Netzhautexplantate von Wildtyp-Makaken wurden in vitro kultiviert. Die Netzhautdegeneration und der cGMP-PKG-Signalweg wurden mit dem PDE6-Inhibitor Zaprinast induziert. Die cGMP-Akkumulation in den Explantaten bei unterschiedlichen Zapinast-Konzentrationen wurde mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Organotypische retinale Explantatkulturen von Makakenaffen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die erbliche Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet. Eine Überaktivierung des zyklischen Guanosinmonophosphat (cGMP)-abhängigen Proteinkinase-Signalwegs (PKG) in Photorezeptorzellen führt zum Tod von Photorezeptorzellen, insbesondere in Modellen mit Phosphodiesterase 6b (PDE6b)-Mutationen. Frühere Studien zu RD haben hauptsächlich Mausmodelle wie rd1 - oder rd10-Mäuse verwendet. Angesichts der genetischen und physiologischen Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen ist es wichtig zu verstehen, inwieweit die Netzhaut von Primaten und Nagetieren vergleichbar ist. Makaken haben eine hohe genetische Ähnlichkeit mit dem Menschen. Daher wurden Wildtyp-Makaken (im Alter von 1-3 Jahren) für die In-vitro-Kultur von Netzhautexplantaten ausgewählt, die den Retina-Retinal-Pigmentepithel (RPE)-Aderhaut-Komplex enthielten. Diese Explantaten wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast behandelt, um den cGMP-PKG-Signalweg zu induzieren und die RD-Pathogenese zu simulieren. Die cGMP-Akkumulation und der Zelltod in Netzhautexplantaten von Primaten wurden anschließend mit Hilfe von Immunfluoreszenz und dem TUNEL-Assay verifiziert. Das in dieser Studie etablierte Primaten-Netzhautmodell kann für relevante und effektive Studien zu den Mechanismen der cGMP-PKG-abhängigen RD sowie für die Entwicklung zukünftiger Behandlungsansätze dienen.
Einleitung
Die hereditäre Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet und wird durch Mutationen in einer Vielzahl von pathogenen Genen verursacht1. Das Endergebnis von RD ist der Verlust des Sehvermögens, und in den allermeisten Fällen ist die Krankheit bis heute nicht behandelbar. Daher ist es wichtig, die zellulären Mechanismen, die zum Absterben von Photorezeptoren führen, mit Modellen zu untersuchen, die den menschlichen Krankheitszustand originalgetreu abbilden. Hier sind primatenbasierte Modelle aufgrund ihrer Nähe zum Menschen von besonderem Interesse. Insbesondere könn....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Die Tierstudie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Zoologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (IACUC-PE-2022-06-002) und der Tierethikprüfung und dem Tierprotokoll der Universität Yunnan (YNU20220149) geprüft und genehmigt.
1. Herstellung von Netzhautexplantaten
- Die Augäpfel von Primaten werden von Wildtyp-Makaken im Alter von 1 bis 3 Jahren gewonnen, in einer Gewebeaufbewahrungslösung gelagert und innerhalb von 3 Stunden nach der Enukleation nach der Tötung der Affen oder nach dem natürlichen Tod auf Eis transportiert.
- Für die Herstellung der Proteinase-K-Lösung werden 25 mg Prote....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
In dieser Studie wurde die Netzhautexplantatkultur von Makakenaffen mit Explantaten durchgeführt, die den Retina-RPE-Aderhautkomplex enthielten (Abbildung 1, ergänzende Abbildung S1). Im Vergleich zur In-vitro-Kultur von Netzhautzellen unter Verwendung der Netzhaut ohne das angehängte RPE und die Aderhaut ermöglicht unsere Explantatkultur ein besseres Überleben der Zellen und verlängert dementsprechend das Überleben der Photorezeptorzellen.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Visuelle Phototransduktion bezieht sich auf den biologischen Prozess, bei dem Lichtsignale von Photorezeptorzellen in der Netzhaut des Auges in elektrische Signale umgewandelt werden. Photorezeptorzellen sind polarisierte Neuronen, die zur Phototransduktion fähig sind, und es gibt zwei verschiedene Arten von Photorezeptoren, die nach der Form ihrer äußeren Segmente als Stäbchen und Zapfen bezeichnet werden. Stäbchen sind für das skotopische Sehen verantwortlich und Zapfen sind für das photopische und hochscharfe Sehen ve.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Alle Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Danksagungen
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81960180), der Zinke Heritage Foundation und der Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01) unterstützt. Wir danken Prof. Longbao Lv (Institut für Zoologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Kunming, China) für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Affenaugäpfel.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blockierungslösung |
| Corticosteron | Sigma | C2505 | Ergänzungen des vollständigen Mediums |
| DL-Tocopherol | Sigma | T1539 | Ergänzungen des vollständigen Mediums |
| Esel gegen Schafe, Alxea Fluor 488 | Life Technologies Corporation | A11015 | Sekundärantikörper von cGMP |
| Ethanol-Essigsäure-Lösung | Shyuanye | R20492 | Fixierflüssigkeit |
| Fötales Kälberserum | Gemini | 900-108 | Blockierungslösung |
| Fluoreszenzmikroskop | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunfluoreszenz-Bildgebung |
| Glutamin | Sigma | G8540 | Ergänzungen des vollständigen |
| Mediums Glutathion | Sigma | G6013 | Ergänzungen des Complete |
| Medium In Situ Cell Death Detection Kit, TMR rot | Roche | 12156792910 | TUNEL Assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Ergänzungen des Complete Mediums |
| L-Cystein HCl | Sigma | C7477 | Supplements des Complete Mediums |
| Linolsäure | Sigma | L1012 | Supplements des Complete Mediums |
| MACS Tissue Storage Lösung | Miltenyi | 130-100-008 | Optimierte Lagerung von frischen Organ- und Gewebeproben |
| Normales Eselserum | Solarbio | SL050 | Blockierungslösung |
| Paraformaldehyd (PFA) | Biosharp | BL539A | Fixiermittel |
| PEN. / STREP. 100 mal; | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin Antibiotika |
| Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) | Solarbio | P1010 | Pufferlösung |
| Povidon-Jod | Shanghailikang | 310411 | Desinfektionsmittel |
| Progesteron | Sigma | P8783 | Ergänzungen des vollständigen Mediums |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Protein abbauen |
| R16 Medium | Life Technologies Corporation | 074-90743A | Basismedium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Nahrungsergänzungsmittel aus Complete |
| Medium Retinylacetat | Sigma | R7882 | Supplements of Complete |
| Medium Schaf Anti-cGMP | Jan de Vente, Universität Maastricht, Niederlande | Primärer Antikörper von cGMP | |
| Saccharose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydratisierungsmittel |
| T3 | Sigma | T6397 | Ergänzungen des vollständigen |
| Mediums Tissue-Tek Medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Einbettmedium |
| Tocopherylacetat | Sigma | T1157 | Ergänzungen des vollständigen Mediums |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Ergänzungen des vollständigen Mediums |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Zell- / Gewebekultur |
| Tris-Puffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blockierungspuffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Oberflächenaktiver |
| Wirkstoff VECTASHIELD Medium mit DAPI | Vektor | H-1200 | Eindeckmedium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Ergänzungen des Komplettmediums |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Ergänzungen des vollständigen Mediums |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Ergänzungen des vollständigen Mediums |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6-Inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Mikroskop | Zeiss, Oberkochen,Deutschland | aufrechtes Mikroskop | |
| LSM 900 Airyscan | hochauflösendes Laserscanning-Mikroskop | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Deutschland | Digitalkamera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primaten-Augäpfel von Wildtyp-Makaken | KUNMING INSTITUT FÜR ZOOLOGIE | SYXK ( ) K2017 -0008 | |
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL Kit-Lösung (REF12156792910, Roche, Deutschland), |
Referenzen
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772(2020).
- Paquet-Durand, F.,....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
