Summary
古典的には、マウス胚性弁原基の心内膜は、横切片、冠状切片、または矢状切片を用いて分析されてきた。弁形成領域の心内膜の 顔面2次元イメージングのための私たちの新しいアプローチは、弁発生中の心内膜の平面極性と細胞再配列分析を可能にします。
Abstract
哺乳類の心臓の発達の根底にある細胞および分子メカニズムの研究は、ヒトの先天性心疾患に対処するために不可欠です。原始心臓弁の発達には、局所誘導性心筋および心内膜信号に応答して、心臓の房室管(AVC)および流出路(OFT)領域からの心内膜細胞の上皮から間葉への移行(EMT)が含まれます。細胞が層間剥離し、心内膜と心筋の間に位置する細胞外マトリックス(心臓ゼリー)に浸潤すると、原始心内膜クッション(EC)が形成される。このプロセスは、心内膜が剥離された細胞によって残されたギャップを埋めなければならず、軸に沿って収束(狭く)または伸長(延長)するためにそれ自体を再編成しなければならないことを意味する。現在の研究では、このプロセスに関与する因子の細胞内局在の調節に平面細胞極性(PCP)経路が関与しています。古典的には、心臓弁発生の初期段階は、胚性心臓の断面またはコラーゲンゲル上で培養された ex vivoAVC またはOFT外植片で研究されてきました。これらのアプローチは、アピコ基底極性の分析を可能にするが、上皮の平面内の細胞挙動または移動する細胞の形態学的変化の分析は可能ではない。ここでは、弁形成領域の心内膜を細胞の平面場として可視化できる実験的手法を示す。この実験的アプローチは、弁の発達中のOFTおよびAVCの心内膜内のPCP、平面トポロジー、および細胞間コミュニケーションを研究する機会を提供します。心臓弁の形態形成に関与する新しい細胞メカニズムの解読は、心内膜クッションの欠陥に関連する先天性心疾患の理解に貢献する可能性があります。
Introduction
心臓は哺乳類の胚の最初の機能的な器官です。マウスの胚期(E)7.5日目頃、両側前心臓中胚葉細胞は腹側1に心臓三日月を形成する。心臓三日月には、心筋と心内膜2の前駆細胞を含む前心臓細胞の2つの集団が含まれています。E8.0付近では、心臓前駆体が正中線で融合し、外側心筋と、心臓ゼリーと呼ばれる細胞外マトリックスによって分離された特殊な内皮である内心内膜の2つの上皮組織からなる原始的な心臓管を形成します。その後、E8.5で、心臓管は右向きにループします。ループ心臓には、流出路(OFT)、心室、房室管(AVC)など、特定の分子シグネチャを持つさまざまな解剖学的領域があります3。最初は細胞4の添加により心臓管はその流入側で拡張するが、E9.5では集中的な心臓増殖により、心腔のバルーニングと小柱網5の確立が生じる。弁形成は、AVC(将来の僧帽弁および三尖弁)およびOFT(将来の大動脈弁および肺弁)で行われます。
心内膜は弁の発達に重要な役割を果たします。心内膜細胞は、AVCおよびOFTで上皮間葉転換(EMT)を受けて、弁の発達の開始時に現れる構造である心内膜クッションを形成します。異なるシグナル伝達経路がこのプロセスを活性化します。マウスのE9.5では、心筋由来BMP2に応答して心内膜で活性化されたNOTCHは、TGFβ2およびSNAI(SNAI1)の活性化を介してAVCおよびOFT領域の心内膜細胞の侵襲性EMTを促進し、接着接合部(AJ)の膜貫通成分である血管内皮カドヘリン(VE-カドヘリン)の発現を直接抑制します6,7,8。.OFTでは、EMTを開始するための心内膜の活性化はFGF8およびBMP4によって媒介され、その発現はNOTCH9、10、11、12によって活性化される。
EMTの進行には、細胞が形を変え、隣接する細胞との接合部を壊して作り直し、層間剥離し、移動し始めるときの細胞動態が含まれます13。これらの変化には、AJのリモデリングと段階的な分解14,15、平面細胞極性(PCP)シグナル伝達、アピコ基底極性(ABP)の喪失、頂端狭窄、および細胞骨格組織が含まれます16,17。ABPは、細胞の前後軸に沿ったタンパク質の分布を指します。発達中の心臓では、心筋細胞におけるABP調節が心室の発達に必要です18。PCPは、組織の平面を横切る細胞内のタンパク質の分極分布を指し、細胞分布を調節します。安定した幾何学を持つ上皮は六角形の細胞で構成されており、頂点19,20,21,22に収束するのは3つの細胞だけです。上皮形態形成中に起こる細胞分裂、隣人交換、または層間剥離などの異なる細胞プロセスは、頂点に収束する細胞の数と、特定の細胞が持つ隣接細胞の数が22増加する。PCPに関連するこれらの細胞挙動は、異なるシグナル伝達経路、アクチン動態、または細胞内輸送によって調節され得る23。
マウスにおける弁の発達を研究するために生成されたデータは、E8.5およびE9.5胚性心臓の横方向、冠状、または矢状切片から得られており、心内膜は細胞の野としてではなく細胞の列として示され、心内膜は心臓管24の内面全体を覆っている。胚切片は、マウス胚の心内膜におけるPCPの分析を可能にしない。我々の新しい実験法は、代表的な結果に示すように、心内膜細胞分布の解析、AJ異方性、および単一細胞形状解析を可能にします。このタイプのデータは、PCPに関連する他の分子の説明とともに、PCP分析に必要ですが、このレポートには示されていません。ホールマウント免疫蛍光法、特異的サンプル調製、および遺伝子改変マウスの使用により、マウスの弁発生開始時の心内膜の平面極性分析が可能になります。
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Protocol
動物実験は、Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares(CNIC)動物実験倫理委員会およびマドリッド共同体によって承認されました(PROEX 155.7/20参照)。すべての動物の手順は、Real Decreto 201/63に基づいてスペインの法律で制定された、実験およびその他の科学的目的で使用される動物の保護に関するEU指令2007/63EUおよび勧告2007/526 / ECに準拠しています。
1. AVCおよび/またはOFTのオブテンション(Xiaoらから適応。25)
- 午後にメスの mTmG とオスの VE-カドヘリン-Cre-ERT/+の間に交配を設定します。
- 翌朝、膣栓をチェックします。膣栓がある場合は、半日(E0.5)として数えます。関心のある実験に応じて、8日または9日を数えます。
- 解剖の24時間前に、コーン油で希釈した5 mg / mL 4-OH-タモキシフェン50 μLで妊娠中の女性を経口投与します。.
注:この用量は、GFP陽性クローンの存在によって明らかにされた限られた量のCRE媒介組換えを誘発します。適切な用量は、4-OH-タモキシフェンの新しいバッチごとに決定する必要があります。 - 子宮頸部脱臼によりE8.5またはE9.5で妊娠中の女性を犠牲にします。
- ハサミを使って妊娠マウスの腹部を開き、ハサミと細かい鉗子を使って胚を含む子宮を取り除きます。
- 氷冷した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と0.1%Tween-20(PBT)を含むペトリ皿に子宮を置きます。
- 解剖顕微鏡下で細かい鉗子を使用して子宮から個々の脱落膜を取り除きます。
- 細いピンセットを使って、胚がある脱落膜の白い部分を切開し、引っ張らないようにそっと取り除き、先端を切り落としたP1000を使用して新鮮なPBTを入れた新しいペトリ皿に胚を移し、胚が壊れずに通過するのに十分な直径を残します。
- ジェノタイピングのために、卵黄嚢の小片(0.5 mm2)または尾片(後端から頭に向かって5〜10個の体節を数えます)を取り、100 μLの適切なバッファーで消化します。
- ヒュームフードの下で、4°Cの微量遠心機(2 mL)チューブ内の滅菌ろ過PBS中の氷冷した4%パラホルムアルデヒド(4%PFA)に胚を移します。 胚を2時間から4°Cで一晩(O / N)ナテーターに固定します。
- ヒュームフードの下で、胚に触れることなく、微量遠心チューブから4%PFA固定液を取り除きます。PFA を適切な容器に入れて廃棄します。
- 胚を冷たいPBTで室温(RT)でそれぞれ10分間5回洗浄します。
- 細かい鉗子を使用して心臓を取り外し、新鮮なPBTを入れた新しい1.5mLマイクロ遠心チューブに移します。
2. マウス胚性心臓のホールマウント免疫蛍光法
- PBTをPBSTr(PBS中の0.4%トリトンX-100)に置き換え、オービタルシェーカーのRTでサンプルをそれぞれ3回、5分間洗浄します。
- PBSTrをブロッキング溶液(PBSTrを10%熱不活化ウシ血清)に置き換えます。オービタルシェーカーで4°Cで2時間O/Nインキュベートします。
- ブロッキング溶液を、所望の濃度の一次抗体を含むブロッキング溶液に置き換えます(抗GFPまたは抗VE-カドヘリン抗体の場合は、1:1000希釈を使用します)。オービタルシェーカーでO/Nを4°Cでインキュベートします。
- 4°CでO/Nインキュベートした後、オービタルシェーカーでRTで1.5時間インキュベートします。このステップは、信号対雑音比を高めるために非常に重要です。
- 一次抗体溶液を取り出し、最大3回の実験のために4°Cに保ちます(最適な保存のために、アジ化ナトリウムを最終濃度0.02%まで添加します)。
- 胚をPBSTrでそれぞれ3分間3回洗浄します。
- 胚をPBSTr 3xで4°Cのオービタルシェーカーでそれぞれ30分間洗浄します。
- 最後の洗浄後、一次抗体宿主種に対する1:1000蛍光標識二次抗体を含むブロッキング溶液1 mLを加えます。また、1:3000 DAPIを溶液に加え、胚O/Nをオービタルシェーカーで4°Cでインキュベートします。
- 4°CでO/Nインキュベートした後、オービタルシェーカーでRTで1.5時間インキュベートします。このステップは、信号対雑音比を高めるために非常に重要です。
- 胚をPBSTrでそれぞれ3分間3回洗浄します。
- 胚をPBSTr 3x-5xでRTのオービタルシェーカーでそれぞれ30分間洗浄します。
3. マウス胎児AVCまたはOFTのマウント
- PBSを含むペトリ皿(35 mm)にハートを置きます。
- タングステン線と細い鉗子を使用して、AVCまたはOFTを分離し、縦方向に切断します26。
- カバーガラス(22 mm x 22 mm)、スライド(60 mm x 24 mm)、鉗子、適切なチップ付きのP200ピペット、ペーパータオル、および蛍光用のグリセロール水性封入剤をDAPIなしで準備します。
- Xiao, C. et al.25と同様のアプローチを使用して、0.3〜0.6 cm離れたスライドに2本のテープを貼り付けて、サンプルを押しつぶさずに元の形状を保存できる3Dルームスペースを作成します。
- 慎重に、最小量のバッファーを使用して、カットされたP200チップピペットを使用して、テープストライプの間のスライドにサンプルをドロップします。解剖顕微鏡を使用して精度を高めます。
- 細かい鉗子を使用して、心内膜を上に向けてサンプルを置きます(スライド上で心筋を下向きにします)。
- ペーパータオルで余分なPBSを取り除き(サンプルに触れないでください)、サンプルをRTで1〜2分間乾燥させて、サンプルをスライドにくっつけます。
- 40 μLの水性ベースの封入剤を組織に追加します。
- カバーガラスを2枚のテープの上に置き、針または鉗子でゆっくりとティッシュの上に下げます。気泡は発生しないでください。
- カバースリップの各頂点に1滴のマニキュアを使用してカバーガラスをシールします。
- マニキュアが乾いたら、吸収性ペーパータオルを使用してカバーガラスの側面から余分な封入剤を取り除きます。カバーガラスを動かさないでください。
- カバーガラスの端に沿ってマニキュアを追加して完全に密閉し、マウントメディアの蒸発を防ぎます。
- 正立または倒立共焦点顕微鏡を使用して、一般表示の場合は10倍、詳細画像の場合は3倍ズームで63倍で画像を撮影します。
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Representative Results
このプロトコルを使用して生成されたデータは、AVCの心内膜の顔面イメージングを実行することが可能であることを示しています。最初の目的は、弁形成中の心内膜の細胞形状を細胞分解能で解析することでした(図1)。E9.5の個々の心内膜細胞を強調するために、2つのトランスジェニックマウス系統を使用しました。(1)ROSA mT/mGは、細胞膜で蛍光が検出される2色の蛍光Creレポーター対立遺伝子(tdトマト/mTおよびEGFP/mG)です。Cre媒介活性化なしでは、導入遺伝子はtdTomato(mT)を発現する。Cre媒介活性化により、tdTomato発現は、特定の細胞およびクローン誘導体におけるEGFP蛍光発現(mG)に置き換えられる27。(2)Cdh5CreERT2/+マウス株は、胚期の血管内皮および心内膜で発現する血管内皮カドヘリンプロモーター(Cdh5)の制御下でタモキシフェン誘導性CREリコンビナーゼ(CreERT2)を発現します28。心内膜の個々の細胞におけるGFPの発現を活性化するために、各遺伝子型の雄と雌を交配して2つの導入遺伝子を持つ胚を得た。これを達成するために、我々は低用量のタモキシフェンを接種し、減少した細胞数でCRE発現を活性化させた。その結果、単一細胞、または少数の細胞のクローンが心内膜においてGFPを発現した(図1A)。VE-カドヘリン細胞内局在(図1C)と組み合わせたGFP発現(図1A、B)は、AJが溶解するにつれてこれらの細胞が膜突起を発達させるため、EMT前の細胞におけるAJ動態と糸状足形成との関係を研究するための効果的なアプローチです29。PCPシグナルは、AJに異方性収縮性を与え、上皮30における分極形態形成を促進する細胞力を生成することができる。心内膜のVE-カドヘリン染色の強度に差が見られ(図2)、弁膜前段階でAVCの胚性心内膜の異方性収縮性を捨てることはできないことが示唆されました。
2番目の目的は、弁発生中の心内膜の平面トポロジーを分析することでした(図2)。単一の頂点に収束する細胞の数を定義するために、E8.5およびE9.5のVE-カドヘリン抗体で心臓全体を染色しました(図2A、B)。心内膜細胞の細胞間接触に局在する他の分子もまた、その目的に有用であろう(例えば、β−カテニン)。E8.5では、AVCの心内膜は安定した上皮組織を持つ傾向があり、4つ以上の細胞によって形成される頂点を検出できませんでした(図2A、C)。その後のE9.5では、ロゼット様構造を形成する最大6個の細胞で構成される頂点が見つかり(図2B、D)、上皮で前述した細胞組織と同様に、活発な細胞再配列を受けており31、AVC心内膜が弁の発達中に活発な細胞再編成を受けていることを示唆しています。
図1:前頓径心内膜における単一細胞形状解析。 (a)長手方向に開いたE9.5マウス胚由来のAVCが散在するGFP陽性細胞を示す。(B)単一細胞におけるGFP発現は、細胞分解能で細胞形状を定義する。(C)VE-カドヘリンハイライトAJのホールマウント染色。糸状足は、VE-カドヘリンを局在化しない細胞のドメイン(紫色の矢印)に生成され、逆に、VE-カドヘリンは滑らかで糸状足を形成しない細胞のドメインに局在する(青い矢印)。V、腹側。D、背側。Aのスケールバーは100μmです。BおよびCでは10μmである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:平面的に局在するタンパク質の平面トポロジーと異方性は、AV管の心内膜の 顔 画像で定義できます。 VE-カドヘリンは、心内膜の細胞間接触に局在する。(A)胚由来のE8.5および(B)E9.5 AVCを縦方向に開口させた。(C)と(D)の倍率により、頂点に収束するセルの数を観察することができました。さらに、VE-カドヘリン染色の異なる強度を区別することができ、AVC内のその位置が異方性であることを示しています。 A と B のスケールバーは100μmです。 C および D では10μmである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
心内膜は、胚性心臓管の内面全体を覆う上皮単層である。弁の発達中、将来の弁領域の心内膜細胞はEMTを受けるため、心内膜細胞は細胞骨格を形質転換および再配置して、心内膜から心臓ゼリーに向かって剥離します。私たちらは、心内膜が細胞の列として示されているE8.5およびE9.5胚性心臓の横断切片を分析することにより、マウス胚の弁発生に関する関連データを取得しました6、8、24、32。このアプローチにより、弁の発生に関与するシグナル伝達経路やその他の分子の発現を解析することができましたが、弁膜前心内膜の空間的側面を解析することはできませんでした。
AVCまたはOFT外植片は、主に3Dコラーゲンゲル上でECを変換する研究に使用されました。外植片は、EMT定量、形質転換能力の分析、または培養6、7、11、33で数日後の薬物の試験に有用である。これらの生体外実験はまた、単層としてコラーゲンゲルの上の心内膜の拡張を可能にするが、生体外心臓外植片が成長する環境条件は子宮条件とは異なる。例えば、一方向血流は、適切な弁の発達に不可欠であり34,35、子宮内でのみ達成され、生体外植片では達成されない。
この新しいアプローチにより、環境操作なしで、弁の発達の開始時に無傷の心臓弁膜を 顔面で 観察することができます。心内膜の細胞分布の解析や、 子宮 内におけるEMT前後の単一細胞形状解析が可能です。また、EMT中の細胞間接触の強度と組織、および関連する分子の細胞内分布を観察および分析することもできます。この技術はまた、心内膜の細胞内構造、レポーター遺伝子を用いたシグナル伝達経路の活性化、遺伝子不活性化が細胞挙動に及ぼす影響、およびそれが野生型の隣接細胞にどのように影響するかを分析する可能性を提供します。
高品質のサンプルを得るには、組織に付着した不純物(マイクロファイバーなど)が画像のキャプチャ中にアーチファクトを引き起こす可能性があるため、取り扱いに細心の注意を払うことが重要です。さらに、非常に小さなサンプルであるため、破損のリスクが高いため、スローシェーカーで組織を洗浄する必要があります(ステップ1.およびステップ2.)。ピペットで培地を交換するときは、誤って吸収された場合に組織がチップを通過するときに組織が崩壊するのを防ぐために、チップを切り取ることをお勧めします。この技術の専門家になるには、学習曲線が必要であり、これは研究者のマイクロマニピュレーションの以前の経験に応じて長くなったり短くなったりします。
適切な固定液および固定時間を選択することは、蛍光タンパク質を発現する導入遺伝子を使用する場合に重要であり得る。解剖学的構造は、エタノール70%、メタノール、PFA 4%、ホルマリン10%などの異なる固定液の影響を受けません。
核の対比染色には、DAPIで封入剤を使用するよりもはるかに効率的であるため、DAPIを使用したサンプルのインキュベーションをお勧めします。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
本研究は、MCIN/AEI/10.13039/501100011033からJ. L. P. J.G.-Bへの助成金PID2019-104776RB-I00およびCB16/11/00399(CIBER CV)の支援を受けました。マドリード市(2020-5ª/BMD-19729)のアトラシオン・デ・タレント・プログラムから資金提供を受けました。T.G.-C.Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054)から資金提供を受けた。我々は、MCIN/AEI /10.13039/501100011033とFEDER「ヨーロッパを作る方法」(#ICTS-2018-04-CNIC-16)の共同出資により、CNIC顕微鏡・ダイナミックイメージングユニット(CNIC)、ICTS-ReDibに感謝する。また、A.ガリシアとL.メンデスのマウス飼育にも感謝します。この出版物の費用は、欧州地域開発基金からの資金によって部分的に支えられました。CNICは、ISCIII、MCIN、およびPro CNIC財団によってサポートされており、MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033によって資金提供されたセベロオチョアセンターオブエクセレンス(助成金CEX2020-001041-S)です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
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