Summary
本协议描述了使用经食管心房起搏评估小鼠心房颤动易感性时实验参数的优化。
Abstract
心房颤动（AF）的遗传和获得性危险因素的小鼠模型已被证明在研究心房颤动的分子决定因素方面很有价值。程序性电刺激可以使用经食管心房起搏作为生存程序进行，从而能够在同一动物中进行连续测试。然而，存在许多起搏方案，这使得重现性复杂化。本协议旨在提供一种标准化策略来开发特定于模型的实验参数，以提高研究之间的可重复性。进行初步研究以优化所研究特定模型的实验方法，包括研究时的年龄、性别和起搏方案的参数（例如，起搏模式和 AF 易感性的定义）。重要的是，应注意避免高刺激能量，因为这会导致神经节丛刺激，伴有无意的副交感神经激活，表现为起搏期间夸张的房室传导阻滞，并且通常与人为心房颤动感应有关。必须将表现出这种并发症的动物排除在分析之外。
Introduction
心房颤动（AF）是多种获得性和遗传性危险因素的最终常见途径。对于研究AF底物病理生理机制的研究，小鼠模型是有利的，因为易于遗传操作，并且通常，它们再现了在人类中观察到的不同临床表型1，2，3的AF敏感性。然而，小鼠很少发生自发性AF4，需要使用激发性心房起搏研究。
可以使用心内5 或经食管6 起搏进行程序性电刺激 （PES） 以评估鼠心房电生理学和 AF 易感性。虽然经食管方法作为生存程序特别有利，但由于许多已发表的实验方案7，8和可能阻碍可重复性的变异源9，其使用变得复杂。此外，有限的报告方案比较使得选择合适的起搏方案具有挑战性。
目前的协议旨在利用系统策略开发模型特异性经食管PES方法来评估鼠AF敏感性，以提高可重复性。重要的是，进行初步试点研究以通过考虑年龄、性别和起搏模式变异性来优化起搏方案，起搏旨在最大限度地减少可能混淆结果的无意副交感神经刺激9.
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Protocol
该程序已获得范德比尔特机构动物护理和使用委员会的批准，并且与实验动物护理和使用指南一致。该方案是使用遗传9 和获得的10 （例如高血压）小鼠AF易感性模型开发的。操作员对所研究小鼠的表型视而不见。
1. 动物选择
- 对于遗传模型，如下所述每两周（即每隔一周）对小鼠进行心房起搏（参见步骤6），以确定AF易感性的最佳时期。
- 在 8 周龄时开始每两周一次的起搏。使用野生型同窝动物作为对照，以减少变异性。研究两性，因为一个人可能不会发展出 AF 表型9。
- 对于获得的模型，在小鼠达到身体成熟（~12周龄）后进行起搏10。如上所述，研究两性。
- 在这些初步研究中，执行突发起搏8 （使用固定起搏周期长度 [CL]）和递减起搏7 （起搏逐渐缩短 CL）以确定最佳起搏模式。将每个程序分开至少24小时。
注意：随着研究的小鼠数量不断增加，请查看累积的数据以确定在AF敏感小鼠中促进AF但不促进对照组的最佳年龄，性别和起搏模式。- 使用AF易感性的多种定义（例如，AF发作次数8，总AF持续时间9，AF发生率4和持续AF发生率（通常定义为10 s 11或15 s12，甚至长达5分钟13，14）分析数据，因为某些模型可能显示一种但不是所有定义的AF表型9。
注意：AF发作和AF易感性的定义在已发表的研究4，7之间有所不同。心房颤动发作8 通常定义为快速心房活动伴不规则心室反应，至少持续1秒（图 1）。除心房颤动外，心房起搏还可能诱发心房扑动，伴有规律或不规则的心室反应。
- 使用AF易感性的多种定义（例如，AF发作次数8，总AF持续时间9，AF发生率4和持续AF发生率（通常定义为10 s 11或15 s12，甚至长达5分钟13，14）分析数据，因为某些模型可能显示一种但不是所有定义的AF表型9。
- 使用优化的模型特定参数和AF敏感性的定义进行其他小鼠的后续研究。
2. 动物制备
- 使用3%异氟醚（参见 材料表）在1 L / min的100%氧气中麻醉小鼠。
注意：异氟醚是有害的。它可能会刺激皮肤或眼睛，并可能导致头晕、疲劳和头痛，以及其他中枢神经系统毒性。在通风良好的地方使用适当的清除方法（例如，活性炭罐）。 - 踏板反射丧失后，将鼠标仰卧放在加热垫上，加热垫旨在将体温保持在约37°C，后肢贴在垫表面上。
- 将润滑性眼膏涂抹在眼睛上以防止干燥。
- 将麻醉面罩牢固地放在小鼠的鼻子上。在1 L / min的100%氧气中使用1%异氟醚开始维持麻醉。确保鼻孔没有阻塞，因为小鼠是专性鼻子呼吸器。
- 通过皮下放置连接到生物放大器和数据采集硬件进入前肢的27 G ECG针电极（参见 材料表）获得表面心电图（ECG，导联I）。通过将针状电极放入左后肢来接地信号。
3. 导管放置
- 从鼠标上短暂取下异氟醚面膜。
- 将连接到刺激器和刺激隔离器的2-F八极电极导管（电极宽度和间距= 0.5 mm）（见 材料表）插入食道（图2）。
- 插入到接近从口腔（颈部伸展）到剑突软骨上方的距离的深度。
- 将异氟醚面罩重新定位在小鼠的鼻孔上。
- 使用分析软件连续记录心电图导联I开始数据采集（见 材料表）。
- 将激励隔离器模式调整为双极性。在刺激期间使用最远端的一对电极。
- 将导管正确放置在食道内以启用捕获。为此，在略短于窦 CL 的 CL 处施加脉冲宽度为 2 ms 的 1.5 mA 刺激（例如，如果窦性 CL 为 120 ms，则使用 100 ms 的 CL）。小心放置导管，直到获得一致的心房捕获。
4. 阈值确定
- 要确定心房舒张期捕获阈值 （TH），在用于心房捕获的 CL 处以 1.5 mA 的脉冲宽度开始起搏。以0.05 mA为增量降低刺激振幅，直到心房捕获丢失，随后增加直至捕获。
注意：获得一致心房捕获的最低振幅是心房TH。由于担心高刺激振幅下的副交感神经刺激，这反映在人工 AF 感应9 的起搏过程中过度的房室传导阻滞，最大可接受的 TH 为 0.75 mA。如有必要，重新定位导管以达到TH ≤0.75 mA。 - 将刺激幅度调整到两倍TH。
5. 电生理学性质的测定
- 测量电生理学参数，包括房颤诱导快速心房起搏前的窦房结恢复时间 （SNRT）、Wenckebach 周期长度 （WCL） 和房室有效不应期 （AVERP）15。
6.房性心律失常易感性
- 使用不同CL下的突发起搏或根据初始研究确定的减搏（步骤1.1.-1.4.）以两倍TH和2ms的脉冲宽度执行起搏。
- 对于突发起搏，以 50 毫秒的初始 CL 配速 15 秒，后续列车以 40 毫秒、30 毫秒、25 毫秒、20 毫秒和 15 毫秒的 CL 进行8，10。在每个起搏列车后暂停配速 30 秒，以便在继续之前恢复。如果在起搏列车后发生自动对焦，请在终止后等待 30 秒，然后再继续后续起搏。
- 对于降低起搏，以 40 毫秒的 CL 配速，每 2 秒将 CL 降低 2 毫秒，直到在 20 毫秒处终止7.以一式三份16 或五倍17 执行起搏列车，每列火车后暂停 30 秒以进行恢复。如上所述，如果发生AF，请在终止后等待30秒，然后再继续。
注意：在初步实验期间优化方案参数（即步骤1.1.-1.5.）时，使用五列火车执行递减起搏。进行事后分析，以确定三列或五列火车是否提供最大的灵敏度。 - 在最后一次起搏列车后 30 秒的窦性心律或 10 分钟的 AF 发作后终止手术，以先到者为准。
7. 术后
- 停止数据采集。
- 轻轻取出导管和心电图电极。
- 停止麻醉。
- 将麻醉的小鼠放入笼子中并观察10分钟以确保恢复。
- 保存数据文件。在串行测试的情况下，请等待至少24小时，然后再重复起搏程序。
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Representative Results
经食管心房起搏研究通过确定SNRT和AVERP以及AF易感性6 来评估SA和AV淋巴结的电生理学特性（图1）。心电图记录可以测量 P 波持续时间、PR 间期、QRS 持续时间和 QT/QTc 间期。在快速心房起搏期间连续记录心电图可以提供以下 AF 脆弱性测量值：研究期间诱导的发作次数、发作的累积和平均持续时间以及持续 AF 发作的次数。起搏期间过度房室传导阻滞的发作可以证明起搏诱导的副交感神经刺激（图 3），表明相关的 AF 是这种现象的伪影，而不是模型本身的病理生理学9。
图 1：心房起搏的代表性结果。 表面心电图记录描绘了快速心房起搏后 （A） 窦性心律和 （B） 心房颤动。起搏速率超过温克巴赫CL，导致起搏过程中AV淋巴结传导损失1：1。基线伪影与小鼠呼吸有关。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：经食管导管及其与神经丛的接近程度的视觉表示。 （A） 描绘 2-F 八极导管的照片。（B）描述导管靠近左后心房神经节丛。请点击此处查看此图的大图。
图 3：快速心房起搏期间房室传导阻滞过多的代表性结果。 表面心电图记录显示心房起搏节律伴 （A） 和无 （B） 过度房室传导阻滞，可能发生在心房起搏期间，尤其是在刺激强度较高且 CL 较短的起搏期间。 红色箭头表示 QRS 波群。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
经食管心房起搏不仅允许在同一动物中进行连续研究，而且其持续时间通常比心内检查短（~20 min），从而最大限度地减少麻醉剂的使用及其对电生理参数的影响。
针对每个单独的小鼠模型最初优化方法至关重要。衰老增加了正常小鼠的AF诱导性18，19，并且个体遗传模型可能在有限的时间内显示出AF诱导性。每隔一周进行一次试点研究可以确定AF表型小鼠可诱导但对照小鼠不诱导的年龄窗口。性别可能是一个决定因素，因为一种或两种性别都可以显示可诱导的 AF9。此外，特定小鼠可以仅响应一种类型的起搏模式表现出AF敏感性，而其他小鼠则表现出对不同模式或多种模式的AF敏感性9。
在快速心房起搏期间，小鼠可能会出现过度的房室传导阻滞，这通常与 AF 诱导同时发生。这种现象是由位于左后心房的神经节丛的无意刺激引起的，导致副交感神经激活9。显著房室传导阻滞定义为室性心动过缓，持续 ≥10% 的单次起搏列车，最常见于高刺激强度和短搏 CL 的起搏。这种类型的心律失常诱导增加了对照小鼠中AF的发生率，并在实验组中导致更大的心律失常变异性。鉴于这些污染特征，必须在分析中排除在这些条件下经历AF的动物。
如果在TH ≤0.75 mA的情况下起搏过程中发生严重的房室传导阻滞，则合理地将起搏幅度降低到1.5x TH7。此外，如果在初步实验期间未观察到 AF 表型，则可以重新尝试使用 10 ms 作为最低起搏 CL16。如果获得的模型在 12 周龄时未观察到 AF 表型，请考虑每两周进行一次初步研究，以探索表型成熟度增加的影响20.
这种方法的局限性是使用异氟烷麻醉。已知异氟醚抑制自主神经功能21，尽管暴露时间相对较短，但不能排除这种影响。该协议代表了在小鼠中开发经食管PES方法的优化策略的第一份详细报告。虽然这项研究的重点是心房颤动易感性，但该方案的未来应用可用于评估室性心律失常22，23。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
图 2 是使用 BioRender.com 创建的。这项工作得到了美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（HL096844和HL133127）的资助;美国心脏协会（2160035，18SFRN34230125和903918[MBM]）;以及美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心（UL1 TR000445）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G ECG electrodes | ADInstruments | MLA1204 | |
| 2-F octapolar electrode catheter | NuMED | CIBercath | |
| Activated carbon canister | VetEquip | 931401 | |
| Analysis software | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Biological amplifier | ADInstruments | FE231 | |
| Data acquisition hardware | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Eye ointment | MWI Veterinary | NC1886507 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | DPIP | |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Stimulator | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 |
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