Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Calciumphosphat-induziertes Bauchaortenaneurysma (AAA) Mausmodell, um die pathologischen Merkmale und molekularen Mechanismen von AAAs zu untersuchen.
Abstract
Ein Bauchaortenaneurysma (AAA) ist eine lebensbedrohliche Herz-Kreislauf-Erkrankung, die weltweit auftritt und durch eine irreversible Erweiterung der Bauchaorta gekennzeichnet ist. Derzeit werden mehrere chemisch induzierte murine AAA-Modelle verwendet, die jeweils einen anderen Aspekt der Pathogenese von AAA simulieren. Das Calciumphosphat-induzierte AAA-Modell ist ein schnelles und kostengünstiges Modell im Vergleich zu den Angiotensin-II- und Elastase-induzierten AAA-Modellen. Die Anwendung von CaPO4-Kristallen auf die Aorta der Maus führt zu elastischem Faserabbau, Verlust glatter Muskelzellen, Entzündungen und Kalziumablagerungen im Zusammenhang mit Aortendilatation. In diesem Artikel wird ein Standardprotokoll für das CaPO 4-induzierte AAA-Modell vorgestellt. Das Protokoll umfasst die Materialvorbereitung, die chirurgische Anwendung des CaPO4 auf die Adventitia der infrarenalen Bauchaorta, die Entnahme von Aorten zur Visualisierung von Aortenaneurysmen und histologische Analysen an Mäusen.
Introduction
Ein Bauchaortenaneurysma (AAA) ist eine tödliche kardiovaskuläre Erkrankung, die durch eine dauerhafte Erweiterung der Bauchaorta gekennzeichnet ist, mit hohen Sterblichkeitsraten nach einer Ruptur. AAA ist mit Alterung, Rauchen, männlichem Geschlecht, Bluthochdruck und Hyperlipidämieassoziiert 1. Es wurde gezeigt, dass mehrere pathologische Prozesse zur AAA-Bildung beitragen, einschließlich extrazellulärer Matrixfaserproteolyse, Immunzellinfiltration und Verlust von vaskulären glatten Muskelzellen. Derzeit sind die pathologischen Mechanismen von AAA schwer fassbar, und es gibt keine bewährten Medikamente zur Behandlung von AAA1. Die Erforschung der menschlichen AAA ist aufgrund der Existenz weniger menschlicher Aortenproben begrenzt; Daher wurden mehrere chemische Modifikationsinduzierte tierische AAA-Modelle etabliert und weit verbreitet, einschließlich subkutaner Angiotensin II (AngII) -Infusion, perivaskulärer oder intraluminaler Elastase-Inkubation und perivaskulärer Calciumphosphatanwendung2. Ein häufig verwendetes Mausmodell ist die Anwendung von Calciumphosphat (CaPO4) auf die Adventitia der infrarenalen Bauchaorta, die kostengünstig ist und keine genetische Veränderung erfordert.
Die direkte periaortale Applikation von CaCl2 auf die Halsschlagader von Kaninchen zur Induktion einer aneurysmatischen Veränderung wurde ursprünglich von Gertz et al.3 berichtet und später auf die Bauchaorten von Mäusen angewendet. Das Modell wurde von Yamanouchi et al. entwickelt, um die Aortendilatation unter Verwendung von CaPO 4-Kristallen in Mäusenzu beschleunigen4. Die Infiltration von CaPO4 in die Aorten von Mäusen rekapituliert viele pathologische Merkmale, die bei menschlichen AAAs beobachtet wurden, einschließlich tiefgreifender Makrophageninfiltration, extrazellulärem Matrixabbau und Kalziumablagerung. Die Risikofaktoren für menschliche AAA, wie Hyperlipidämie, erhöhen auch CaPO 4-induzierte AAA bei Mäusen5. Im Gegensatz zu AngII-perfusionsinduzierter AAA bei ApoE-/- oder LDLR-/- Mäusen tritt CaPO 4-induzierte AAA in der infrarenalen Aortenregion auf, die menschliche AAA nachahmt. Derzeit wird diese Methode häufig angewendet, um die Anfälligkeit für die Entwicklung von AAA bei genetisch veränderten Mäusen zu bewerten und die Anti-AAA-Wirkungen von Medikamentenzu bewerten 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee des Beijing University Health Science Center durchgeführt und vom Biomedical Ethics Committee der Peking University genehmigt (LA2015142). Alle Mäuse für die Operation wurden mit Isofluran (1,5% -2%) betäubt, und die Anästhesie wurde sorgfältig überwacht, um Schmerzen oder Beschwerden für die Mäuse zu vermeiden.
1. Vorbereitung
- Schneiden Sie 0,3 cm breite Streifen aus puderfreien Gummihandschuhen und Gaze.
- Kaufen Sie 8-10 Wochen alte männliche C57BL / 6J-Mäuse. Unterbringung der Tiere in einer klimatisierten Umgebung mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Futter und Wasser.
- Autoklavieren Sie die Gaze, Wattestäbchen, Schere und Pinzette vor der Operation.
- Erhalten Sie Betadin, 70% Ethanol und antiseptische Handwäsche.
- Ziehen Sie eine Maske, ein Kleid und sterile Handschuhe an.
2. Chirurgischer Eingriff
- Füttern Sie kaubare Carprofen-Tabletten (5 mg/kg Dosis) 2-4 Stunden vor der Operation an eine 8-10 Wochen alte C57BL/6J-Maus. Dann legen Sie die Maus in eine Induktionskammer (206 mm x 210 mm x 140 mm) mit Isofluran bei einer Flussrate von 1,5% -2%.
- Überwachen Sie die Maus für ca. 5 Minuten, bis die Atmung sichtbar verlangsamt ist. Stellen Sie sicher, dass die Maus vor der Operation nicht auf Schmerzstimulation reagiert.
- Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf und unterstützen Sie die Wärme mit einem Heizkissen oder einer Decke. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einer Zehenklemme alle 15 Minuten während des chirurgischen Eingriffs.
- Rasieren Sie die Bauchhaare der Maus mit einem elektrischen Haarschneider oder einer Haarentfernungscreme. Tupfen und wischen Sie den rasierten Bereich mit Betadin, gefolgt von 70% Ethanol, mehrmals in kreisenden Bewegungen ab. Wechseln Sie die Handschuhe, um die Sterilität zu erhalten.
- Verwenden Sie eine Schere, um einen ~ 1,5 cm langen Schnitt am Unterbauch entlang der Mittellinie des Bauches zu machen.
- Verwenden Sie ein steriles, mit normaler Kochsalzlösung angefeuchtetes Wattestäbchen, um den Darm vorsichtig zu entfernen, bis die infrarenale Aorta sichtbar ist.
- Sezieren Sie das Bindegewebe und das Fett aus der infrarenalen Aorta für einen etwa 0,5 cm langen Abschnitt. Beachten Sie die kleinen Gefäße auf der Rückenseite und vermeiden Sie es, sie zu reißen. Es besteht keine Notwendigkeit, die Bauchaorta von der Bauchhauptvene zu trennen.
- Packen Sie ein Stück des mit Kochsalzlösung getränkten Gummihandschuhstreifens unter die Bauchaorta und die Bauchhauptvene. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um überschüssige Flüssigkeit abzuwischen.
- Packen Sie ein mit 0,5 M CaCl2 getränktes Stück Gaze auf die Adventitia des infrarenalen Bauchgefäßsystems für 10 min. Für die Scheinmausgruppe ersetzen Sie die 0,5 M CaCl2 durch normale Kochsalzlösung.
- Entfernen Sie die Gaze und packen Sie ein weiteres mit PBS-Lösung getränktes Stück Gaze für 5 min ein, um CaPO4-Kristalle in situ in der Adventitia der Aorta zu erzeugen.
- Entfernen Sie vorsichtig den Gummihandschuhstreifen und die Gaze. Setzen Sie den Darmtrakt der Maus zurück.
- Nähen Sie den Bauchschnitt und die Haut mit einer 5-0-Naht.
- Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, bis die Maus wieder zu Bewusstsein kommt. Bereitstellung von postoperativen Schmerzerholungsunterkünften und Analgesie, so die lokale Tierethikkommission.
- Beherbergen Sie die Maus für weitere 14 Tage. Überwachen Sie die Maus nach der Operation genau und beobachten Sie danach mindestens 1x täglich. Führen Sie sofort eine Nekropsie durch, wenn während dieser Zeit Mäuse sterben.
3. Harvesting für die Bildgebung von Aorten
- 14 Tage nach der Operation opfern Sie die Mäuse mit CO2.
- Schneiden Sie die Brust- und Bauchhöhlen der Maus ventral auf und schneiden Sie den rechten Vorhof auf.
- Perfusion der Mäuse mit PBS-Puffer durch den linken Ventrikel des Herzens, um Blut in der Aorta zu entfernen, und dann Perfusion mit 4% Paraformaldehyd, wie zuvor beschrieben8.
- Ernten Sie die Aorta unter dem Stereoskop.
- Die geernteten Aorten für 48 h in Röhrchen mit 5 ml 4% Paraformaldehyd geben.
- Entfernen Sie Adventivgewebe und Fett vorsichtig unter dem Stereoskop und stecken Sie die Aorta mit Insektennadeln auf eine schwarze Wachsplatte.
- Erfassen Sie Aortenbilder.
4. Bewertung des Abbaus der elastischen Fasern
- Schneiden Sie das Aortenaneurysmagewebe in serielle Kryosektionen (7 μm dick).
- Analysieren Sie die elastischen Fasern mit einem handelsüblichen elastischen van Gieson (EVG) Färbekit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Gradieren Sie den Elastinabbau. Grad 1: <25% Abbau; Grad 2: 25% bis 50% Abbau; Grad 3: 50% bis 75% Abbau; oder Grad 4: >75% Abbau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
14 Tage nach der Anwendung von CaPO4 wurden die männlichen C57BL/6J-Mäuse eingeschläfert und ihre Aorten geerntet und gereinigt. Die Morphologie der Aorten wurde abgebildet, um die AAA-Bildung zu visualisieren. Wie in Abbildung 1A-B gezeigt, führte die Anwendung von CaPO4 zu einer Erweiterung der infrarenalen Bauchaorta. Histologisch führte CaPO4 zu einem dramatischen Abbau elastischer Fasern, wie Elastinbrüche zeigen (Abbildung 1C).
Abbildung 1: Die 8 Wochen alten männlichen C57BL/6J-Mäuse wurden mit Kochsalzlösung (Schein) oder CaPO4 behandelt, die nach 14 Tagen geerntet wurden. (A) Repräsentative Bilder der infrarenalen Bauchaorta unter einem Stereoskop. (B) Repräsentative Morphologiebilder von Aorten von Mäusen; Maßstabsbalken = 1 mm. (C) Repräsentative Bilder der elastischen van Gieson-Färbung von Aorten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die periaortische Anwendung von CaPO4 ist ein robuster Ansatz zur Induktion von AAA bei Mäusen. Mehrere Studien haben das CaPO4-Modell verwendet und übereinstimmend berichtet, dass dies eine schnelle und reproduzierbare Methode ist, um AAA bei Mäusen 7,9 zu untersuchen. Dieses Modell rekapituliert einen Teil der Merkmale des menschlichen Aortenaneurysmas und liefert mechanistische Einblicke in die AAA-Pathogenese, einschließlich Entzündung und extrazellulärem Matrixabbau.
Zu den Risikofaktoren für menschliche AAA gehören hauptsächlich Alterung, männliches Geschlecht, Rauchen, Hyperlipidämie, Bluthochdruck und Atherosklerose10. Obwohl nicht systematisch untersucht, wurde auch festgestellt, dass Hyperlipidämie Mäuse für eine AAA-Expansion prädisponiert, wenn das CaPO4-Modell verwendet wird. Im Gegensatz zum Menschen spielt das Altern eine untergeordnete Rolle bei der AAA-Bildung in der Maus CaPO4 Modell5. Frühere große epidemiologische Studien haben gezeigt, dass Diabetes ein unabhängiger negativer Risikofaktor für AAA11 beim Menschen ist. Während einige Daten darauf hindeuten, dass Metformin, ein Diabetesmedikament, diesen Effekt verursacht, ist es alternativ von Interesse, dass Hyperglykämie im CaPO4-Modell die Aortendilatation durch die Unterdrückung der Makrophagenaktivierung hemmt12.
Derzeit wurden mehrere chemisch induzierte murine AAA-Modelle etabliert, darunter Elastase-Inkubation, CaPO-4-Inkubation und subkutane AngII-Perfusion2. Im Allgemeinen wurden die Elastase- und CaPO4-Modelle an 8-10 Wochen alten männlichen Wildtyp-Mäusen durchgeführt, und das AngII-Modell wurde an Hyperlipidämie-Mäusen (wie ApoE-/- und LDLR-/- Mäusen) oder 5-6 Monate alten Mäusen durchgeführt, um AAA13 zu induzieren. Alle drei Modelle phänokopieren die wichtigsten pathologischen Merkmale der menschlichen AAA, einschließlich des Abbaus elastischer Fasern und der Infiltration von Immunzellen. Im Vergleich zu den beiden anderen Modellen führt die Anwendung von CaPO 4 7 Tage nach der Operation zu einer schnellen und mehr als 1,5-fachen Ausdehnung der Aorta, verbunden mit einem dramatischen Elastinabbau und Kalziumablagerung4. Das CaPO4-Modell induziert eine fusiforme Dilatation an der infrarenalen Bauchaorta, die den menschlichen AAA-Zustand nachahmt, während die AngII-Perfusion sowohl suprarenale AAA als auch thorakale Aortenaneurysmen induziert. In Anbetracht der Kosten für Elastase, AngII und die osmotische Minipumpe ist es kostengünstiger, das CaPO4-Modell durchzuführen. Es ist jedoch fair zu sagen, dass das CaPO4-Modell keine AAA-Merkmale wie Wandthrombusbildung und Aortenruptur induzieren kann, und das Modell ist schnell und daher weniger geeignet für die Durchführung von Interventionsstudien mit bestehender AAA. Das CaPO4-Modell ist ideal für die Arbeit mit genetisch veränderten Mäusen, um die Anfälligkeit für die AAA-Entwicklung zu bewerten.
Der Mechanismus, der der CaPO 4-induzierten AAA-Bildung zugrunde liegt, ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Frühere Studien deuten darauf hin, dass das Kalziumion direkt an die wichtigsten arteriellen Strukturkomponenten, Elastin und Kollagen, binden kann, was den Abbau der extrazellulären Matrix erleichtert und die Stabilität der Gefäßwand verringert14. Es wurde auch festgestellt, dass CaPO 4-Kristalle eine signifikante NOD-ähnliche Rezeptorprotein 3 (NLRP3)-Inflammasom-Aktivierung und Apoptose glatter Muskelzellenauslösen 4,15. Außerdem sind Mikroverkalkungskristalle in der Lage, mononukleäre Zellen zu osteoklastenähnlichen Zellen zu induzieren und die Produktion von Matrix-Metalloproteinase (MMP) zu fördern und letztendlich zu einer Aortenexpansion zu führen16.
Bei der Durchführung des CaPO4-Modells müssen mehrere Probleme vermieden werden, um die Erfolgsquote zu verbessern. Man sollte vermeiden, die Blutgefäße des Rückenastes zu reißen, die Zugabe von überschüssiger CaCl2-Lösung in die Bauchhöhle zu vermeiden und eine Überdosierung der Anästhesie zu vermeiden. Mäuse mit starken Blutungen während der Operation oder mit postoperativer Infektion sollten vom Experiment ausgeschlossen werden. Wie bereits berichtet, wenn die Anzahl der Beobachtungen ausreichend ist, sind die maximalen Durchmesser der Aorten im CaPO4-Modell normalerweise normalverteilt, was sich vom AngII-Modell7 unterscheidet. Daher empfehlen wir bei Verwendung des CaPO4-Modells einen Vergleich der maximalen Durchmesser von Aorten anstelle der AAA-Inzidenz.
Insgesamt ist das CaPO 4-induzierte Maus-AAA-Modell ein schneller und kostengünstiger Ansatz, um die molekularen Mechanismen und therapeutischen Strategien von AAA zu erforschen und könnte parallel zu den anderen Modellen angewendet werden, um die Merkmale der menschlichen AAA vollständig zu imitieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch Mittel der National Natural Science Foundation of China (NSFC, 81730010, 91839302, 81921001, 31930056 und 91529203) und des National Key R&D Program of China (2019YFA 0801600) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | MECKLIN | C805225 | |
| NaCl | Biomed | SH5001-01 | |
| PBS | HARVEYBIO | MB5051 | |
| Small animal ventilator | RWD | H1550501-012 |
References
- Kent, K. C. Abdominal aortic aneurysms. The New England Journal of Medicine. 371, 2101-2108 (2014).
- Patelis, N., et al. Animal models in the research of abdominal aortic aneurysms development. Physiological Research. 66 (6), 899-915 (2017).
- Gertz, S. D., Kurgan, A., Eisenberg, D. Aneurysm of the rabbit common carotid artery induced by periarterial application of calcium-chloride in vivo. Journal of Clinical Investigation. 81 (3), 649-656 (1988).
- Yamanouchi, D., et al. Accelerated aneurysmal dilation associated with apoptosis and inflammation in a newly developed calcium phosphate rodent abdominal aortic aneurysm model. Journal of Vascular Surgery. 56 (2), 455-461 (2012).
- Wang, Y. T., et al. Influence of apolipoprotein E, age and aortic site on calcium phosphate induced abdominal aortic aneurysm in mice. Atherosclerosis. 235 (1), 204-212 (2014).
- Zhao, G., et al. Unspliced xbp1 confers VSMC homeostasis and prevents aortic aneurysm formation via foxo4 interaction. Circulation Research. 121 (12), 1331-1345 (2017).
- Jia, Y., et al. Targeting macrophage TFEB-14-3-3 epsilon interface by naringenin inhibits abdominal aortic aneurysm. Cell Discovery. 8 (1), 21 (2022).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Yu, B., et al. CYLD deubiquitinates nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4 contributing to adventitial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1698-1709 (2017).
- Altobelli, E., Rapacchietta, L., Profeta, V. F., Fagnano, R. Risk factors for abdominal aortic aneurysm in population-based studies: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2805 (2018).
- Theivacumar, N. S., Stephenson, M. A., Mistry, H., Valenti, D. Diabetes mellitus and aortic aneurysm rupture: A favorable association. Vascular and Endovascular Surgery. 48 (1), 45-50 (2014).
- Tanaka, T., Takei, Y., Yamanouchi, D. Hyperglycemia suppresses calcium phosphate-induced aneurysm formation through inhibition of macrophage activation. Journal of the American Heart Association. 5 (3), 003062 (2016).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Urry, D. W. Neutral sites for calcium ion binding to elastin and collagen: A charge neutralization theory for calcification and its relationship to atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (4), 810-814 (1971).
- Li, Z. Q., et al. Runx2 (runt-related transcription factor 2)-mediated microcalcification is a novel pathological characteristic and potential mediator of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (5), 1352-1369 (2020).
- Kelly, M. J., Igari, K., Yamanouchi, D. Osteoclast-like cells in aneurysmal disease exhibit an enhanced proteolytic phenotype. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), 4689 (2019).
