benet sammenlignet med det friske benet. Derfor kan 2 uker etter DCS-intervensjon brukes til å evaluere tidlig osteoartrittisk eller skadesmerter i musemodeller. Visualisering av mineraliserte osteofytter ved μCT muliggjør tredimensjonal kvantifisering, som også kan tilpasses de histologiske seksjonene12, og legger til en annen dimensjon til studiet av osteofyttoppkomst og evolusjon. I vår gruppe var osteofytttilstedeværelse variabel i DMM-modellen mellom og innenfor operatorer (2,3 ± 1 vs. 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), mens induksjon av DCS robust førte til osteofyttgenerering i alle tilfeller uavhengig av operatør (2,6 ± 0,7 vs. 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). Det er også betydelig flere og større osteofytter i DCS-modellen sammenlignet med DMM. Dermed er DCS en ideell modell for studiet av osteofyttdannelse. Kvantifisering av osteosklerose begrenset til belastningsområdet til subchondralbenet er også en forbedring i å oppdage små endringer. Sammenligning av det mediale rommet til det opererte benet med det kontralaterale benet gir også en måte å normalisere mot den inneboende beinfenotypen til den aktuelle musen12. Tilsetningen av bruskskraper i DCS-modellen er et kontrollert middel for å indusere fokusert bruskskade under operasjonen som akselererer mange av aspektene av sykdommen. En av konsekvensene av den eksperimentelle prosedyren som involverer forsettlig skade på brusk i seg selv, er at denne arteffaktiske skaden må utelukkes eller justeres for i bruskgraderingssystemet. På grunn av denne begrensningen anbefaler vi ikke denne modellen hvis studiens hovedmål er å forstå effekten av slitasjegikt på selve brusken. Til slutt anbefales det også sterkt å ha minst to blindede scorere som graderer bruskskaden og synovittpoengene. Dette validerer og forbedrer standardiseringen av poengsystemene.
En begrensning ved denne studien er at graden av variabilitet på tvers av alle parametrene som sammenligner DCS- og DMM-modellene ikke ble fullstendig evaluert. Dette vil bli adressert i fremtiden med mer omfattende studier, som også kan inkludere en vurdering av variabiliteten mellom operatører fra ulike institusjoner.
Avslutningsvis tillater den akselererte OA-patogenesen i den nåværende DCS-modellen representasjon av posttraumatisk OA og gir et kraftig og robust forskningsverktøy for å undersøke og belyse underliggende OA-patofysiologiske mekanismer som driver denne kroniske svekkende leddsykdommen. I tillegg gjør det at OA kan utforskes på kortere tid, med fokus på osteofytogenese, OA-smerte og effekten av bruskskader på hele leddet.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne anerkjenne arbeidet til Gemma Charlesworth og Mandie Prior ved University of Liverpool, som kjøpte μCT-bildene som ble brukt i denne publikasjonen. Arbeidet ble finansiert av Versus Arthritis (tilskudd 20199 og 22483). Lynette Dunning ble finansiert av Versus Arthritis (stipend 20199). Kendal McCulloch ble finansiert av et UWS PhD-stipend. Carmen Huesa ble finansiert av Versus Arthritis (tilskudd 20199 og 22483).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
| 15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
| 6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | - | alternative method to close wound |
| Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | - | |
| Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | - | To sterilise surgical skin area |
| Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
| Balance | Generic (many different suppliers) | - | To weigh mouse |
| Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | Analgesia |
| CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
| EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
| Ethanol | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
| Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
| Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
| Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
| Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | |
| Mice | Charles river | - | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
| Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
| Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
| Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
| Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
| Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | - | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
| Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
| Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
| Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | - | To ensure sterility of surgical area |
| Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | To cover mouse and expose leg |
| Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
| Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | - | maintain sterile environment for surgical tools |
| Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | cover the mouse and keep leg through key hole |
| Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
| Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | - | Adjustable focus. |
| Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
| Xylene | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
References
- Arthritis Research UK. The State of Musculoskeletal Health 2018. Arthritis Research UK. , (2018).
- Mahir, L., et al. Impact of knee osteoarthritis on the quality of life. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59, 159 (2016).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Sophocleous, A., Huesa, C. Osteoarthritis mouse model of destabilization of the medial meniscus. Methods in Molecular Biology. 1914, 281-293 (2019).
- McCulloch, K., et al. Accelerated post traumatic osteoarthritis in a dual injury murine model. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (12), 1800-1810 (2019).
- Fan, X., Wu, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. Macro, micro, and molecular changes of the osteochondral interface in osteoarthritis development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 659654 (2021).
- Hwang, H. S., Park, I. Y., Hong, J. I., Kim, J. R., Kim, H. A. Comparison of joint degeneration and pain in male and female mice in DMM model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (5), 728-738 (2021).
- Loga, I. S., et al. Does pain at an earlier stage of chondropathy protect female mice against structural progression after surgically induced osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 72 (12), 2083-2093 (2020).
- Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Huesa, C., et al. Proteinase-activated receptor 2 modulates OA-related pain, cartilage and bone pathology. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (11), 1989-1997 (2016).
- Tappe-Theodor, A., King, T., Morgan, M. M. Pros and cons of clinically relevant methods to assess pain in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 100, 335-343 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Lab animal research. blood withdrawal I. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2018).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Das Neves Borges, P., Forte, A. E., Vincent, T. L., Dini, D., Marenzana, M. Rapid, automated imaging of mouse articular cartilage by microCT for early detection of osteoarthritis and finite element modelling of joint mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (10), 1419-1428 (2014).
- vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. Osteophytes: relevance and biology. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (3), 237-244 (2007).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, SUPPL 3 17-23 (2010).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
- Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991 (2020).
