Summary
Den nåværende protokollen beskriver optimalisering av eksperimentelle parametere ved bruk av transesophageal atrial pacing for å vurdere atrieflimmer følsomhet hos mus.
Abstract
Musemodeller av genetiske og ervervede risikofaktorer for atrieflimmer (AF) har vist seg verdifulle for å undersøke molekylære determinanter for AF. Programmert elektrisk stimulering kan utføres ved hjelp av transesophageal atrial pacing som en overlevelsesprosedyre, og muliggjør dermed seriell testing i samme dyr. Imidlertid finnes det mange pacing-protokoller, noe som kompliserer reproduserbarheten. Denne protokollen tar sikte på å gi en standardisert strategi for å utvikle modellspesifikke eksperimentelle parametere for å forbedre reproduserbarheten mellom studier. Foreløpige studier utføres for å optimalisere eksperimentelle metoder for den spesifikke modellen som undersøkes, inkludert alder på tidspunktet for studien, kjønn og parametere i pacing-protokollen (f.eks. Modus for pacing og definisjon av AF-følsomhet). Det er viktig at det tas hensyn til å unngå høye stimulusenergier, da dette kan forårsake stimulering av ganglionisk plexi med utilsiktet parasympatisk aktivering, manifestert av overdrevet atrioventrikulær (AV) blokk under pacing og ofte forbundet med kunstig AF-induksjon. Dyr som demonstrerer denne komplikasjonen må utelukkes fra analysen.
Introduction
Atrieflimmer (AF) representerer en endelig felles vei for flere ervervede og genetiske risikofaktorer. For studier som undersøker de patofysiologiske mekanismene til AF-substratet, er musemodeller fordelaktige gitt den enkle genetiske manipulasjonen og det faktum at de generelt reproduserer AF-følsomheten observert hos mennesker for forskjellige kliniske fenotyper 1,2,3. Imidlertid utvikler mus sjelden spontan AF4, noe som nødvendiggjør bruk av provoserende atrielle pacingstudier.
Programmert elektrisk stimulering (PES) kan utføres for å vurdere murine atriell elektrofysiologi og AF-følsomhet ved bruk av enten intrakardiell5 eller transesophageal6 pacing. Mens transesophageal tilnærming er spesielt fordelaktig som en overlevelsesprosedyre, er bruken komplisert av de mange publiserte eksperimentelle protokollene 7,8 og kilder til variabilitet som kan hindre reproduserbarhet9. Videre gjør begrensede rapporterte protokollsammenligninger det utfordrende å velge en passende pacing-protokoll.
Den nåværende protokollen tar sikte på å bruke en systematisk strategi for å utvikle modellspesifikke transesophageal PES-metoder for å vurdere murine AF-følsomhet for å øke reproduserbarheten. Det er viktig at innledende pilotstudier utføres for å optimalisere pacing-protokollen ved å ta hensyn til variasjon i alder, kjønn og pacing-modus, med pacing designet for å minimere utilsiktet parasympatisk stimulering som kan forvirre resultatene9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne prosedyren ble godkjent av Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee og er i samsvar med veiledningen for pleie og bruk av forsøksdyr. Protokollen ble utviklet ved hjelp av både genetisk9 ogervervet 10 (f.eks hypertensjon) musemodeller av AF-følsomhet. Operatøren ble blindet for fenotypen til musen som ble studert.
1. Valg av dyr
- For genetiske modeller, utsett mus for annenhver uke (dvs. annenhver uke) atriell pacing som beskrevet nedenfor (se trinn 6.) for å bestemme den optimale perioden for AF-følsomhet.
- Begynn annenhver uke pacing ved 8 ukers alder. Bruk vilttype kullkamerater som kontroller for å redusere variabiliteten. Studer begge kjønn, da man kanskje ikke utvikler en AF-fenotype9.
- For ervervede modeller, utfør pacing etter mus oppnå fysisk modenhet (~ 12 ukers alder) 10. Som nevnt ovenfor, studer begge kjønn.
- I løpet av disse foreløpige studiene, utfør både burst pacing8 (ved hjelp av en fast pacing cycle length [CL]) og decremental pacing7 (med en gradvis kortere pacing CL) for å bestemme den optimale pacing-modusen. Skill hver prosedyre med minimum 24 timer.
MERK: Etter hvert som et økende antall mus studeres, gjennomgå de akkumulerte dataene for å bestemme optimal alder, kjønn og pacing-modus som fremmer AF hos AF-følsomme mus, men ikke kontroller.- Analyser dataene ved hjelp av flere definisjoner av AF-følsomhet (f.eks. antall AF-episoder8, total AF-varighet 9, AF-forekomst4 og vedvarende AF-forekomst, vanligvis definert som 10 s 11 eller 15 s 12, og til og med opptil 5 min13,14), da noen modeller kan vise en AF-fenotype for en, men ikke alle definisjoner 9.
MERK: Definisjonen av en AF-episode og AF-følsomhet varierer mellom publiserte studier 4,7. AF-episoder8 defineres vanligvis som rask atrieaktivitet med uregelmessig uregelmessig ventrikkelrespons i minst 1 år (figur 1). I tillegg til AF, kan atriell pacing også indusere atrieflutter med enten en vanlig eller uregelmessig ventrikulær respons.
- Analyser dataene ved hjelp av flere definisjoner av AF-følsomhet (f.eks. antall AF-episoder8, total AF-varighet 9, AF-forekomst4 og vedvarende AF-forekomst, vanligvis definert som 10 s 11 eller 15 s 12, og til og med opptil 5 min13,14), da noen modeller kan vise en AF-fenotype for en, men ikke alle definisjoner 9.
- Bruk de optimaliserte modellspesifikke parametrene og definisjonen av AF-følsomhet for påfølgende studier på flere mus.
2. Forberedelse av dyr
- Bedøv musen i et induksjonskammer ved bruk av 3 % isofluran (se materialtabell) i 1 l/min 100 % oksygen.
MERK: Isofluran er skadelig. Det kan irritere huden eller øyet og kan forårsake svimmelhet, tretthet og hodepine, blant annet sentralnervesystemet toksisitet. Brukes i et godt ventilert område med en passende rensemetode (f.eks. aktivert karbonbeholder). - Etter tapet av pedalrefleksen, plasser musen i en liggende stilling på en varmepute designet for å opprettholde kroppstemperaturen på omtrent 37 ° C med bakbenene teipet til puteoverflaten.
- Påfør smørende øyesalve på øynene for å forhindre tørking.
- Plasser en bedøvelsesmaske sikkert over musens nese. Begynn vedlikehold av anestesi ved bruk av 1 % isofluran i 1 l/min 100 % oksygen. Sørg for at neseborene er fri for hindring, da mus er obligatoriske nesepustere.
- Få et overflateelektrokardiogram (EKG, bly I) ved subkutan plassering av 27 G EKG nåleelektroder (se Materialtabell) koblet til en biologisk forsterker og datainnsamlingsmaskinvare i forbenene. Jord signalet ved å plassere en nålelektrode i venstre bakre lem.
3. Kateterplassering
- Fjern isofluranmasken kort fra musen.
- Sett inn et 2-F oktapolart elektrodekateter (elektrodebredde og avstand = 0,5 mm) koblet til en stimulator og stimulusisolator (se materialtabell) i spiserøret (figur 2).
- Sett inn i en dybde som tilnærmer avstanden fra munnen (med nakken utvidet) til like over xiphoidbrusk.
- Plasser isofluranmasken over musens nesebor.
- Starte datainnsamlingen med kontinuerlig registrering av EKG-ledning I ved hjelp av analyseprogramvare (se materialfortegnelse).
- Juster stimulusisolatormodusen til bipolar. Bruk de distale elektrodene under stimulering.
- Plasser kateteret riktig i spiserøret for å muliggjøre fangst. For å gjøre det, bruk en 1,5 mA stimulus med en pulsbredde på 2 ms ved en CL litt kortere enn sinus CL (bruk for eksempel en CL på 100 ms hvis sinus CL er 120 ms). Plasser kateteret forsiktig til konsekvent atriefangst er oppnådd.
4. Fastsettelse av terskel
- For å bestemme den atrie diastoliske fangstterskelen (TH), start pacing ved 1,5 mA med en pulsbredde på 2 ms ved CL som brukes til atriefangst. Reduser stimulusamplituden med trinn på 0,05 mA til tap av atriefangst, med påfølgende økning til fangst.
MERK: Den laveste amplituden der konsistent atriefangst oppnås, er atriell TH. På grunn av bekymring for parasympatisk stimulering ved høye stimulusamplituder, noe som gjenspeiles av overdreven AV-blokk under pacing med kunstig AF-induksjon9, er maksimal akseptabel TH 0,75 mA. Om nødvendig, plasser kateteret for å oppnå en TH ≤0,75 mA. - Juster stimulusamplituden til to ganger TH.
5. Bestemmelse av elektrofysiologiske egenskaper
- Mål elektrofysiologiske parametere, inkludert sinusknutegjenopprettingstid (SNRT), Wenckebach sykluslengde (WCL) og atrioventrikulær effektiv ildfast periode (AVERP) før rask atriepasering for AF-induksjon15.
6. Atriearytmi følsomhet
- Utfør pacing ved to ganger TH med en pulsbredde på 2 ms ved hjelp av enten burst pacing ved forskjellige CLs eller decremental pacing som bestemt fra innledende studier (trinn 1.1.-1.4.).
- For burst pacing, tempo på en innledende CL på 50 ms for 15 s med påfølgende tog som forekommer på CLs på 40 ms, 30 ms, 25 ms, 20 ms og 15 ms 8,10. Pause pacing i 30 s etter hvert pacing tog for å tillate utvinning før du fortsetter. Hvis AF oppstår etter et tempotog, må du vente i 30 s etter avslutning før du fortsetter med påfølgende tempo.
- For redusert tempo, tempo på en CL på 40 ms og reduser CL med 2 ms hver 2 s til avslutning ved 20 ms7. Utfør pacing tog i tre eksemplarer16 eller quintuplicate17, med en 30 s pause for utvinning etter hvert tog. Som ovenfor, hvis AF utvikler seg, vent i 30 s etter avslutning før du fortsetter.
MERK: Når du optimaliserer protokollparametere under foreløpige eksperimenter (dvs. trinn 1.1.-1.5.), utfør redusert tempo med fem tog. Gjennomfør en post hoc-analyse for å avgjøre om tre eller fem tog gir størst følsomhet. - Avslutt prosedyren på 30 s sinusrytme etter siste pacing tog eller etter en 10 min episode av AF, avhengig av hva som kommer først.
7. Etter prosedyren
- Stopp datainnsamlingen.
- Fjern forsiktig kateter- og EKG-elektroder.
- Stopp anestesi.
- Plasser den bedøvede musen i et bur og observer i 10 minutter for å sikre gjenoppretting.
- Lagre datafilen. Ved seriell testing, vent i minst 24 timer før du gjentar pacing-prosedyren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transesophageal atrial pacing studier vurderer de elektrofysiologiske egenskapene til SA- og AV-nodene ved å bestemme SNRT og AVERP, samt AF-følsomhet6 (figur 1). EKG-registrering muliggjør målinger av P-bølgevarighet, PR-intervall, QRS-varighet og QT/QTc-intervaller. Kontinuerlig registrering av EKG under rask tempo kan gi følgende målinger av AF-sårbarhet: antall episoder indusert i løpet av studien, kumulativ og gjennomsnittlig varighet av episodene, og antall vedvarende atrieflimmer. Episoder med overdreven AV-blokk under pacing kan demonstrere perioder med pacing-indusert parasympatisk stimulering (figur 3), noe som betyr at den tilknyttede AF er en artefakt av dette fenomenet i stedet for patofysiologien til selve modellen9.
Figur 1: Representative resultater av atriell pacing. Overflate-EKG-registreringer som viser (A) sinusrytme og (B) atrieflimmer etter rask atriepacing. Tempofrekvensen overstiger Wenckebach CL, noe som resulterer i tap av 1: 1 AV nodal ledning under pacing. Grunnlinjeartefakten er relatert til musens respirasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Visuell representasjon av transesophageal kateter og dens nærhet til ganglionisk plexi . (A) Et fotografi som viser 2-F oktopolært kateter. (B) Avbildning av kateterets nærhet til den bakre venstre atrielle ganglioniske plexi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative resultater av overdreven AV-blokk under rask atriepacing. Overflate-EKG-opptak som demonstrerer atrierytme med (A) og uten (B) overdreven AV-blokk som kan oppstå under atriell pacing, spesielt under pacing med høyere stimulusintensitet og ved korte CLs. Røde piler betegner QRS-komplekser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transesophageal atrial pacing tillater ikke bare serielle studier i samme dyr, men varigheten er vanligvis kortere enn intrakardiale studier (~ 20 min), og minimerer dermed bedøvelsesbruk og dens effekter på elektrofysiologiske parametere.
Det er avgjørende å optimalisere metodene først for hver enkelt musemodell. Aldring øker AF-induserbarheten hos normale mus18,19, og individuelle genetiske modeller kan demonstrere AF-induserbarhet over en begrenset periode. Å utføre pilotstudier annenhver uke kan bestemme et aldersvindu der AF-fenotypemusen er induserbar, men kontrollmus er det ikke. Sex kan være en avgjørende faktor, da enten ett eller begge kjønn kan vise induserbar AF9. I tillegg kan spesifikke mus vise AF-følsomhet som svar på bare én type pacing-modus, mens andre demonstrerer AF-følsomhet for en annen modus eller for flere moduser9.
Under rask atriepacing kan mus oppleve overdreven AV-blokk som ofte er sammenfallende med AF-induksjon. Dette fenomenet er forårsaket av utilsiktet stimulering av ganglionisk plexi som ligger på bakre venstre atrium, noe som resulterer i parasympatisk aktivering9. Signifikant AV-blokk er definert som ventrikulær bradykardi som varer ≥ 10% av et enkelt tempotog og oppstår oftest ved pacing med høye stimulusintensiteter og ved korte pacing CLs. Denne typen arytmiinduksjon øker forekomsten av AF hos kontrollmus og forårsaker større arytmivariabilitet i en eksperimentell gruppe. På grunn av disse forurensende egenskapene må dyr som opplever atrieflimmer under disse forholdene utelukkes fra analysen.
Skulle dyp AV-blokk oppstå under pacing til tross for TH ≤0,75 mA, er det rimelig å redusere pacing amplitude til 1,5x TH7. Videre, hvis en AF-fenotype ikke observeres under foreløpige eksperimenter, kan det tenkes å prøve på nytt ved å bruke 10 ms som den laveste pacing CL16. Hvis en AF-fenotype ikke observeres ved 12 ukers alder for en ervervet modell, bør du vurdere foreløpige studier annenhver uke for å undersøke effekten av økende fenotypemodenhet20.
En begrensning av denne tilnærmingen er bruken av isofluranbedøvelse. Isofluran er kjent for å undertrykke autonom funksjon21, og denne effekten kan ikke utelukkes til tross for relativt kort eksponering. Denne protokollen representerer den første detaljerte rapporten om en optimalisert strategi for å utvikle transesophageal PES-metoder hos mus. Mens denne studien fokuserer på AF-følsomhet, kan fremtidige anvendelser av denne protokollen brukes til å vurdere ventrikulære arytmier22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Figur 2 ble opprettet med BioRender.com. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Heart, Lung, and Blood Institute ved National Institutes of Health (HL096844 og HL133127); American Heart Association (2160035, 18SFRN34230125 og 903918 [MBM]); og National Center for Advancing Translational Sciences ved National Institute of Health (UL1 TR000445).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G ECG electrodes | ADInstruments | MLA1204 | |
| 2-F octapolar electrode catheter | NuMED | CIBercath | |
| Activated carbon canister | VetEquip | 931401 | |
| Analysis software | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Biological amplifier | ADInstruments | FE231 | |
| Data acquisition hardware | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Eye ointment | MWI Veterinary | NC1886507 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | DPIP | |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Stimulator | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 |
References
- Sumitomo, N., et al. Association of atrial arrhythmia and sinus node dysfunction in patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation Journal. 71 (10), 1606-1609 (2007).
- Fukui, A., et al. Role of leptin signaling in the pathogenesis of angiotensin II-mediated atrial fibrosis and fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 6 (2), 402-409 (2013).
- Schutter, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Li, N., et al. Ryanodine receptor-mediated calcium leak drives progressive development of an atrial fibrillation substrate in a transgenic mouse model. Circulation. 129 (12), 1276-1285 (2014).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovascular Research. 50 (3), 463-473 (2001).
- Schrickel, J. W., et al. Induction of atrial fibrillation in mice by rapid transesophageal atrial pacing. Basic Research in Cardiology. 97 (6), 452-460 (2002).
- Verheule, S., et al. Increased vulnerability to atrial fibrillation in transgenic mice with selective atrial fibrosis caused by overexpression of TGF-beta1. Circulation Research. 94 (11), 1458-1465 (2004).
- Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 313-320 (2014).
- Murphy, M. B., et al. Optimizing transesophageal atrial pacing in mice to detect atrial fibrillation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 332 (1), 36-43 (2022).
- Prinsen, J. K., et al. Highly reactive isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. JACC: Basic to Translational Science. 5 (6), 602-615 (2020).
- Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFα. Nature Communications. 6, 6018 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic termination of atrial fibrillation in mice. Cardiovascular Research. 114 (5), 713-723 (2017).
- Matsushita, N., et al. IL-1β plays an important role in pressure overload-induced atrial fibrillation in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 42 (4), 543-546 (2019).
- Sato, S., et al. Cardiac overexpression of perilipin 2 induces atrial steatosis, connexin 43 remodeling, and atrial fibrillation in aged mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 317 (6), 1193-1204 (2019).
- Li, N., Wehrens, X. H. T. Programmed electrical stimulation in mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730 (2010).
- Yao, C., et al. Enhanced cardiomyocyte NLRP3 inflammasome signaling promotes atrial fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
- Purohit, A., et al. Oxidized Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II triggers atrial fibrillation. Circulation. 128 (16), 1748-1757 (2013).
- Jansen, H. J., et al. Atrial fibrillation in aging and frail mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 14 (9), 01077 (2021).
- Luo, T., et al. Characterization of atrial histopathological and electrophysiological changes in a mouse model of aging. International Journal of Molecular Medicine. 31 (1), 138-146 (2013).
- McCauley, M. D., et al. Ion channel and structural remodeling in obesity-mediated atrial fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 13 (8), 00896 (2020).
- Kato, M., et al. Spectral analysis of heart rate variability during isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 77 (4), 669-674 (1992).
- Schmeckpeper, J., et al. Abstract 11402: Targeting RyR2 to suppress ventricular arrhythmias and improve left ventricular function in chronic ischemic heart disease. Circulation. 144, Suppl_1 11402 (2021).
- Kim, K., et al. Abstract B-PO01-017: RyR2 hyperactivity promotes susceptibility to ventricular tachycardia in structural heart disease. Heart Rhythm. 18, Suppl_8 57 (2021).
