Summary
細胞培養またはマウス腫瘍モデルにおける化学療法薬によって誘導された老化癌細胞の蛍光フローサイトメトリー定量のためのプロトコルが提示されます。オプションの手順には、共免疫染色、大規模なバッチまたは時点分析を容易にするためのサンプル固定、およびフローサイトメトリーソーティングによる生細胞濃縮が含まれます。
Abstract
細胞老化は、生物学的損傷によって誘発される増殖性停止の状態であり、通常は老化した細胞で何年にもわたって発生しますが、さまざまな癌治療によって誘発される損傷への応答として腫瘍細胞に急速に現れることもあります。老化細胞は死に抵抗性になり、腫瘍の悪性度と治療抵抗性を悪化させながら腫瘍の寛解をブロックするため、腫瘍細胞の老化は一般的に望ましくないと考えられています。したがって、老化した腫瘍細胞の同定は、癌研究コミュニティにとって継続的な関心事です。様々な老化アッセイが存在し、その多くは、よく知られている老化マーカーである老化関連β−ガラクトシダーゼ(SA−β−Gal)の活性に基づいている。
典型的には、SA-β-Galアッセイは、固定細胞上の発色基質(X-Gal)を用いて行われ、光学顕微鏡による「青色」老化細胞のゆっくりとした主観的な列挙が行われる。C12-FDG(緑色)およびDDAO-ガラクトシド(DDAOG;遠赤色)を含む、細胞透過性の蛍光SA-β-Gal基質を使用した改良されたアッセイにより、生細胞の分析が可能になり、フローサイトメーターを含むハイスループット蛍光分析プラットフォームの使用が可能になりました。C12-FDGはSA-β-Galのプローブとして十分に文書化されていますが、その緑色蛍光発光は、リポフスチン凝集体の蓄積により老化中に生じる固有の細胞自家蛍光(AF)と重複しています。遠赤色のSA-β-GalプローブDDAOGを利用することにより、緑色の細胞自家蛍光を老化を確認するための二次パラメータとして使用でき、アッセイの信頼性が向上します。残りの蛍光チャネルは、細胞生存率染色またはオプションの蛍光免疫標識に使用できます。
フローサイトメトリーを使用して、老化した腫瘍細胞を同定するためのデュアルパラメーターアッセイとしてDDAOGとリポフスチン自家蛍光の使用を実証します。生細胞の割合の定量が行われる。所望により、目的の細胞表面抗原を評価するための任意の免疫標識ステップが含まれていてもよい。同定された老化細胞は、フローサイトメトリーで選別し、ダウンストリーム分析のために収集することもできます。集められた老化細胞は、直ちに溶解(例えば、イムノアッセイまたは'オミクス分析のために)またはさらに培養することができる。
Introduction
老化細胞は通常、通常の生物学的老化の間に何年にもわたって生物に蓄積しますが、放射線や化学療法を含むさまざまな癌治療によって誘発される損傷への応答として腫瘍細胞で急速に発達することもあります。もはや増殖しないが、治療誘発老化(TIS)腫瘍細胞は治療抵抗性に寄与し、再発を引き起こす可能性がある1,2,3。TIS細胞によって分泌される因子は、免疫回避または転移を促進することにより、腫瘍の悪性腫瘍を悪化させる可能性があります4,5。TIS細胞は、複雑な状況特異的な表現型、変化した代謝プロファイル、および独自の免疫応答を発達させます6,7,8。したがって、さまざまな癌治療アプローチによって誘導されるTIS腫瘍細胞の同定と特性評価は、癌研究コミュニティにとって継続的な関心事です。
TIS腫瘍細胞を検出するために、従来の老化アッセイが広く用いられており、主として老化マーカー酵素であるリソソームβ-ガラクトシダーゼGLB19の活性の増加を検出することに基づいている。(酸性ではなく)中性に近いリソソームpHでの検出により、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-Gal)10を特異的に検出できます。数十年にわたって使用されてきた標準的なSA-β-Galアッセイは、青色発色ベータガラクトシダーゼ基質であるX-Gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)を使用して、光学顕微鏡によって固定細胞中のSA-β-Galを検出します11。X-Galアッセイは、一般的に入手可能な試薬や実験装置を利用してTISを定性的に視覚的に確認することができます。基本的な透過光顕微鏡は、青色色原体の存在を評価するために必要な唯一の機器です。ただし、X-Gal染色手順は感度に欠ける可能性があり、色が発色するまでに24時間以上かかる場合があります。染色に続いて、光学顕微鏡下で青色色原体のある程度の強度を示す細胞をカウントすることに基づいて、個々の老化細胞の低スループットの主観的スコアリングが行われます。X-Galは細胞不透過性であるため、このアッセイには溶媒固定細胞が必要であり、ダウンストリーム分析のために回収することはできません。動物や患者からの限られたサンプルを扱う場合、これは大きな欠点になる可能性があります。
C 12-FDG(5-ドデカノイルアミノフルオレセインジβ-D-ガラクトピラノシド、緑色)およびDDAOG(9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン-7-イル)β-D-ガラクトピラノシド、遠赤色)を含む、細胞透過性の蛍光酵素基質を用いた改良されたSA-β-Galアッセイは、文献12,13,14,15にすでに登場しています。DDAOGの化学プローブの構造と光学特性を補足図S1に示します。これらの細胞透過性プローブは(固定ではなく)生細胞の分析を可能にし、発色プローブではなく蛍光プローブは、ハイコンテントスクリーニング装置やフローサイトメーターなどの高速ハイスループット蛍光分析プラットフォームの使用を容易にします。ソーティングフローサイトメーターを使用すると、細胞培養物や腫瘍から濃縮された老化細胞の集団を回収して、ダウンストリーム分析(ウェスタンブロッティング、ELISA、オミクスなど)を行うことができます。蛍光分析は定量的シグナルも提供し、特定のサンプル内の老化細胞の割合をより正確に決定できるようにします。生存率プローブや蛍光色素標識抗体などの蛍光プローブも容易に追加でき、SA-β-Gal以外のターゲットのマルチプレックス解析が可能です。
DDAOGと同様に、C12-FDGはSA-β-Galの蛍光プローブですが、その緑色の蛍光発光は、細胞16にリポフスチン凝集体が蓄積するために老化中に生じる固有の細胞AFと重なります。遠赤色DDAOGプローブを利用することにより、緑色セルラーAFを老化17を確認するための二次パラメータとして使用できます。これにより、老化18の単一マーカーとして信頼性が低いことが多いSA-β-Galに加えて、2番目のマーカーを使用することでアッセイの信頼性が向上します。老化細胞における内因性AFの検出はラベルフリーのアプローチであるため、DDADOGベースのアッセイの特異性を拡大するための迅速かつ簡単な方法です。
このプロトコルでは、 in vitro 培養から、またはマウスで確立された薬物治療腫瘍から単離された生存可能なTIS腫瘍細胞を同定するための迅速なデュアルパラメータフローサイトメトリーアッセイとしてDDAOGおよびAFを使用する方法を示します(図1)。このプロトコルは、市販の幅広い標準的なフローサイトメトリー分析装置およびソーターと互換性のある蛍光色素を使用しています(表1)。標準的なフローサイトメトリー分析を用いた生細胞の割合の定量が可能です。所望により、任意の免疫標識ステップを実施して、老化と同時に目的の細胞表面抗原を評価してもよい。同定された老化細胞は、標準的な蛍光活性化セルソーティング(FACS)方法論を使用して濃縮することもできます。
図1:実験ワークフロー。 DDAOGアッセイの要点をまとめた概略図。(A)哺乳類培養細胞にTIS誘導薬を添加するか、担がんマウスに投与する。その後、TISの発症に時間が与えられます:細胞の場合、治療後4日。マウスの場合、合計22日間、5日ごとに3回の治療と7日間の回復。細胞を採取するか、腫瘍を解離して懸濁液にします。(B)サンプルをBafで処理して、SA-β-Galを検出するためにリソソームpHを30分間調整します。次に、DDAOGプローブを60分間追加して、SA-β-Galを検出します。サンプルをPBSで2回洗浄し、生存率染色剤を短時間加えます(15分)。オプションで、サンプルをオープン蛍光チャネルで蛍光抗体で染色したり、後で分析するために固定したりすることができます。(C)サンプルは、標準のフローサイトメーターを使用して分析されます。生細胞は、赤色のDDAOG(SA-β-Galを示す)と緑色の自家蛍光(リポフスチン)を示すドットプロットで視覚化されます。TIS細胞の割合を決定するためのゲートは、未処理の対照試料(図示せず)に基づいて確立される。ソーティングサイトメーター(FACS)を使用する場合、TIS細胞を回収して培養液に戻してin vitro アッセイを行ったり、分子生物学的アッセイのために溶解して処理したりすることができます。略語:DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;TIS =治療誘発性老化;FL-Ab = 蛍光色素標識抗体;Baf = バフィロマイシンA1;SA-β-Gal=老化関連β-ガラクトシダーゼ;PBS =リン酸緩衝生理食塩水;FACS = 蛍光活性化細胞選別。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| フルオロフォア | 検出 | 例/エム (ナノメートル) | サイトメーターレーザー(nm) | サイトメーター検出器/バンドパスフィルター(nm) |
| ダオグ | サβガル | 645/6601 | 640 | 670 / 30 |
| AF | リポフスチン | < 600 | 488 | 525 / 50 |
| CV450 | 生存 率 | 408/450 | 405 | 450 / 50 |
| ペ | 抗体/表面マーカー | 565/578 | 561 | 582 / 15 |
表1:蛍光色素およびサイトメーターの光学仕様。 このプロトコルで使用されるサイトメーターの仕様は、合計4つのレーザーと15の発光検出器を備えた機器についてリストされています。645/660 nmで検出されたDDAOGは、SA-β-Gal1によって切断されたプローブの形態です。切断されたDDAOGは、460/610 nmで低レベルの蛍光を示す可能性がありますが、プロトコルの洗浄ステップによって除去されます。略語:DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;AF =自家蛍光;PE =フィコエリスリン;SA-β-Gal =老化関連β-ガラクトシダーゼ。
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Protocol
記載されているすべての動物実験は、シカゴ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1.原液の調製と保管
注:細胞をフローソーティングする場合は、滅菌技術を使用してすべての溶液を調製し、0.22 μmフィルター装置でろ過する必要があります。
- DDAO-ガラクトシドのストック溶液をDMSO溶液5 mg/mLで調製します。チューブあたり50 μL(または希望する容量)で分注します。.-20°Cで暗所で最長1年間保管してください。
- バフィロマイシンA1のストック溶液をDMSO中で1 mMで調製します。チューブあたり50 μL(または希望する容量)で分注します。.-20°Cで最大6ヶ月間保管してください。
- カルセインバイオレット450 AMのストック溶液をDMSO溶液1 mMで調製します。チューブあたり50 μL(または希望する容量)で分注します。.-20°Cで暗所で最長1年間保管してください。
- 培養細胞を in vitroで処理するには、老化誘導剤の10 mM濃縮ストック溶液を適切な溶媒に調製し、0.2 μmシリンジフィルターを使用して滅菌します。-20°Cまたは製造元の指示に従って保管してください。
注:老化誘発化学療法剤 をin vivo (確立された腫瘍を有するマウスに)送達する場合、薬剤はUSPグレードであり、注射直前に濃縮ストックから生理食塩水に希釈する必要があります。 - 使用する細胞株用の完全な培地を準備します。
注:例えば、DMEM 1x + 10%FBS + 1xグルタミン代替物+ 1xペニシリン/ストレプトマイシンを含むB16-F10またはA549細胞用の培地を調製します。培地は無菌状態に保たなければなりません。他の細胞株特異的培地製剤を使用することができる。グルタチオンなどの特定の成分は、場合によっては、老化の発症を妨げる可能性があります。老化の発症が予想よりも低い場合、または対照化学療法剤で観察されない場合は、さまざまな培地製剤の実証試験を実施する必要があります。. - 染色バッファーと洗浄バッファーを準備します。
- 染色手順で使用するために、1x PBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製します。2 gのBSAを200 mLのPBSに溶解し、室温で10分間、または完全に溶解するまで攪拌します。
- 洗浄バッファーとして1x PBS中の0.5%BSAを調製します。ステップ1.6.1で調製した1%BSAの100 mLを、0.5%BSA用の1x PBSの100 mLに希釈します。
- バッファーを4°Cで最長1ヶ月間保存します。
- 1x PBSで4%パラホルムアルデヒドを調製します。利便性と安定性のために、市販の密封パラホルムアルデヒドアンプル(16%v/vなど)を使用してください:16%PFAの2.5 mL + 1x PBSの7.5 mL(= 4%PFAの10 mL)。実験ごとに必要な総量に応じて、準備した量を調整してください。
注:細胞固定のみの必要に応じて準備します。毎回新鮮な準備をしてください。 - FACSソーティングバッファーを調製します:1x PBS、1 mM EDTA、25 mM HEPES、1% BSA(pH 7.2)。0.22 μmのろ過装置に通した滅菌フィルターで、4°Cで最長1ヶ月間保存します。
メモ: 必要に応じて、FACS ソート専用に準備します。フローソーティングバッファーの配合は、FACS機器によって異なる場合があります。上記の処方は、この研究で使用された機器と互換性があります( 材料の表を参照)。製造元のガイドラインを参照してください。 - 腫瘍解離溶液を調製する:RPMI-1640培地中の20 μg/mLリベラーゼTL + 100 μg/mL DNAse I(FBSまたは他のサプリメントなし)。ストック溶液は、リベラーゼTL(製造元の指示に従って調製および保存)およびDNAseI(二重蒸留水[ddH2O]中の100 mg / mL、-20°Cで保存)を手元に保管するのに役立ちます。
注:腫瘍のみを使用する場合は、必要に応じて準備してください。毎回新鮮な準備をしてください。
2. 化学療法薬による培養癌細胞における老化誘導
注:このセクションのすべての細胞操作手順は、無菌慣行を使用してバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。このセクションは、接着細胞タイプについて書かれています。浮遊細胞は、記載したように適宜改変して使用してもよい。
- 使用する特定の細胞株を提供したサプライヤーまたは研究所からの標準プロトコルに従って癌細胞株を増殖させます。
注:低継代細胞(p < 10)は、未処理の細胞サンプルでは、複製老化のレベルが低い、つまりバックグラウンドが低いため、一般的に好まれます。 - 薬物による老化誘導の1日前に、トリプシン-EDTA0.25%(または推奨)で細胞を回収します。等量の完全培養培地を加えてトリプシンを中和し、細胞懸濁液を滅菌円錐管に移します。
注:この手順は、浮遊細胞には必要ありません。 - 標準的な血球計算法を使用して細胞をカウントし、細胞/ mLを記録します。標準的な6ウェルプラスチック培養皿に1 ×10 3-10 × 10 3 細胞/cm2 で細胞をプレートします。
注:最適なめっき密度は細胞の増殖速度に依存し、ユーザーが決定する必要があります。細胞は、処理時に約10%〜20%のコンフルエントで対数期増殖している必要があります(すなわち、.、メッキ後の18〜24時間のインキュベーション後)。.浮遊細胞の開始密度(細胞/ mL)は、ユーザーが決定する必要があります。6ウェルプレートは、通常、1ウェルあたり1つの標準フローサイトメトリー分析サンプルに対して十分な老化細胞を生成します。フローソーティングの場合、ダウンストリームアッセイに十分な数の老化細胞を回収できるように、はるかに大きな表面積(例えば、複数のP150プレート)を使用する必要があります(≥1×106)。 - 5%CO2 と湿度パンを備えた37°Cのインキュベーターで、播種細胞を一晩(18〜24時間)インキュベートします。
- 播種した細胞を老化誘発化学療法薬で治療します。少なくとも1つの陽性対照、例えば、エトポシド(ETO)またはブレオマイシン(BLM)を含む。薬ごとに重複したウェルを準備します。コントロールとして車両のみで処理された1セットを含みます。
注:各実験薬剤の用量曲線は、使用されている細胞株の老化誘導に最適な濃度を決定するために、ユーザーがテストする必要があります。. - 5%CO2 と湿度パンを備えた37°Cのインキュベーターで細胞を4日間インキュベートし、老化の開始を可能にします。光学顕微鏡を使用して、予想される形態変化について毎日調べます。
注:老化の発症率によっては、3〜5日の潜伏時間が許容される場合があります。培地を変更し、必要に応じて薬剤を再適用(または適用しない)して、老化細胞の許容可能な割合を達成しながら健康な増殖条件を促進することができます。 - 老化の開始後、トリプシン-EDTA 0.25%を添加して37°Cで5分間細胞を回収します。 細胞が懸濁液に解離したら、等量の完全培地でトリプシンを中和します。
注:このステップは、懸濁状態で増殖する細胞には必要ありません。表面マーカー染色を行う場合は、細胞の表面抗原を一時的に破壊する可能性があるため、トリプシン-EDTAの使用は避けてください。代わりに、滅菌プラスチックセルスクレーパー(または表面抗原を保存するように設計された代替解離試薬)を使用して単層を穏やかに解離します。 - 血球計算盤を使用して各サンプルの細胞をカウントします。各サンプルの細胞/mLを計算します。
注:この時点での死細胞の割合を評価するためにトリパンブルーを追加することができます(つまり、薬物処理による)が、細胞死もDDAOG染色ワークフロー中に蛍光生存率色素で決定されます。 - サンプルあたり≥0.5×106 セルを1.7 mLマイクロ遠心チューブに分注します。
注:サンプルあたりの細胞数は、すべてのサンプルで標準化する必要があります。 - チューブを4°Cのマイクロ遠心分離機で1,000 × g で5分間遠心分離します。 上清を取り除きます。
注:冷蔵マイクロ遠心分離機が利用できない場合は、特定の弾力性のある細胞タイプに対して周囲温度で遠心分離を行うことが許容される場合があります。 - セクション4のDDAOG染色に進みます。
3. マウスに樹立した腫瘍に対する化学療法薬による老化誘導
注:腫瘍細胞をFACSで分類する場合は、バイオセーフティキャビネットで作業し、滅菌器具、手順、および試薬を使用して作業することにより、各ステップで無菌性を確保します。
- 標準的な方法に従って、癌細胞を皮下注射することにより、マウス腫瘍モデルを作成します(例えば、Appelbeら19)。
注:注射するがん細胞の数、注射部位、および適切なマウス系統は、プロトコルごとに最適化する必要があります。ここでは、B16-F10細胞を0.1 mLの生理食塩水(1 × 107 cells/mL)中の1×10 6細胞で皮下注射した。- 注射を行う前に、トリパンブルーを使用した細胞の生存率が>90%であることを確認してください。マウスをイソフルランで麻酔する。
- 6〜7週齢の雌C57 / BL6マウスを3%イソフルランと空気の混合物で麻酔し、滅菌バイオセーフティキャビネット内に置かれた誘導チャンバーでこれらの条件下で維持します。マウスの足をそっとつまんで麻酔を確認します。手術中の角膜の乾燥を防ぐために、滅菌獣医軟膏を両眼に塗布します。処置中は、加熱ランプを使用してマウスの体温を維持します。
- 滅菌バイオセーフティキャビネット内で作業し、マウスを誘導チャンバーから取り出し、3%のイソフルラン供給を提供するノーズコーンと接触させます。清潔な電気かみそりを使用して、注射部位の側面領域を剃ります。注射直前にチューブを手動で反転させて調製した細胞懸濁液を短時間混合し、滅菌27 G針を取り付けた滅菌0.5 mLシリンジを使用して、細胞懸濁液を剃毛した脇腹に皮下注射します。フードからマウスを取り外し、リカバリケージに移します。
- 回復ケージでは、マウスが胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻し、右反射を示し、ケージ内を安全に動き回ることができるようになるまで、マウスのバイタルサインを継続的に監視します。完全に回復するまで、マウスを放置したり、腫瘍細胞接種を受けた動物を他の動物と一緒に戻したりしないでください。.接種されたすべてのマウスを毎日監視して、体重減少、活動/可動性の低下、および神経学的症状を確認します。あらゆるカテゴリーで重篤な症状を示すマウスを安楽死させる。接種後に痛みの症状を示すマウスには、ブプレノルフィン(0.1〜0.2 mg / kg)を皮下に1回投与します。.
注:ブプレノルフィン後に持続的な痛みを示すマウスは安楽死させる必要があります。.
- がん細胞接種後5〜7日から、2〜3日ごとにノギスで腫瘍の成長を測定します。腫瘍の体積が50 mm 3±10 mm3に達したら、プロセネッセント治療を開始します。
注:この作業では、USPグレードの塩酸ドキソルビシン(DOX)またはPEG化リポソームドキソルビシン(PLD)の用量を10 mg / kgで0.9%塩化ナトリウム注射(USP)で投与しました。薬物は、腫瘍が50mm3±10mm3に達したときから、5日に1回、腹腔内注射された。マウスは、腫瘍におけるTISの発症を可能にするために最終処置後7日間回復した。他の治療および/または腫瘍モデルの老化誘導投与量および条件を最適化する必要があります。. - 最終薬物治療の7日後に、実験動物作業ガイドラインに準拠したCO2 過剰摂取および頸部脱臼または他の承認された方法によってマウスを屠殺する。腫瘍を切除し、滅菌RPMI増殖培地で満たされた滅菌チューブまたは6ウェルプレートに収集します(処理中の生存率を維持するため)。
注:組織学的検査(X-Galや免疫組織化学など)を行う場合、腫瘍をここで二分し、O.C.T.包埋培地で半分を急速凍結し、凍結組織学の標準的な手順を使用して凍結することができます。残りの腫瘍の半分は、解離およびDDAOG染色のための豊富な材料をもたらすはずです。 - 1つの腫瘍を5 mLのRPMI培地を含むP100プラスチック皿に移します。メスを使って腫瘍を細かく刻みます。
- 浮遊細胞と破片を含む腫瘍片の懸濁液5 mLを15 mLのコニカルチューブに移します。大きな破片が存在する場合は、25 mLの血清学的ピペットの広い先端を使用して、この懸濁液を移します。材料を集めるために、追加の量の滅菌RPMIで皿をすすぎます。円錐形のチューブに蓋をして氷の上に置きます。
- 残りの腫瘍について手順3.45〜3.5を繰り返します。相互汚染を避けるために、腫瘍ごとに別々のプレートとメスを使用するか、腫瘍の間にPBSでよくすすいでください。各腫瘍を細切するために5mLの新しい培地を使用してください。
- 腫瘍解離溶液を調製します:RPMI-1640培地(FBSなし)中の20 μg/mLリベラーゼTL + 100 μg/mL DNAse I。
注:腫瘍解離溶液のための多くの効果的な製剤が存在し、異なるメーカーの様々な酵素および他の成分を含むことができる。成分の最適濃度は、腫瘍の種類によって大きく異なります。赤血球が腫瘍内に高度に存在する場合、赤血球溶解がさらに行われることがあります。死細胞が問題になる場合は、死細胞除去キットを使用できます。ユーザーは、高い生存率と汚染細胞、結合物質、および破片の存在が少ない最適な腫瘍解離条件を独自に決定することを強くお勧めします。 - すべての腫瘍サンプルをコニカルチューブに入れて、1,000 × g (4°C)で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。
- 腫瘍材料の量に応じて、各腫瘍サンプルに1〜5 mLの腫瘍解離溶液を追加します。チューブ内に腫瘍材料ペレットが1〜2mL過剰にあることを確認してください。適度な速度で渦を流して混合します。
- サンプルを37°Cのインキュベーターに入れ、45分間急速回転させます。15分ごとに短時間渦を巻きます。
- 各サンプルを100 μmのセルストレーナーでろ過し、50 mLのコニカルチューブに入れます。サンプルの粘性が高すぎてフィルターを通過できない場合は、10 mLのRPMI-1640培地を加えて希釈します。フィルターをRPMI培地ですすぎ、残留細胞を収集します。
- 血球計算盤を使用して、各サンプルの細胞/ mLをカウントします。
- 腫瘍サンプルあたり5×106 細胞の2つ以上の反復を分注します。
- 1,000 × g (4°C)で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。
- (オプション)必要に応じて、後でDDADOG染色するために腫瘍サンプルを凍結保存します。
- 解離した腫瘍細胞ペレットを凍結保存培地(50% FBS、40% RPMI-1640、10% DMSO)に再懸濁し、5 ×10 6 細胞/mLの無菌条件下で調製します。
- 1 mLの細胞懸濁液を各クライオバイアルに分注します。
- -80°Cのイソプロパノール細胞凍結容器でクライオバイアルを24時間凍結します。その後、液体窒素凍結保存に移して長期保存(>1週間)します。
- 染色が必要な場合は、氷上でクライオバイアルを解凍し、セクション4のDDAOG染色に進みます。
注:一部の腫瘍は凍結保存によって生存し続けることができない場合があり、このプロセスに対する回復力は、関心のある腫瘍モデルについてユーザーが評価する必要があります。
- DDAOG染色のセクション4に進みます。
4.細胞または腫瘍サンプル中のSA-β-GalのDDAOG染色
- 1 mMバフィロマイシンA1ストックをDMEM培地(FBSなし)に1:1,000倍で希釈し、最終濃度1 μMにします。
- 調製したBaf-DMEM溶液を細胞ペレットサンプル(ステップ2.11またはステップ3.16から)に1×106 細胞/mLの濃度で加えます。
注:たとえば、サンプルあたり0.5×106 細胞を使用する場合は、0.5 mLのBaf-DMEMを追加します。腫瘍の場合、5 × 106 細胞を5 mLのBaf-DMEMで染色することができます。 - 低速に設定したローテーター/シェーカーで37°C(CO2なし)で30分間インキュベートします。
注:染色プロセスには、溶液を酸性化し、それによってBafおよびDDAOG染色を妨げる可能性のあるCO2 インキュベーターは避けてください。 - 洗浄せずに、DDAOGストック溶液(5 mg/mL)を1:500x(最終10 μg/mL)で各サンプルに加えます。混合するピペット。ローテーター/シェーカーで37°C(CO2なし)で60分間交換します。直射日光から保護してください。
- チューブを4°Cで1,000 x g で5分間遠心分離します。 上清を取り除きます。
- チューブとピペットあたり1 mLの氷冷0.5%BSAで洗浄して混合します。チューブを4°Cで1,000 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。この手順を2回繰り返して、細胞を完全に洗浄します。上清を取り除き、続行します。
注:手順4.6の洗浄手順を実行して、望ましくない蛍光発光(460/610 nm)を示す可能性のある未解決のDDAOGを除去することが重要です。
注:細胞表面マーカーの免疫染色の場合は、以下のセクション5に進んでください。 - (オプション)DDAOG染色細胞の固定と保存(後の解析用)
- 洗浄した各サンプルに0.5 mLの氷冷4%パラホルムアルデヒドを滴下します。混合するピペット。
- 室温で10分間インキュベートします。
- 細胞を1 mLのPBSで2回洗浄します。
- サンプルは、フローサイトメトリー分析の前に4°Cで最大1週間保存してください。
注: 固定サンプルの場合は、手順 4.8 をスキップします。
- カルセインバイオレット450 AMストック(1 mM)を1:1,000倍で1%BSA-PBS(最終1 μM)に希釈します。ステップ4.6で洗浄した細胞ペレットに300 μL(培養細胞サンプルの場合)または1,000 μL(腫瘍サンプルの場合)を追加します。暗闇の中で氷の上で15分間インキュベートします。
- フローサイトメトリーのセットアップ(セクション6)に進みます。
5.(オプション)DDAOGと組み合わせた細胞表面マーカーの免疫染色
注:他のフローサイトメトリー実験と同様に、DDAOGのみおよび蛍光抗体のみを含む単一染色コントロールサンプルは、蛍光チャネル間のクロストーク(存在する場合)を決定するために調製する必要があります。クロストークが観察された場合は、標準的なフローサイトメトリー補正を実施する必要があります20。
- ステップ4.6で得られた細胞ペレットを100 μLの染色バッファー(1x PBS中の1%BSA)に再懸濁します。
- 細胞種(マウスまたはヒト)に適したFc受容体遮断試薬を、メーカー推奨の滴定で添加します。24°Cで10分間インキュベートします。
- 蛍光色素標識抗体は、メーカーが推奨する(またはユーザーが決定した)滴定で添加します。光から保護された氷上で20分間インキュベートします。
- チューブを4°Cで1,000 × g で5分間遠心分離します。 上清を取り除きます。
- チューブとピペットあたり1 mLの氷冷洗浄バッファー(0.5%BSA-PBS)で洗浄し、混合します。チューブを4°Cで1,000 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。この手順を2回繰り返して、細胞を完全に洗浄します。
- 1 mMカルセインバイオレット450 AMを1:1,000倍で1%BSA-PBSに希釈します。ステップ5.5で洗浄した細胞ペレットに300 μLを加えます。暗闇の中で氷の上で15分間インキュベートします。
- フローサイトメトリー分析に進みます(セクション6〜7)。
6. フローサイトメーターのセットアップとデータ取得
- 細胞サンプルをフローサイトメトリー装置と互換性のあるチューブに移します。チューブを氷の上に置き、光から保護してください。
注:細胞懸濁液に凝集体が観察された場合は、分析前に懸濁液を70〜100μmの細胞ストレーナーに通してください。40μmのストレーナーは、より大きな老化細胞の一部を排除する可能性があるため、使用しないでください。 - 参照ソフトウェア( 材料表を参照)で、次のプロットを開きます:1)FSC-A対SSC-Aドットプロット、2)バイオレットチャンネルヒストグラム、3)遠赤色チャンネル(APC-Aなど)対緑チャンネル(FITC-Aなど)ドットプロット。
注:ダブレット除外プロットとシングルチャンネルヒストグラムも使用できますが、厳密には必須ではありません。 - サイトメーターのデータ取得を開始します。
- DDAOGで染色された車両専用コントロールサンプルを吸気ポートに置きます。低い吸気速度で、サンプルデータの取得を開始します。
- FSC電圧とSSC電圧を調整して、事象の>90%がプロット内に含まれるようにします。セルがプロットにうまく収まらない場合は、面積スケーリング設定を0.33〜0.5単位に下げます。
- データを記録せずに車両専用サンプルを削除します。
- (オプション)レインボーキャリブレーションミクロスフェアを1 mLのPBSを含むサイトメーターチューブに1滴加えます。チューブをサイトメーターの吸気ポートに置きます。サンプルデータの取得を開始します。
- 紫、緑、遠赤のチャネル電圧を調整して、レインボーミクロスフェアのトップピークが各チャネルで104〜105 単位の相対蛍光の範囲になり、すべてのピークが各チャネルで十分に分離されるようにします。10,000 件のイベントを記録します。チューブを取り外します。
- DDAOGで染色されたポジティブコントロールサンプル(BLM、ETOなど)を吸気ポートに置きます。低速で、サンプルデータを取得します。FSC、SSC、紫、緑、遠赤の各チャネルのイベントを観察して、イベントの90%以上がすべてのプロットに含まれていることを確認します。AFおよびDDAOG信号と車両のみの制御の増加を探します。
- ソーティングサイトメーターを使用する場合は、このステップでソーティングを開始します。
- 記録保持の目的で、コントロールサンプルと各ソートサンプルの10,000個の細胞を記録します。
- 所望の量の細胞(通常≥1×106 が適しています)を、3〜5 mLの培養液を含む機器に適した収集チューブに分類します。
- 選別後、下流の培養または分析に進みます。
- 選別されたサンプルのルーチン分析については、セクション7にスキップしてください。
- 蛍光抗体を使用する場合は、セクション5で調製した非染色、単一染色、および二重染色のサンプルを使用して、ここでチャネル電圧を最適化します。
注:ここで使用されている校正済みフローサイトメーターの場合、最適なチャンネル電圧は通常250〜600(ミッドレンジ)でしたが、最適な電圧とチャンネル電圧範囲は機器によって異なります。信号を抑制したり、ノイズを増幅したりする可能性のある非常に低い範囲または高い範囲の電圧の使用は避けてください。 - 手順6.1〜6.5を完了し、必要に応じてサイトメーターの設定を調整した後、すべてのサンプルのデータを記録します。すべてのサンプル録音の設定が均一であることを確認してください。培養細胞サンプルあたり≥10,000イベント、または腫瘍細胞サンプルあたり≥100,000イベントを記録します。
注:ゲーティングと解析はデータ収集ソフトウェア(FACSDivaなど)を使用して実行できますが、別の解析ソフトウェア(FlowJo)を使用して取得後に実行される完全なゲーティングと解析のワークフローについては、以下のセクション7で説明します。サイトメーターワークステーションでの時間を短縮し、専用の分析ソフトウェアに含まれる追加ツールを利用するには、取得後の分析が推奨されます。 - サンプル データを .fcs ファイル形式で保存します。フローサイトメトリー解析ソフトウェア(FlowJoなど)を備えたワークステーションコンピュータにファイルをエクスポートします。セクション7に進みます。
7. フローサイトメトリーデータ解析
注:提示されたワークフローはFlowJoソフトウェアを使用しています。代替のフローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアは、このセクションで説明する重要な手順に同様に従う場合に使用できます。
- FlowJo ソフトウェアを使用して、手順 6.7 の .fcs データ ファイルを開きます。
- レイアウト ウィンドウを開きます。
- すべてのサンプルをレイアウトウィンドウにドラッグアンドドロップします。
- 生細胞をゲートします。
- まず、車両専用コントロールのサンプル データをダブルクリックして、データ ウィンドウを開きます。
- データをバイオレット チャネル ヒストグラムとして視覚化します。CV450で染色された生細胞を、死細胞よりも明るい蛍光に基づいて同定します。
- シングルゲートヒストグラムツールを使用してゲートを描画し、生細胞のみを含めます。ゲートに実行可能な名前を付けます。
- 次に、サンプルレイアウトウィンドウから、生存可能なゲートを他の細胞サンプルにドラッグして、ゲートを均一に適用します。
- レイアウトウィンドウで、すべてのサンプルをバイオレットチャンネル(生存率)ヒストグラムとして視覚化します。続行する前に、サンプル間で生細胞ゲーティングが適切であることを確認してください。そうでない場合は、必要に応じて調整します。
注:生存率染色は、治療法や腫瘍によってばらつきを示すことがあります。
- 老化細胞をゲートします。
- 車両専用コントロールのゲート付き生存セルデータをダブルクリックして、そのデータウィンドウを開きます。
- 遠赤チャンネル(DDAOG)と緑チャンネル(AF)のドットプロットとしてデータを視覚化します。
- 矩形ゲーティングツールを使用してゲートを描画し、DDAOG+ および AF+ (右上の象限) であるセルの <5% を含めます。ゲートに老化という名前を付けます。
- 次に、サンプルレイアウトウィンドウから、老化ゲートを他の細胞サンプルの生存可能なサブセットにドラッグして、ゲートを均一に適用します。
- レイアウトウィンドウに、セクション7.4でゲートされたすべての実行可能なセルサブセットをドラッグアンドドロップします。すべての生存サンプルを、遠赤色(APC-Aなど)と緑色のチャネル(FITC-Aなど)のドットプロットとして視覚化します。
- ステップ7.5.3で描画された老化ゲートがすべてのプロットに表示され、車両のみの制御のゲートが≤5%〜10%の老化細胞を示すことを確認します。
- 上記の手順を使用して老化細胞の割合を決定したら、FlowJoプロットを使用して結果のデータを提示し、データテーブルに要約するか、標準ソフトウェアを使用して統計的に分析します。
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Representative Results
SA-β-Galによる老化の検出について、DDAOGとX-GalおよびC12-FDGの比較可能性を実証するために、いくつかの実験が行われました。まず、X-Galを用いて、ETOにより誘導された老化性B16-F10メラノーマ細胞を染色した(図2A)。ETO処理細胞のサブセットでは濃い青色が発達しましたが、他の細胞はそれほど強くない青色染色を示しました。形態は、ほとんどのETO処理細胞で拡大した。ETO処理した細胞を蛍光SA-β-Gal基質C12-FDG(緑)またはDDAOG(遠赤色)で染色すると、X-Galと同等の染色パターンと強度の変動が示されました(図2B)。しかし、緑色のC12-FDG発光は細胞AFと重なり合い(図2C)、老化細胞17に蓄積することが知られている。対照的に、AFはDDAOGの遠赤色発光範囲では無視できる程度であった。
蛍光顕微鏡を使用して老化細胞をスコアリングしてカウントする代わりに、フローサイトメーターのハイスループット機能を利用して、サンプルあたり数千の細胞のデータを短時間で(サンプルあたり<5分)取得する方が便利でした。まず、最適なデータ取得を確実にするために、一連の標準フローサイトメトリーセットアップパラメータを実装しました(図3)。典型的なアプローチに従って、光散乱パラメータを設定して、細胞の体積(前方散乱、FSC)と粒度(側方散乱、SSC)を視覚化しました(図3A)。ここでは、ETO処理細胞の体積が増加する傾向に注目し、顕微鏡を使用して老化細胞で通常観察される拡大形態と一致しました。プロット上のより大きな細胞をより多く視覚化するには、デフォルトの面積スケーリング設定(細胞タイプと処理に応じて0.33〜0.50単位)を減らす必要がありました。一部の細胞株/処理では、粒度(SSC)の増加も明らかでした(データは示されていません)。全体として、細胞散乱データが期待どおりに表示され、過剰な細胞破片が存在せず、細胞が適切な流速(~100-1000細胞/s)でサイトメーターを介して処理されていることを確認するための品質管理ステップとして散乱評価が使用されました。機器のセットアップにのみ使用される品質管理ステップとして、ここではゲーティングや分析は実行されませんでした。
フローサイトメトリーセットアップの2番目の(オプションの)ステップは、市販の「レインボー」キャリブレーション粒子のサンプルを簡単に分析して、蛍光検出電圧が許容範囲に設定されていることを確認することでした(図3B)。最も明るいピークは、各チャネルで1 × 104 単位と1 ×10 5 単位の相対蛍光強度の間に設定され、明確に定義されたより低い強度のピーク、各ピーク間の十分な間隔、および隣接するピークの重なりはありませんでした。これらの電圧設定を使用して、10,000個のミクロスフェアの対照サンプルを記録しました。次に、ミクロスフェアを各サイトメトリーセッションでこの方法で使用して、プロトコルの過程でデータ取得の均一性を改善しました。
次に、ビヒクルのみまたはETO処理した細胞のサンプルを各蛍光チャネルで可視化し、ゲートを設定しました。細胞生存率ゲートは、紫色チャネルにおけるCV450生存率染色のシグナルに基づいて設定した(図3C)。ビヒクルのみで処理した細胞は88%の生存率を示し、ETO処理した細胞は75%の生存率を示しました(最終細胞サンプルでは、追加の死細胞は廃棄された培地で最初に除去され、染色プロセス中に機械的に崩壊した可能性があります)。次に、生態依性ゲーティング細胞を緑色(図3D)および遠赤色(図3E)の発光チャネルで可視化した。緑色AFHI および遠赤色DDAOGHI のゲートをビヒクル専用細胞の<5%に設定し、これらのゲートをETO処理細胞に適用した。このアプローチを使用して、ETO処理細胞の46%がAFHI であり、33%がDDAOGHIであると決定されました。これらの値は、文献および私たちの研究室での多数の複製実験の結果に基づいて予想される範囲内でした。サイトメーターのセットアップが完了すると、実験のすべての細胞サンプルを同一のデータ取得設定を使用して実行しました。サンプルあたり10,000イベントのデータが得られました。
代表的なアッセイデータを 図4に示す。B16-F10マウスメラノーマ細胞またはA549ヒト肺腺癌細胞を癌細胞株モデルとして用いた。各細胞株を、老化を誘発することが知られている化学療法剤(ETOまたはBLM)で4日間処理して、老化またはビヒクルのみを誘導した。また、既知の老化細胞除去剤ABT-26321 を誘導老化細胞に2日間添加し、DDAOGプローブの特異性を実証した。ABT−263のみのサンプルを追加対照として調製した。ここでは、データはDDAOG(670 nm発光)とAF(525 nm)の2Dドットプロットとして視覚化されています。 図3 のワークフローをサイトメーターのセットアップに使用し、ビヒクルのみの細胞の<5%がTISとしてスコアリングされるようにTISゲートを設定しました。B16-F10細胞を用いた結果(図4A)は、生存可能なB16-F10細胞の35%( 図2D、Eに示す比較可能なデータと同様)においてETO誘導性TISを示し、老化細胞除去剤はTIS細胞をほぼ完全に排除した(<2%)。A549細胞(図4B)では、BLMは生存細胞の66%でTISを誘導し、ABT-263はその割合を15%に減少させました。ABT-263単独では、未処理の増殖細胞に対して毒性がなかった。
さらに、蛍光抗体の共染色がDDAOG老化アッセイと互換性があり、TIS関連または新規表面マーカーのスクリーニングを容易にすることを実証することを目的としていました。ここで、B16−F10マウスメラノーマ細胞を、TIS誘導ETO(またはビヒクル)で4日間再び処理した。次に、細胞をDDAOGで染色してTISを評価し、蛍光抗体で染色してTIS関連表面マーカーDPP422を検出しました(図5)。R-フィコエリスリン(PE)に結合した抗DPP4を用い、使用したフローサイトメーターでPEとDDAOGおよびAFの重複はごくわずかであることを確認しました(補足図S2)。>5,000の生細胞に関するPEチャネルデータのヒストグラム(図5A)は、ETO処理細胞の42%がDPP4+であることを示しました(ビヒクルのみのサンプルを使用して陽性ゲートを設定しました)。同じサンプルの2Dドットプロットを視覚化すると(図5B、C)、ETO処理細胞の44%がDDAOG(すなわち老化)とDPP4のダブルポジティブであったのに対し、ビヒクルのみの細胞の4%が示されました。これらのデータは、表面マーカー抗体による生細胞染色がDDAOG老化アッセイと組み合わせて可能であることを示しています。
生細胞染色法の潜在的な懸念事項には、長時間の分析セッション(>1時間)中に発生する細胞死や、多くの異なる時点(最大数日間隔)にわたってサンプルを最も効率的に染色および分析する方法が含まれます。染色された細胞の溶媒ベースの固定は、サンプルが染色されるとすぐに固定され、1つの温度安定性バッチで分析されるまで冷蔵庫に保存できるため、これらの懸念の両方に対処します。そこで、DDAOGで染色した生細胞を100%メタノールまたは4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、4°Cで最大1週間保存できるかどうかをテストしました。 望ましくないことに、メタノール固定はDDAOGシグナルを減少させ、AFを有意に減少させた(データは示さず)。したがって、固定溶媒としてのメタノールの使用は避けるべきです。しかし、DDAOGで染色した後、4%PFAで10分間固定した細胞については図6に見られるように、PFAによる固定ははるかに成功しました。固定されていない対照サンプル(図6A;未処理の5%およびBLM、67%DDAOGHI AFHI)と比較して、固定サンプル(図6B)は、未処理の細胞でわずかに高いバックグラウンド(9%)を示し、BLM処理細胞では老化としてスコアを付ける細胞の割合も高かった(80%)。この効果は、一晩保存した固定サンプル(図6C;未処理、12%およびBLM、72%)および4°Cで1週間保存した固定サンプル(図6D;14%および70%)でも見られました。PFA固定による蛍光のわずかな増加にもかかわらず、BLMによる老化の誘発は、すべての固定サンプルと一致した未処理サンプルで依然として明らかでした。さらに、細胞は7日目までにわずかな劣化のみで保存中に無傷のままであり、問題のある凝集は観察されませんでした。後のバッチ分析のために細胞サンプルを固定および保存できるという便利さは、特に多くのサンプルまたは時点での実験において、PFA固定によって引き起こされるわずかに高いバックグラウンドを許容することを正当化すると結論付けています。
細胞ベースの老化研究における一般的な課題は、細胞集団における老化の不均一な発症です。ここでは、DDAOGが生細胞老化細胞のFACSに使用でき、収集された細胞が下流の in vitro アッセイの培養で生き残ることを示します(図7)。FACSで細胞を選別するには、記載されているように細胞を処理および染色し、ここに示すDDAOG対AFゲーティング戦略を使用してFACS対応フローサイトメーターで選別します(図7A)。生存率プローブは長期的な毒性の懸念があるためここでは使用しないため、収集された細胞から偽陽性の破片を排除するために、最終的な老化細胞ゲーティングの前に厳密な散乱ゲーティングを実行することをお勧めします(補足図S3)。これらは標準的なFACSゲーティング手順であり、経験が中程度のユーザーにも馴染みがあり、機器のソフトウェアを使用して迅速に確立できます(<10分)。
BLM処理A549細胞のサンプルをソーティングした後、細胞を標準的なマルチウェルディッシュで10×103 細胞/cm2で5日間(n = 6反復)培養に戻しました。未選別のコントロールを同じ密度で播種し、一緒に増殖させ、未処理およびBLM処理した細胞を含めました。細胞は毎日観察されました。選別された細胞については、有意な細胞死または増殖への復帰は観察されなかった。選別された細胞は、培養中の5日間にわたってまばらなまま(すなわち、増殖しない)ままであったが、未処理およびBLM処理された細胞は、図に示すようにコンフルエントになった。5日目に、細胞をPFAで固定し、形態および増殖マーカーについて染色した(図7B)。糸状アクチンの蛍光ファロイジン染色により選別細胞の特徴的な拡大形態を明らかにし,DAPI染色により核の拡大を示した。選別された細胞は直径が非常に大きく(>10μm)、特徴的な丸みを帯びた外観であった。予想通り、Ki67抗体染色は、選別されていないBLM処理サンプルの部分的な損失と比較して、選別されたサンプルの増殖マーカーの完全な喪失を明らかにし、未処理-未選別のサンプルの多くの細胞でKi67の正常レベルが見られました。サンプル間で均一なイメージング設定を使用して、ウェルごとに少なくとも3つの画像を撮影しました。代表的な画像を示す(図7B)。
最後に、化学療法薬で治療されたマウスで確立された腫瘍に発生する老化細胞をDDAOGを使用して特定できるかどうかを評価しました。B16-F10メラノーマ腫瘍をC57/BL6マウスの脇腹に誘導し、生理食塩水のみ(図8A)、DOX(図8B)、またはPLD(図8C)で3回(5日ごと)治療しました。3回目の処置の後、マウスは老化の開始を可能にするために7日間回復し、次いで屠殺されそして腫瘍を切除した。腫瘍を半分にし、半分をX-Gal染色用の凍結組織スライドの調製に使用し(図8)、半分をシングルセル懸濁液に解離してDDAOGで染色しました(図8および補足図S4)。組織におけるX-Gal染色は、染色期間が長い(72時間)にもかかわらずかなり弱かったが、綿密な検査によりDOXおよびPLD腫瘍、特にDDAOGフローアッセイによって老化のスコアが陽性であった腫瘍では青色染色が明らかであった(図8B、C)。組織スライドごとに少なくとも3つの画像が撮影され、代表的な画像が示されています。
X-Galと比較して、DDAOGは腫瘍の老化を定量化するためのより感度が高く正確な方法でした(図8)。DDADOG腫瘍分析では、蛍光バックグラウンドが最も高い生理食塩水処理腫瘍を使用して老化ゲートを<5%に設定し、他の生理食塩水処理腫瘍が5%老化を超えないようにしました。次に、この老化ゲートを、すべての腫瘍からのゲートされた生細胞にバッチ適用しました。両方の化学療法剤は、いくつかの腫瘍(DOXの5つの腫瘍のうち2つ、PLDの5つの腫瘍のうち3つ)で老化を誘発し、老化した腫瘍細胞の割合は腫瘍ごとに3%から36%まで変化しました。15腫瘍すべてのサイトメトリーデータプロットを 補足図S4に示し、腫瘍サイトメトリーデータの概要を 図8D に示す(n = 5;(*)p<0.05対生理食塩水のみの対照群をF分散検定による)。DDAOGとAFフローサイトメトリーの比較は、 in vivoでの老化誘発のための腫瘍および化学療法剤をスクリーニングするための許容可能な方法であると結論付けています。
図2:DDADOGはSA-β-Galの高感度かつ特異的な染色である 。 (A)X-Galを用いたSA-β-Galの従来の染色は、未処理(左)またはETO処理(右)のB16-F10マウスメラノーマ細胞を示す。ETOによって誘発される老化:細胞は、SA-β-Galの上昇によるX-Galの切断により、形態の拡大と青色染色を示します。スケールバー = 10 μm。 (B)C12-FDG(515 nm発光、緑)またはDDAOG(660 nm、赤)のいずれかを使用したETO処理細胞におけるSA-β-Galの蛍光染色。染色分布は両方のプローブで類似しており、DDAOGがC12-FDGと同様の方法でSA-β-Galを検出することを示しています。(C)緑色(525 nm発光、左)または遠赤色(660 nm、右)発光チャネルのいずれかで、染色されていないETO処理細胞におけるAFの評価。リポフスチンからのAFは、緑色発光チャネルで高く、遠赤色チャネルでは無視できる。露光時間 = 各画像で2,000ミリ秒。スケールバー= 10 μm。この図は、フロールとクロン23から転載されています。略語:DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;X-Gal = 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド;UNT =未処理;ETO =エトポシド;AF =自家蛍光;C12-FDG = 5-ドデカノイルアミノフルオレセインジβ-D-ガラクトピラノシド;SA-β-Gal =老化関連β-ガラクトシダーゼ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:フローサイトメーターデータ取得のセットアップ。 (A)細胞の代表的な散布図分布。FSC-Aは細胞体積の読み出しであり、SSC-Aは細胞の粒度を示します。左パネル、A549細胞のビヒクルのみの処理。右パネル、老化を誘発するETO治療。顕微鏡検査から明らかな拡大形態と一致して、ETO処理細胞の細胞体積が拡大する傾向に注意してください。(B)サイトメーターの検出器電圧を設定するための5ピークの市販の「レインボー」蛍光校正ミクロスフェアのオプションの使用。使用する各蛍光チャンネルにおいて、サンプルの実行中にサイトメーター検出器電圧を調整することにより、最大ピークを蛍光単位に対して≤1 x 105に設定する必要があります。左パネル、BV421(バイオレット)チャンネル。中央、FITC(緑)チャネル。右、APC(赤)チャンネル。5つの蛍光ピークは、図に示すように明確な間隔を示すはずです。(C-E)紫色CV450色素を用いた(C)生存率染色のための代表的な単一チャンネル蛍光データ;(d)細胞の緑色自家蛍光;(E)DDAOGからの遠赤色信号、SA-β-Galを検出する。より暗い色のヒストグラム、車両のみの処理。明るい色のヒストグラム、ETO処理。親ゲートは各プロットの上に示されています。略語:FSC-A =前方散乱ピーク面積;SSC-A = 側方散乱ピーク面積;ETO =エトポシド;BV421-A = ブリリアントバイオレット421チャンネルピーク面積;FITC-A = フルオレセインイソチオシアネートチャネルピーク面積;APC-A =アロフィコシアニンチャネルピーク面積;AF =自家蛍光;DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;VEH = 車両。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:フローサイトメトリー老化アッセイの代表的なデータ 。 (A)B16-F10マウスメラノーマ細胞を(左上)ビヒクルのみ、(右上)ETO、(左下)ABT-263(1μM)のみ、または(右下)ETOとABT-263で処理した。(B)(左上)ビヒクルのみで処理したA549ヒト肺腺癌細胞、(右上)BLM、(左下)ABT-263のみ、または(右下)BLMとABT-263を加えたもの。(A,B)すべてのプロットの右上の象限にある長方形のゲートは、老化細胞(DDAOGHI AF HI)を定義します。老化細胞の割合(サンプルあたりの総生細胞数)が各プロットに示されています。略語:DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;ETO =エトポシド;BLM = ブレオマイシン;VEH = 車両;TIS=治療誘発老化。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:老化アッセイによる一例の細胞表面マーカーの共染色。 (a)生存可能なB16-F10培養細胞の表面における老化マーカーDPP4の免疫検出;ダークオレンジ、車両のみ。ライトオレンジ、ETO。(B,C)中央および右パネル:DDAOGおよび抗DPP4:PEで共染色された細胞。DDAOGHI DPP4HI 細胞は、プロットに示されている長方形のゲート内に含まれており、サンプルあたりのダブルポジティブ細胞の割合が示されています。表示:生細胞ゲーティング細胞。略語:DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;ETO =エトポシド;VEH = 車両;DPP4 = ジペプチジルペプチダーゼ 4. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:後で分析するためのDDAOG染色細胞サンプルの染色後の固定と保存。 (A)コントロール、未処理(左)またはBLMで処理(右)のいずれかで老化を誘発し、その後染色し、DDAOGプロトコルを使用して直ちに分析した生A549細胞の未固定サンプル(固定なし、0日目)。(b)(A)のように調製したサンプルを直ちに4%パラホルムアルデヒドで固定し、分析した(0日目)。(c)(A)のように調製したサンプルを、直ちに4%パラホルムアルデヒドで固定し、分析前に4°Cで一晩保存した。(D)(A)のように調製したサンプルを直ちに固定し、分析前に7日間保存した。すべてのプロットの右上の象限にある長方形のゲートは、老化細胞(DDAOGHI AF HI)を定義します。老化細胞の割合は各プロットに示されています。略語:TIS =治療誘発老化;DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;BLM = ブレオマイシン;AF =自家蛍光。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:フローサイトメトリーソーティングと濃縮老化細胞集団の検証 。 (A)老化細胞ソーティングのゲートを設定するために使用した未処理のDDADOG染色コントロール(ゲート領域の<5%老化細胞)を示すフローサイトメトリーソーティングデータ、および(右)示されているようにソートゲートを使用してソーティングされたBLM処理されたDDADOG染色サンプル。(B)ファロイジン-Alexa Fluor 647(オレンジ色の擬似色)で染色された細胞(左列)でF-アクチンを検出し、DAPI(青)で染色して核を対比染色し、老化細胞の形態拡大を示す蛍光顕微鏡画像、または(右列)老化細胞の増殖喪失を検出するためのウサギKi67抗体および抗ウサギAlexa Fluor 594で染色された細胞。一番上の行、未処理および未分類のセル。中央の列、BLM処理された細胞、および未分類の細胞。下段、BLM処理および選別された細胞。スケールバー= 10 μm。略語:TIS =治療誘発老化;DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;BLM = ブレオマイシン;UNT =未処理;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:化学療法薬で治療されたマウスからの腫瘍の老化の定量化。 B16-F10黒色腫腫瘍はC67BL/6マウスの脇腹に樹立され、その後、老化の発症を可能にするために、5日プラス1週間ごとに(A)生理食塩水、(B)DOX、または(C)PLDの3回投与で治療されました。腫瘍を切除し、半分にした。凍結組織スライドは、X-Gal染色用に半分から調製し(上段)、残りの半分をDDAOG染色用に解離させた(下段)。X-Gal染色画像では、青色の細胞はSA-β-Gal HI 老化細胞であり、茶色の領域は腫瘍のメラニンによるものです。老化を示した群当たり2つの腫瘍からのDOXおよびPLDについての代表的な結果が示されている。すべての生理食塩水のみの腫瘍はごくわずかな老化を示した。(D)マウスからの薬物治療腫瘍における老化の定量化。(*)p
補足図S1:DDAOGプローブの化学構造。 DDAOGは、7-ヒドロキシ-9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン)とベータガラクトシドとのコンジュゲートです。β-ガラクトシダーゼによって切断されると、加水分解された切断産物は50 nmの遠赤色蛍光発光シフトを示し、600 nmを超える励起で特異的検出を可能にします。略語:DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:フローサイトメーターの他の蛍光チャネルとのDDAOGクロストークのスペクトルスキャン。 蛍光抗体の検出に利用可能なチャネルを特定するために、BLMで処理し、DDAOG(赤)または非染色(黒)で染色したA549細胞を使用して、4レーザー、15チャンネルのフローサイトメーターでスペクトルスキャンを実行しました。フローサイトメーターのすべてのチャンネルのデータは、10,000個の細胞について取得されました。(A)405nmレーザーの発光チャネル:左から右へ、BV421、BV510、BV605、BV660、およびBV711。BV605、BV660、およびBV711チャネルで観察されるクロストークは、補償なしでDDAOGとの共染色には適していません。BV421およびBV510は共染色に適しています(BV421は通常、生存率染色に使用されることに注意してください)。(B)488nmレーザーの発光チャネル:FITCおよびPerCP-Cy5。PerCP-Cy5チャネルでは高いクロストークが観察された。FITCは共染色に適しています。ただし、FITCチャネルは通常、グリーンエミッションAFの評価のためのDDAOGアッセイで使用されることに注意してください。(C)561 nmレーザーの発光チャネル:PE、PE-Dazzle 594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、およびPE-Cy7。PEおよびPE-Dazzle 594チャンネルは、これらの蛍光色素で標識された抗体の検出に適しています(PEは本試験でDPP4の検出に実証されています)。(D)640nmレーザーの発光チャネル:APC、APC-H700、およびAPC-Cy7。老化細胞のDDAOGシグナルは、APCチャネル(47.8%老化)で可視である。シグナルはAPC-H700およびAPC-Cy7チャンネルにオーバーラップするため、大きなスペクトル補償がなければ共染色には適していません。略語:BLM =ブレオマイシン;BV =ブリリアントバイオレット;FITC=フルオレセインイソチオシアネート;PerCP =ペリジニン - クロロフィルタンパク質;PE =フィコエリスリン;DZ594 = ダズル594;APC =アロフィオシアニン;AF =自家蛍光;DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:老化細胞のFACS選別のための細胞ゲーティング戦略。 細胞の懸濁液を高感度のFACSサイトメーターに通すには、選別の純度と最適な機器機能を確保するために追加のゲーティングが必要になる場合があります。戦略の例を以下に示します。他の戦略は、使用されているFACSサイトメーターに関するメーカーの推奨事項に応じて可能です。左列、ビヒクルのみの処理細胞コントロール。右列は、老化を誘導するためにBLMで処理したA549細胞を選別する。(A)無傷細胞のFSC-A(細胞体積)対SSC-A(細胞粒度)ゲーティング。インタクトゲートは、選別されたサンプルから細胞破片を除去します。(B)FSC-A対FSC-H純度ゲーティング;ダブレットや破片を取り除きます。(C)SSC-A対SSC-H純度ゲーティング;ダブレットや破片を取り除きます。(D)APC-Aチャネル(637 nm励起、670 nm±30 nm発光、DDAOGに使用)とFITC-Aチャネル(488 nm励起、530 nm±30 nm発光、AFに使用)を使用した関心のある集団のゲーティング。汚れのアーチファクトの可能性を取り除きます。(E)最終選別のための老化細胞ゲーティング。略語:FACS =蛍光活性化細胞選別;BLM = ブレオマイシン;FSC-A = 前方散乱ピーク面積;SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FSC-H = 前方散乱ピークの高さ;SSC-H = 側方散乱ピークの高さ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S4:腫瘍のDDAOG老化フローサイトメトリー染色。 ≥50,000個の生細胞に関するフローサイトメトリーデータ。老化細胞ゲート、各プロットの右上象限。老化した(生存可能な)腫瘍細胞の割合がゲート内に示される。腫瘍治療には、(A)生理食塩水のみが含まれていました。(B)ドックス;(C)PLD。マウスを3回、5日に1回、屠殺前の老化の開始を可能にするために7日間回復させた。条件ごとに5つの腫瘍を分析した。略語:AF =自家蛍光;DDAO = 9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン);DDAOG = DDAO-ガラクトシド;DOX =ドキソルビシン;PLD =ペグ化リポソームドキソルビシン。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
過去10年ほどで、フローサイトメトリーは、腫瘍免疫学の人気の高まり、低コストのフローサイトメーターの開発、および学術機関での共有機器施設の改善により、癌研究においてより一般的なアッセイプラットフォームになりました。マルチカラーアッセイは現在標準であり、ほとんどの新しい機器には紫、青緑、赤から遠赤色の光学アレイが装備されています。したがって、このDDAOGプロトコルは、幅広いフローサイトメーターと互換性がある可能性があります。もちろん、どのフローサイトメーターもユーザーが評価する必要があります。蛍光色素(蛍光、コンジュゲート抗体など)をDDAOGアッセイに追加する場合は、特に注意が必要です。チャンネル間の蛍光色素クロストークの評価は、他のすべての関連チャンネルで可視化された単一染色コントロールを使用して実施する必要があります。オーバーラップが観察される場合、スペクトル補償は、典型的な方法に従って補正のために20 行うことができる。
ここに示されている知見は、DDAOGフローサイトメトリーアッセイが、細胞または腫瘍における化学療法薬によって誘発されるTISについて、迅速で定量的で解釈しやすい結果を生成できることを主に実証することを目的としています。ETO 23、24、DOX7、25、およびBLM26、27を含むここで使用される薬剤は、様々な癌細胞株においてTISを誘導することが文書化されている24。DDAOGプローブの特異性を実証するために、既知の老化細胞除去剤ABT-26321が培養中の老化細胞を選択的に排除することを実証した。この論文は、マウス(B16-F10)とヒト(A549)の培養がん細胞株1株、およびマウスで確立されたB16-F10腫瘍の使用を示しています。ただし、β-Galを発現し、標準的なフローサイトメトリーサンプル調製によって生存率を保持する任意の細胞を使用できます。特定の細胞型は、より脆弱であるか、TISになりにくい場合があり、これは大画面または研究に着手する前に評価する必要があります。細胞が調製中に崩壊する場合、生存率が悪い場合、またはTISがポジティブエージェントコントロールを使用した場合の予想よりもはるかに低い場合、細胞型は老化の研究に理想的なモデルではない可能性があります。ここに示す薬剤および細胞株は、潜在的なTIS誘導剤または新規老化細胞除去薬のさらなるスクリーニングにおける対照として他のグループによって使用することができ、これはこの分野での積極的な目標であり続けている。
化学療法薬によって誘発される毒性は細胞の種類によって異なり、アッセイ結果に影響を与える可能性があります。使用される薬剤および/または濃度の主な観察効果が急性細胞死である場合、全体的な老化は最小限である可能性があります。. インビボでは、動物における高い腫瘍壊死または全身毒性は、薬剤投与量を低下させることによって回避されるべきである。アッセイの成功の鍵は、生存率アッセイデータ(DDAOGアッセイ内のCV450によって提供されるものなど)を注意深く検査しながら、さまざまな薬剤濃度をテストすることです。 in vitroでは、分析サンプル中の培養液を含め、処理中に多くの死細胞がプレートから剥離する場合、全体として細胞死を評価することが重要です。CV450は、このアッセイに適合する唯一の生存率染色剤ではありません。他の紫色/青色発光蛍光色素を用いてもよい。固定可能な生存率プローブは、プローブの蛍光がDDAOGまたはAFと有意に重複しない場合(またはユーザーがスペクトル補正を行って重複を補正する場合)、ユーザーが染色されたサンプルをPFAで固定することを計画している場合にも使用できます。薬剤の毒性が低く、細胞が堅牢である場合、光散乱(FSC対SSC)による無傷の細胞をゲーティングするだけで、分析のために「生存可能な」細胞を分離することができます。
このin vitroプロトコルの重要なステップは、細胞をより低い範囲の対数増殖密度(典型的には2 × 10 3-5× 103細胞/cm2)で播種して、ほとんどの細胞による化学療法薬の取り込みを促進する迅速な初期増殖を可能にすることです。一度治療されると、TISの発症のための時間を与えることも重要です:インビトロで、薬物の存在下で4日±1日; in vivoでは、最終化学療法治療後の7日間の回復。記載されたようにDDAOGで染色した後、サイトメトリーデータの定量的分析を図示するように実行する必要があります、すなわち、各サンプル中のDDAOG対AF細胞をゲーティングして、老化細胞の割合(全生存可能)を決定する必要があります。オプションのステップには、フローサイトメトリーを標準化するための蛍光「レインボー」キャリブレーションミクロスフェアの使用、染色サンプルのPFA固定、表面マーカーの共免疫染色、およびダウンストリームアッセイ用の老化細胞を濃縮するためのフローソーティングが含まれます。ただし、これらのオプションの各ステップは、特定のアプリケーションで重要な利点を提供します。キャリブレーションミクロスフェアは、複数のセッションにわたってサイトメトリーのセットアップを標準化し、ユーザーは老化および生存率の検出に有用な範囲の電圧を最初に設定し、その後は最小限の調整を行うことができます。サンプルのPFA固定は細胞を安定化させ、後で大量の細胞セットのバッチ分析を可能にします。表面マーカーの共免疫染色は、新規老化関連タンパク質および免疫相互作用のスクリーニングに使用できます。今後の研究では、細胞内老化マーカーとDDAOGの共染色を検証する予定です。
FACSによるTIS細胞のソーティングにより、不均一な集団から生存可能なTIS細胞を濃縮することができ、ウェスタンブロッティング、プロテオミクス、トランスクリプトミクスなどのダウンストリームアッセイの読み出しを混乱させる可能性があります。選別後、最大5日間培養に戻したTIS細胞では、DDAOGの有意な毒性は観察されませんでした。ただし、選別された細胞はBafで処理され、DDAOG(SA-β-Galによってアクリジン色素であるDDAOに切断される)を内在化し、FACS装置を通過する機械的ストレスにさらされていることを考慮する必要があります。したがって、老化に関連しない特定の生物学的変化が選別された細胞に存在する可能性がある。しかし、この研究では、選別された細胞は老化の強い特徴を保持し、選別されていない対照と比較した場合、特徴的なプロテオミクスおよびトランスクリプトミクスの結果を提供しました28。腫瘍から老化細胞を収集および分析するためにFACSを使用することのやや明白な有用性にもかかわらず、この手順は文献ではほとんど使用されていません。一部のグループは、マウス組織の老化細胞を特定するためにp16Ink4aルシフェラーゼまたは蛍光レポーターを使用しており、一部の研究では蛍光レポーターがFACSソーティングを可能にしています29,30。調査結果は一般に、誘導剤または腫瘍の種類に関係なく、腫瘍におけるTISは部分的またはまれな発生であり、腫瘍細胞の100%に達することはめったにないことに同意する31。DDAOG法を用いた細胞のFACSソーティングは、トランスジェニックコンストラクトを発現させることなく、腫瘍から希少TIS細胞を容易に収集することができます。
現在、マウスモデルにおけるほとんどの老化研究は、X−Galおよび免疫組織化学マーカーの組み合わせを用いてex vivoで行われている32,33。しかし、腫瘍組織を使用したex vivoでのTISの評価は、特にX-Galを使用する場合、時間のかかるプロセスになる可能性があります。この手順では、腫瘍の凍結保存、スライドへの凍結切片、X-Gal染色、カバーガラスの取り付け、乾燥、イメージング、および「青色」細胞のスコアリングが必要です。免疫組織化学はそれほど速くも簡単でもなく、マルチプレックス分析を最適化しない限り、各マーカーと各腫瘍のX-Galに対して異なる組織切片を使用してスコアリングする必要があり、プロセスのフロントエンドで時間が長くなります。組織切片は腫瘍の1つの薄い断面のみをサンプリングするが、老化細胞は(多くの細胞型と同様に)腫瘍29全体に3D空間に不均一に分布し得る。この分野では、遅くて時代遅れの組織学的方法から、腫瘍のより迅速で容易に定量可能な老化アッセイに移行することが緊急に必要とされています。DDAOGフローサイトメトリーを使用すると、15個の腫瘍のセットを解離および染色して、腫瘍採取後1日未満のハンズオン時間で決定的で定量的な老化データを取得することができました。腫瘍の半分を各サンプルについて処理し、腫瘍当たりの3D空間のサンプリングを改善した。このDDAOGフローサイトメトリーアプローチは、腫瘍のTISを評価するための組織スライドベースの方法よりも大幅に高速で信頼性があります。
X-Galや他の方法に比べて多くの利点があるため、DDAOGプロトコルが新しいゴールドスタンダードの老化アッセイになることを提唱しています。従来認められている老化マーカーであるSA-β-Galと、加齢に伴うAFのラベルフリー検出の両方を2番目のマーカーとして使用します。これらの蛍光色素は、ほとんどの標準的なフローサイトメーターと互換性があります。アッセイには、薬物処理された培養細胞株または腫瘍から容易に得られたサンプルを使用して、死細胞および破片を排除するための生存率染色が含まれます。生細胞サンプルは、大規模な研究のバッチ分析を容易にするために、オプションで溶媒固定または凍結保存することができ、例えば、複数の薬剤を使用して経時的にTISの発症を評価するために時点を使用して染色プロセスを完了するのに半日未満のラボ作業が必要であり、データ取得は通常、サンプルあたり<5分である。データ解析も同様に迅速かつ簡単で、面倒なセルスコアリングやカウントなしで、サンプルあたりのTIS細胞の割合に関する定量データを生成します。サンプルをFACSソーティングしてTIS細胞の濃縮集団を回収できるため、ダウンストリーム分析における細胞の不均一性によるノイズを低減できます。DDADOGアッセイは、多くの場合、X-Galに取って代わり、TIS誘導剤および老化細胞除去剤のインビ トロ およびイン ビボでのスクリーニングを容易にし、老化研究の分野でより迅速で信頼性の高い発見につながると考えています。
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Disclosures
著者らは、この研究のために宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
シカゴ大学のサイトメトリーおよび抗体コアファシリティには、フローサイトメトリー機器のサポートに感謝します。シカゴ大学の動物研究センターは動物の住居を提供しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bafilomycin A1 | Research Products International | B40500 | |
| Bleomycin sulfate | Cayman | 13877 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A1380 | |
| Calcein Violet 450 AM viability dye | ThermoFisher Scientific | 65-0854-39 | eBioscience |
| DPP4 antibody, PE conjugate | Biolegend | 137803 | Clone H194-112 |
| Cell line: A549 human lung adenocarcinoma | American Type Culture Collection | CCL-185 | |
| Cell line: B16-F10 mouse melanoma | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| Cell scraper | Corning | 3008 | |
| Cell strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | |
| DDAO-Galactoside | Life Technologies | D6488 | |
| DMEM medium 1x | Life Technologies | 11960-069 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| DNAse I | Sigma | DN25 | |
| Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) | Pfizer | NDC 0069-3032-20 | |
| Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) | Sun Pharmaceutical | NDC 47335-049-40 | |
| EDTA 0.5 M | Life Technologies | 15575-038 | |
| Etoposide | Cayman | 12092 | |
| FBS | Omega | FB-11 | |
| Fc receptor blocking reagent | Biolegend | 101320 | Anti-mouse CD16/32 |
| Flow cytometer (cell analyzer) | Becton Dickinson (BD) | Various | LSRFortessa |
| Flow cytometer (cell sorter) | Becton Dickinson (BD) | Various | FACSAria |
| GlutaMax 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES 1 M | Lonza | BW17737 | |
| Liberase TL | Sigma | 5401020001 | Roche |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Life Technologies | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Corning | MT21031CV | Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium) |
| Rainbow calibration particles, ultra kit | SpheroTech | UCRP-38-2K | 3.5-3.9 µm, 2E6/mL |
| RPMI-1640 medium 1x | Life Technologies | 11875-119 | |
| Sodium chloride 0.9% (USP) | Baxter Healthcare Corporation | 2B1324 | |
| Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" | Becton Dickinson (BD) | n/a | Contact BD for license |
| Software for cytometer data analysis, "FlowJo" | TreeStar | n/a | Contact TreeStar for license |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-114 |
References
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