Summary
يصف هذا البروتوكول تقييم فرط الحساسية الميكانيكية في نموذج الفئران لألم الفم والوجه العصبي باستخدام جهاز تقييم الألم الفموي الوجهي القائم على الفعال.
Abstract
الألم له مكونات حسية وعاطفية. على عكس مقايسات الألم التقليدية القائمة على الانعكاس ، يمكن أن تؤدي فحوصات الألم الفعالة إلى نتائج أكثر صلة سريريا من خلال معالجة الجوانب المعرفية والتحفيزية للألم في القوارض. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتقييم فرط الحساسية الميكانيكية بعد إصابة الانقباض المزمن للأعصاب تحت الحجاجية (CCI-ION) في الفئران باستخدام نظام الألم الفموي الوجهي. قبل جراحة CCI-ION ، تم تدريب الفئران على جهاز تقييم آلام الفم والوجه (OPAD) لشرب الحليب المكثف المحلى أثناء ملامسة الوجه للقضبان المعدنية المسننة وأنبوب اللعقة.
في هذا الفحص ، يمكن للفئران الاختيار بين تلقي الحليب كمعزز إيجابي أو الهروب من التحفيز الميكانيكي المكروه الذي ينتج عن صف عمودي من المسامير الصغيرة على شكل هرم على كل جانب من فتحة الوصول إلى المكافأة. بعد 2 أسابيع من التدريب في OPAD وقبل جراحة CCI-ION ، تم تسجيل بيانات الحساسية الميكانيكية الأساسية لمدة 5 أيام لكل فأر خلال جلسة اختبار مدتها 10 دقائق. أثناء الجلسة ، يسجل نظام التشغيل تلقائيا عدد عمليات تنشيط زجاجة المكافأة (اللعق) وجهات اتصال الوجه ، ومدة الاتصال ، والكمون إلى اللعق الأول ، من بين تدابير أخرى.
بعد قياسات خط الأساس ، خضعت الفئران إما لجراحة CCI-ION أو جراحة وهمية. في هذا البروتوكول ، تم قياس فرط الحساسية الميكانيكية عن طريق قياس عدد اللعقات ، والكمون إلى اللعق الأول ، وعدد جهات الاتصال ، ونسبة اللعقات إلى ملامسات الوجه (L / F). أظهرت البيانات أن CCI-ION أدى إلى انخفاض كبير في عدد اللعقات ونسبة L / F وزيادة في زمن الوصول إلى اللعق الأول ، مما يشير إلى فرط الحساسية الميكانيكية. تدعم هذه البيانات استخدام فحوصات الألم القائمة على الفعالية لتقييم حساسية الألم الميكانيكية في أبحاث الألم قبل السريرية.
Introduction
يؤثر الألم المزمن على ملايين الأمريكيين سنويا1. لسوء الحظ ، يصعب علاج الألم المزمن ، حيث أن العلاجات الحالية غير فعالة نسبيا في تخفيف الألم المزمن وغالبا ما يكون لها آثار جانبية غير مرغوب فيها مع الاستخدام طويل الأمد2،3،4. تعتمد فحوصات الألم قبل السريرية التقليدية ، مثل مقايسة فون فراي ، على النتائج الانعكاسية أو الاستجابات المحفزة للألم5. في حين تم استخدام مقايسة فون فراي لعقود لقياس الألم الخيفي الميكانيكي ، إلا أنها عرضة لعدة عوامل مربكة ، لا سيما تحيز المجرب6. يعد استخدام اختبار فون فراي لتقييم ألم الفم والوجه مشكلة أيضا بسبب درجة ضبط النفس اللازمة لتأمين رأس الحيوان لاختبار منطقة الوجه بنجاح ، مما قد ينتج عنه آثار إجهاد غير مرغوب فيها ، مثل تعزيز الألم أو ، على العكس من ذلك ، تسكين الألم الناجم عن الإجهاد.
السلوكيات المحفزة للألم هي أيضا عرضة للنتائج الإيجابية الكاذبة7 ولا تأخذ في الاعتبار المكون العاطفي للألم ، والذي يعد جزءا لا يتجزأ من تجربة الألم البشري8. لذلك ، هناك اهتمام متزايد باستخدام نماذج الألم الفعالة التي تقيم سلوكيات الاكتئاب المكتئب التي تشمل كلا من المكونات الحسية والعاطفية للألم لتحسين المحتوى والصلاحية التنبؤية في الاختبارات قبل السريرية. يعتمد اختبار تقييم الألم الفموي الوجهي الفعال الموصوف هنا على نموذج صراع المكافأة9،10،11. في هذا الفحص ، يمكن للقوارض الاختيار بين تلقي معزز إيجابي وإخضاع نفسه لمحفز مسبب للألم أو التخلي عن المكافأة وتجنب التحفيز المسبب للألم ، وبالتالي التحكم في مقدار الألم الذي يعاني منه. على عكس مقايسات الألم التقليدية ، فإن الفحص القائم على الفعالية مستقل عن المجرب وليس عرضة للنتائج الإيجابية الكاذبة بسبب التأثيرات المهدئة غير المرغوب فيها.
يتم نقل الأحاسيس الضارة من الرأس والوجه بواسطة فروع العيون والفك العلوي والفك السفلي للعصب الثلاثي التوائم. إصابة أو التهاب العصب الثلاثي التوائم يزيد من حساسية الخلايا العصبية الحسية للمنبهات الحرارية أو الميكانيكية12،13،14،15. توفر فحوصات الألم الفموي الوجهي القائمة على التشغيل قياسا آليا لألم الفم والوجه الحراري أو الميكانيكي الذي ينتقل عن طريق العصب الثلاثي التوائم في القوارض11،12،16،17،18. يعد التحفيز باستخدام المنبهات غير الضارة والضارة تمييزا مهما بين اختبار الألم الخيفي الحراري والميكانيكي وفرط التألم في منطقة الفم والوجه باستخدام OPAD ، حيث قد يمثل مظاهر لآليات أساسية مختلفة.
في الفحص الحراري الفموي الوجهي ، تضغط الحيوانات على وجهها ضد الحرارة الملساء للوصول إلى المكافأة. يمكن ضبط الترموسيدات على درجات حرارة باردة ودافئة وساخنة مختلفة ، مما يسمح بتقييم السلوك في ظل ظروف محايدة أو مسبب للألم. في الفحص الميكانيكي الفموي الوجهي ، تضغط الحيوانات على وجهها ضد القضبان المسننة أثناء الاختبار الفعال ؛ نظرا لأن هذه المسامير تسبب مستوى معينا من عدم الراحة ، فقد تشرب القوارض أقل عندما تلمس وجوهها المسامير مقابل الأسطح الملساء للثيرمدات. وبالتالي ، يمكن للمقايسة الميكانيكية الفموية الوجهية الفعالة تقييم تأثير درجات متفاوتة من التحفيز الميكانيكي المسبب للألم. لقد أثبتنا سابقا أن OPAD هي طريقة مفيدة وموثوقةلتقييم 9 الحرارية الحادة ، وكذلك الميكانيكية الحادة19 ، nociception وفرط التألم.
تشير هذه الورقة إلى استخدام نسخة مطورة حديثا من OPAD لتقييم الإحساس بالألم الميكانيكي وفرط الحساسية. بالإضافة إلى ذلك ، عن طريق التحقق من الصحة ، نظهر قدرة CCI-ION على إحداث اعتلال عصبي مزمن ينتج عنه استجابة يمكن التنبؤ بها في OPAD. كما تم تفصيل كيفية استخدام OPAD والبرامج المرتبطة به للحصول بسرعة على البيانات السلوكية للقوارض وتحليلها.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة فلوريدا وامتثلت للمعايير المنصوص عليها في دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. هنا ، يتم وصف تقييم فرط الحساسية الميكانيكية باستخدام OPAD باستخدام نموذج الفئران من آلام الفم والوجه العصبية. يظهر رسم تخطيطي للجدول الزمني المستخدم في الدراسة في الشكل 1. تم إجراء جميع التقييمات السلوكية من قبل المجربات.
1. الحيوانات
- منزل إناث فئران Sprague-Dawley (ن = 8 / مجموعة ، 150-200 جم) في أزواج في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها (22 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية) مع دورة 12 ساعة: 12 ساعة من الضوء والظلام. توفير الغذاء والماء الإعلان. الحفاظ على الفئران في المنشأة لمدة 5 أيام للتأقلم قبل التجارب.
- قم بإجراء فحوصات الألم الفعالة في نفس اليوم من الأسبوع والوقت (9 صباحا - 11 صباحا).
- في نهاية التجارب ، القتل الرحيم للفئران عن طريق قطع الرأس بعد التخدير isoflurane.
2. إعداد OPAD
- ضع صواني تنقيط الحليب وأقفاص زجاج شبكي وشبكات أرضية معدنية على OPAD. نعلق الأسلاك إلى أقفاص. ضع حامل الزجاجة على العمود المعدني في الجزء الخلفي من الجهاز.
- تحضير نسبة 2: 1 من الماء إلى الحليب المكثف المحلى كمحلول مكافأة عن طريق فتح علبة من الحليب المكثف المحلى وصبها في دورق سعة 1 لتر. أضف ~ 600 مل من ماء الصنبور إلى 300 مل من الحليب. في البداية حرك المحلول باستخدام ملعقة ، ثم استخدم شريط التحريك ومحرك الألواح الساخنة. بعد ذلك ، املأ زجاجات المكافآت بمحلول الحليب واحتفظ بمحلول الحليب في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
ملاحظة: قم بتغطية محلول حليب المرق بغلاف طعام بلاستيكي. قم بتسخين محلول الحليب قبل كل استخدام. يمكن أن يتخثر محلول الحليب في الثلاجة بعد أسبوع. عندما يتخثر ، قد يسد أنبوب اللعقة. لذلك ، تجاهلها وقم بإعداد حل مخزون جديد. - ضع زجاجات حليب المكافأة على حامل الزجاجة واضبطها حتى يتمكن الحيوان من الوصول إلى الفوهة. أحكم ربط مقبض الجانب الأيسر من الحامل لتثبيت الزجاجة في مكانها.
- قم بتشغيل الأقفاص باستخدام المفتاح الموجود على اللوحة الأمامية.
3. إعداد بروتوكول وإنشاء ملف تجربة
ملاحظة: أولا، قم بإعداد البروتوكول لتشغيل التجربة. يصف البروتوكول كيفية قيام برنامج ANY-maze بإجراء التجربة.
- افتح البرنامج. اكتب كلمة المرور. انقر فوق تسجيل دخولي أو اضغط على Enter.
- انقر على تجربة فارغة جديدة | قائمة البروتوكول .
- حدد الوضع الذي سيستخدمه هذا البروتوكول وقم بتسمية البروتوكول. ضمن الجهاز، انقر فوق بروتوكول غير مسمى، وانقر فوق القسم حدد الوضع الذي سيستخدمه هذا البروتوكول ، وضمن الأوضاع الخاصة بالمعدات، حدد وضع القفص الميكانيكي OPAD، وانقر فوق موافق. ثم قم بتسمية البروتوكول (على سبيل المثال ، OPAD الميكانيكي).
- أضف أقفاص OPAD.
- ضمن جهاز، انقر فوق جهاز | إضافة عنصر موجود في الجزء العلوي من جزء البروتوكول | | قفص OPAD الجديد أضف جميع أقفاص OPAD المتصلة.
ملاحظة: قبل إضافة الأقفاص، تأكد من تشغيل جميع الأقفاص.
- ضمن جهاز، انقر فوق جهاز | إضافة عنصر موجود في الجزء العلوي من جزء البروتوكول | | قفص OPAD الجديد أضف جميع أقفاص OPAD المتصلة.
- أضف مراحل اختبار التجربة.
- ضمن اختبار، انقر فوق المراحل | المرحلة الأولى واسم المرحلة (على سبيل المثال ، يوم خط الأساس 1). اكتب 10 دقائق لمدة الاختبار. لإضافة المزيد من المراحل، انقر فوق إضافة عنصر موجود في الجزء العلوي من جزء البروتوكول | مرحلة جديدة.
ملاحظة: تشير كل مرحلة إلى الجلسة عند إجراء الفحص. على سبيل المثال ، لمدة 10 أيام من التدريب ، هناك حاجة إلى 10 مراحل. يمكن زيادة مدة الاختبار أو تقليلها بناء على التصميم التجريبي.
- ضمن اختبار، انقر فوق المراحل | المرحلة الأولى واسم المرحلة (على سبيل المثال ، يوم خط الأساس 1). اكتب 10 دقائق لمدة الاختبار. لإضافة المزيد من المراحل، انقر فوق إضافة عنصر موجود في الجزء العلوي من جزء البروتوكول | مرحلة جديدة.
- تعيين مجموعات العلاج.
- ضمن معلومات إضافية، انقر فوق مجموعات المعالجة. تحقق من استخدام مجموعات العلاج | سيقوم المستخدم بتعيين الحيوانات يدويا لمجموعاته.
ملاحظة: يسمح البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد) أيضا بتعيين الحيوانات بشكل عشوائي أو بترتيب معين. يمكن تشغيل التجارب بشكل أعمى. للاطلاع على مجموعات العلاج المعينة، قم بإلغاء تحديد تشغيل التجارب العمياء.
- ضمن معلومات إضافية، انقر فوق مجموعات المعالجة. تحقق من استخدام مجموعات العلاج | سيقوم المستخدم بتعيين الحيوانات يدويا لمجموعاته.
- تعيين معرفات الحيوانات (ID).
- انقر فوق قائمة البروتوكول ؛ ضمن معلومات إضافية، انقر فوق معرف الحيوان وحدد استخدام معرفاتي للإشارة إلى الحيوانات.
- انقر على قائمة التجربة .
- اكتب عنوان تجربة.
- قم بتسمية العلاجات بالنقر فوق عرض العلاجات، واكتب أسماء العلاج (على سبيل المثال، العلاج 1: CCI-ION، العلاج 2: sham).
- إضافة الحيوانات وتعيين العلاجات ومعرفات الحيوانات بالنقر على عرض الحيوانات | أضف، وأدخل عدد الحيوانات التي سيتم اختبارها، وانقر فوق موافق. انتظر حتى تظهر قائمة الحيوانات وأضف معرفات الحيوانات والعلاجات لكل فأر.
ملاحظة: سيتم تعيين قائمة الحالة التي تظهر بجوار معرف الحيوان على عادي في بداية الدراسة. يمكن إزالة الحيوانات لاحقا من جدول الاختبار عن طريق تغيير حالتها إلى إما متقاعد أو محذوف.
- احفظ البروتوكول بالنقر فوق قائمة البروتوكول | حفظ البروتوكول الموجود في الجزء العلوي من جزء البروتوكول . اكتب اسم الملف وكلمة مرور البرنامج (ANY-maze) وانقر فوق حفظ.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدام البروتوكولات المحفوظة لإجراء تجارب جديدة. - احفظ ملف التجربة بالنقر على ملف | حفظ، واكتب كلمة مرور البرنامج، وانقر فوق حفظ.
4. جلسات التدريب والاختبار الأساسي
ملاحظة: أحضر الفئران إلى الغرفة قبل 15 دقيقة على الأقل من الاختبار إذا كانت غرفة الاختبار السلوكي في نفس منشأة إيواء الحيوانات. إذا تم نقلهم إلى غرفة اختبار خارج منشأة الحيوانات ، فامنح الفئران 1 ساعة للتأقلم مع الغرفة.
- قبل التسجيلات الأساسية ، قم بتدريب الفئران في OPADs لمدة 2 أسابيع (5 أيام / أسبوع ، 10 دقائق / يوم) للضغط على وجوههم ضد القضبان المعدنية المسننة لتلقي محلول الحليب.
ملاحظة: تظهر في الشكل 2 صورة تمثيلية للقضبان المسننة والجرذ الذي يقوم بالفحص. - قم بإعداد معدات OPAD.
- قم بتشغيل الأقفاص باستخدام المفتاح الموجود على اللوحة الأمامية. ابحث عن الضوء الأخضر على القفص ، مما يعني أن القفص جاهز للاختبار.
- انقر نقرا مزدوجا فوق ملف التجربة المحفوظ لفتحه. اكتب كلمة المرور. انقر فوق تسجيل دخولي أو اضغط على Enter.
- انتظر حتى تظهر قائمة الاختبارات . على الجانب الأيسر من الشاشة ، قم بتدوين عدد الحيوانات والقفص المقابل (على سبيل المثال ، سيتم اختبار الحيوان 1 في القفص 1) ، والمرحلة التي سيتم تشغيلها في ذلك اليوم ، وحالة الاختبار ("جاهز"). على الجانب الأيمن من الشاشة، لاحظ الرسم البياني لكل الذي يظهر عدد اللعقات وجهات الاتصال.
- راقب شاشة الأقفاص التي تعرض معرف الحيوان المراد اختباره. ضع كل فأر في القفص المقابل واضغط على الزر الموجود في القفص مرتين. لاحظ أن الضوء الأخضر سيتحول إلى ضوء برتقالي بمجرد بدء الاختبار ، وسيتم سماع صوت تحذير عند انتهاء جلسة الاختبار.
- لأول 2 أيام من التدريب ، ضع زجاجات الحليب بالكامل في القفص للسماح للفئران بشرب الحليب دون الاتصال بالحافز.
- في الأيام 3-8 من التدريب ، بمجرد أن تبدأ الحيوانات في الشرب ، حرك الزجاجات تدريجيا للخلف لتشجيع الفئران على الضغط على وجوهها ضد القضبان المسننة.
- في الأيام 9-10 من التدريب ، بمجرد أن تضغط الحيوانات بالكامل على القضبان المسننة وتكون أرقام اللعق متسقة (بحد أدنى 500 لعقة خلال جلسات الاختبار التي تستغرق 10 دقائق) ، لاحظ موقع زجاجة الحليب لكل واستخدم هذه المسافة للتسجيلات الأساسية.
- بعد 2 أسابيع من التدريب ، اجمع البيانات من مسافة زجاجة الحليب الملحوظة لمدة 5 أيام كخط أساس (10 دقائق / يوم).
5. تحريض آلام الأعصاب الفموية الوجهية وتقييم فرط الحساسية الميكانيكية
ملاحظة: بعد قياسات خط الأساس ، خضعت الفئران لجراحة CCI-ION ، والتي تضمنت الربط الثنائي للأيون ، كما هو موضح سابقا20. خضعت الفئران الضابطة لعملية جراحية زائفة. لم يتم استخدام تسكين قبل أو بعد الجراحة في الإجراء لأنه يمكن أن يغير المسار الزمني للاعتلال العصبي. تنبيه: يجب تنظيف نفايات إيزوفلوران من خلال عبوات الفحم. يجب التخلص من شفرات وإبر المشرط في النفايات البيولوجية.
- تخدير الجرذ في غرفة الحث بمزيج من O2 (1 لتر / دقيقة) و 4٪ إيزوفلوران والحفاظ على حالة التخدير باستخدام مخروط أنف متخصص طوال مدة الجراحة.
- ضع الجرذ المخدر على طاولة عمل جراحية وقم بحده. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة التدفئة. ضع مرهم العيون على العينين لمنعهما من الجفاف. تحقق من عمق التخدير عن طريق الضغط على إصبع القدم وبدء الإجراء عندما لا يتم ملاحظة رد فعل انسحاب إصبع القدم.
- إجراء العملية الجراحية تحت مجهر ستيريو. افتح الفم باستخدام المبعدات واسحب الشفة باستخدام مشبك صغير.
- قم بعمل شق صغير بين اللثة الظهرية والشفة باستخدام شفرة مشرط (# 15). اقطع الأنسجة الرخوة برفق باستخدام طرف شفرة المشرط للكشف عن فرع من الأيون.
- ضع اثنين من أمعاء الكروم (# 5-0) حول ION باستخدام إبرة حقنة حادة ومثنية.
- أغلق الجرح باستخدام لاصق الأنسجة.
- بالنسبة للجراحة الوهمية ، قم بكشف ION باستخدام نفس الإجراء ولكن لا تقم بربط العصب.
- بعد الجراحة ، توفير حليب القوارض المخفف لمدة 2 أيام لتشجيع الأكل ومنع الجفاف.
- اختبر الفئران في OPAD في اليوم التالي للجراحة لمدة 3 أيام متتالية ثم 3 أيام / أسبوع (على سبيل المثال ، كل ثلاثاء وخميس وجمعة) للأسابيع التالية حتى تصل أرقام اللعق إلى قيمها الأساسية.
ملاحظة: يمكن أن تعتمد مدة الحساسية الميكانيكية التي يسببها CCI-ION على الجنس وسلالة القوارض المستخدمة وأداء المجرب. وبالتالي ، قد لا يكون من الدقيق الإشارة إلى مدة معينة لاختبار الحيوانات. ومن ثم ، فإن الاختبار حتى تصل أرقام lick إلى قيم خط الأساس يكون أكثر دقة.
6. تنظيف الجهاز
- عند انتهاء الاختبار ، قم بإنهاء البرنامج بالنقر فوق الرمز x في الزاوية العلوية اليمنى وانتظر حتى يتم حفظ البيانات تلقائيا.
- قم بإيقاف تشغيل الأقفاص باستخدام المفتاح الموجود على اللوحة الأمامية.
- افصل الأسلاك من شبكات الأرضيات المعدنية. قم بإزالة وغسل صواني تقطير الحليب ، وأقفاص زجاج شبكي ، وشبكات الأرضيات المعدنية ، وحاملات الزجاجات بصابون الأطباق. ضع كل شيء على رف التجفيف.
- امسح القضبان المعدنية المسننة وجهاز الاختبار ومقاعد المختبر باستخدام 70٪ من كحول الأيزوبروبيل.
ملاحظة: يجب التعامل مع الأدوات بعناية. استخدم الفرش الناعمة أثناء تنظيف زجاجات الحليب وأنابيب اللعق. يمكن أن تؤدي المعدات المتسخة إلى تراكم البكتيريا.
7. تحليل البيانات
- انقر نقرا مزدوجا فوق ملف التجربة لفتحه.
- انقر فوق قائمة النتائج . حدد المقاييس (على سبيل المثال ، لعق ، اتصال) أو أيام الاختبار لرؤيتها.
- انقر فوق نص أو رسم بياني أو إحصائي موجود في أعلى لوحة النتائج لرؤية نص أو رسم بياني أو تقرير تحليل إحصائي.
- للاطلاع على البيانات الأولية، انقر فوق قائمة البيانات . انقر فوق حفظ في الجزء العلوي من لوحة البيانات لحفظ البيانات كجدول بيانات أو انقر فوق إرسال لاستلامها عبر البريد الإلكتروني.
- لتغيير أو إضافة المزيد من المتغيرات لرؤيتها، انقر على اختيار البيانات، وحدد المقاييس، وانقر على عرض جدول البيانات.
- التحليل الإحصائي
- اشتقاق عدد اللعقات وجهات الاتصال تلقائيا وزمن الانتقال إلى أول لعق من البرنامج وتصدير البيانات من البرنامج إلى جدول بيانات.
- احسب نسبة L / F كمؤشر لفرط الحساسية بقسمة عدد اللعقات على عدد جهات الاتصال21،22،23.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استبعاد أحد الفئران في المجموعة الوهمية من الدراسة بسبب انخفاض أعداد اللعق (<500 لعق) قبل الجراحة. - تحليل الدلالة الإحصائية للاختلافات بين L / F ، وعدد اللعقات وجهات الاتصال ، والكمون إلى اللعق الأول عبر مقاييس متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA متبوعة بمقارنات Dunnett المتعددة أو اختبارات Šídák للمقارنات المتعددة عند الاقتضاء.
ملاحظة: اعتبر P < 0.05 ذا دلالة إحصائية. تم تقديم البيانات كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM).
Representative Results
مثال على لعق فأر واحد على زجاجة المكافأة والاتصالات مع القضبان المعدنية المسننة عند خط الأساس و 2 أسابيع و 4 أسابيع و 6 أسابيع بعد الجراحة معروضة في الشكل 3. خلال الفترات غير الضارة ، يكون للفئران عموما جلسات طويلة من الشرب (على سبيل المثال ، عند خط الأساس والتعافي بعد CCI-ION: الأسبوع 6 في الصورة) ، وبعد CCI-ION ، تنخفض أعداد اللعق لأنها لا تستطيع الحفاظ على اتصال الوجه مع القضبان المسننة لفترة طويلة (الشكل 3 أ) ، مع عدم وجود تغييرات كبيرة في فترات الشرب في المجموعة الوهمية (الشكل 3 ب).
كان لدى الفئران المصابة ب CCI-ION انخفاض كبير في عدد اللعقات حتى 4 أسابيع بعد الجراحة وزيادة في زمن الوصول إلى اللعق الأول في أسبوع الجراحة (الأسبوع 0) و 1 أسبوع بعد الجراحة مقارنة بخط الأساس. لم يكن هناك تغيير كبير في المجموعة الوهمية (الشكل 4 أ ، ب). أنتج CCI-ION انخفاضا في عدد جهات الاتصال ، لكن هذا الاختلاف لم يكن كبيرا (الشكل 4C). تسبب CCI-ION أيضا في انخفاض كبير في L / F ، وكان الانخفاض في مجموعة CCI-ION أكبر من الانخفاض في المجموعة الوهمية (الشكل 4D).
تشير هذه النتائج إلى أنه بعد CCI-ION ، تظهر الفئران سلوكا أقل لشرب الحليب ، ويستغرق الأمر بعض الوقت لعمل اللعق الأول ، مما يشير إلى سلوك nocifensive. ومع ذلك ، لا يؤثر CCI-ION على رغبتهم في الوصول إلى الحليب. بالإضافة إلى ذلك ، يشير الانخفاض في L / F للفئران المصابة ب CCI-ION إلى فرط الحساسية الميكانيكية ، حيث يكون L / F أعلى خلال الظروف غير المؤلمة.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لتصميم الدراسة. الاختصارات: OPAD = جهاز تقييم الألم الفموي الوجهي. CCI-ION = إصابة انقباض مزمنة للأعصاب تحت الحجاج. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: صورة تمثيلية لقضبان مسننة وفأر يقوم بالفحص. قضبان مسننة مصنوعة من معدن الفولاذ المقاوم للصدأ. طول الشريط بأكمله 7 سم. ارتفاع المسامير 0.3 سم. المسافة بين المسامير 0.5 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: محاولات الاتصال التمثيلية وبيانات لعق فأر واحد يعمل بنظام CCI-ION وفأر يعمل بالخداع خلال جلسة الاختبار القياسية التي تستغرق 10 دقائق عند خط الأساس و 2 أسابيع و 4 أسابيع و 6 أسابيع بعد الجراحة. الاختصارات: CCI-ION = إصابة انقباض مزمنة للأعصاب تحت الحجاج ؛ AS = بعد الجراحة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تطور فرط الحساسية الميكانيكية بعد CCI-ION في فئران Sprague-Dawley. (أ) كان لدى الفئران المصابة ب CCI-ION (n = 8) انخفاض كبير في أعداد اللعق حتى 4 أسابيع بعد الجراحة و (B) زيادة في الكمون إلى اللعق الأول في أسبوع الجراحة (الأسبوع 0) وأسبوع واحد بعد الجراحة (** p < 0.01 ، * p < 0.05: بعد أسابيع الجراحة مقابل خط الأساس. #p < 0.05: CCI-ION مقابل الشام). لم يكن هناك انخفاض معنوي في المجموعة الوهمية (ن = 7 ، ص > 0.05). (ج) لم ينتج عن CCI-ION أو الجراحة الوهمية أي تغيير كبير في عدد المخالطين. (د) أظهرت الفئران المصابة ب CCI-ION انخفاضا كبيرا في L / F في أسبوع الجراحة و 3 أسابيع بعد ذلك وأظهرت اتجاها متناقصا بعد أسبوعين من الجراحة. بالمقارنة مع فئران المجموعة الوهمية ، كان هذا الانخفاض أعلى بكثير في فئران CCI-ION وبدأ 1 أسبوع بعد الجراحة واستمر حتى 3 أسابيع بعد الجراحة. لم يكن هناك فرق كبير في المجموعة الوهمية (** p < 0.01 ، * p < 0.05: بعد أسابيع الجراحة مقابل خط الأساس. # p < 0.05: CCI-ION مقابل الشام). في التمثيلات البيانية، يمثل الخط الأحمر مجموعة CCI-ION، ويمثل الخط الأزرق المجموعة الزائفة. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. تم تحليل الاختلافات ذات الدلالة المرتدية من خلال مقاييس متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA متبوعة باختبارات المقارنة المتعددة ل Šídák أو Dunnett ، حسب الاقتضاء. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Discussion
الألم الناجم عن التحفيز الميكانيكي غير الضار للوجه والغشاء المخاطي داخل الفم هو سمة بارزة لحالات آلام الفم والوجه ، بما في ذلك ألم العصب الثلاثي التوائم واضطرابات المفصل الصدغي الفكي24,25. على الرغم من أن ألم الاعتلال العصبي الثلاثي التوائم موصوف جيدا سريريا ، إلا أن تقييم سلوكيات مسبب للألم العصبي في القوارض يمثل تحديا. فحوصات الألم التي تقيس السلوكيات الانعكاسية هي الطرق الأكثر استخداما في أبحاث الألم قبل السريرية. ومع ذلك ، فإن اختبار الإجهاد المرتبط بالجهاز ، وعدم القدرة على تقييم الحالة العاطفية ، وتحيز المجرب يثير مخاوف بشأن فائدة وصحة المقايسات الانعكاسية26.
تقدم هذه الدراسة تقييم الحساسية الميكانيكية في منطقة الفم والوجه للفئران ، مما يدل على حساسيتها ل CCI-ION باستخدام اختبار الألم القائم على الفعالية. يمكن أيضا استخدام نفس النظام الفعال لاختبار الحساسية الميكانيكية للفئران. تجدر الإشارة إلى أن سلالات الفئران والجرذان يمكن أن تظهر تباينا في استجابتها ل CCI-ION ، وبالتالي ، يمكن أن تختلف مستويات فرط الحساسية الميكانيكية. بناء على تجربتنا ، عادة ما تتطور فئران Sprague-Dawley إلى فرط حساسية ميكانيكي مستقر بعد 2 أسابيع من CCI-ION ، وتبدأ في التعافي بعد 4 أسابيع من CCI-ION ، وبعد 6 أسابيع من CCI-ION ، نرى الشفاء من الجراحة.
في هذا البروتوكول ، تم قياس فرط الحساسية الميكانيكية عن طريق قياس عدد اللعقات وجهات الاتصال ، L / F ، والكمون إلى اللعق الأول. أظهرت البيانات أن CCI-ION أدى إلى انخفاض في L / F وعدد استجابات اللعق وزيادة في زمن الوصول إلى استجابة اللعق الأولى ، مما يشير إلى أن الحيوانات كانت غير راغبة في الضغط على وجوهها ضد القضبان المسننة بسبب زيادة حساسية آلام الفم والوجه.
OPAD هو اختبار صراع المكافأة حيث يجب على الحيوانات تحمل محفزات مسبب للألم للوصول إلى مكافأة مستساغة. يمكن أن يتأثر سلوك اللعق في الفحص بالسلوك الفاتح للشهية. بالإضافة إلى ذلك ، في هذه الدراسة ، استخدمنا الفئران التي لديها شعر الوجه. بناء على الخبرة السابقة في فحوصات الألم الفعالة ، بين القوارض ، تعتبر السلالات الخالية من الشعر أفضل للكشف عن ملامسات الوجه16 ؛ ومع ذلك ، في وقت النشر ، لم تعد سلالات الفئران الخالية من الشعر متاحة تجاريا. يمكن اعتبار هذا قيدا على الدراسة. نظرا لأننا استخدمنا أيضا إناث فئران Sprague-Dawley فقط ، فيجب توقع الاختلافات المرتبطة بالجنس والإجهاد في استجابات الألم.
هناك أيضا بعض الخطوات الحاسمة لضمان النتائج المثلى مع الفحص. يجب أن تظهر بيانات اللعق والاتصال الدقيقة ككتل حمراء وبيضاء صلبة في البرنامج المشار إليه ، على التوالي (انظر الشكل 3). المسافة بين المسامير وزجاجة الحليب أمر بالغ الأهمية لنجاح التجربة. إذا كان طرف زجاجة الحليب بعيدا جدا ، فلن يتصل الحيوان بالمسامير ، ولن يقوم البرنامج بتسجيل جهات الاتصال أو أرقام اللعق بشكل صحيح. على العكس من ذلك ، إذا كانت زجاجة الحليب بعيدة جدا ، تسجيل جهات الاتصال ، لكن الحيوان لن يتمكن من الوصول إلى الحليب. أثناء جلسات التدريب ، قد تظهر بيانات اللعق ككتل بيضاء صلبة ، حيث أن طرف زجاجة الحليب بعيد جدا للأمام. يتغير إلى كتل صلبة حمراء بمجرد دفع زجاجة الحليب للخلف. لسبب ما ، إذا بدأت بيانات اللعق في الظهور ككتل بيضاء من المسافة التي لوحظت ، فقد يساعد دفع الزجاجة قليلا وتحريك حامل الحليب لأسفل / لأعلى قليلا.
يمكن أيضا اعتبار عدة نقاط بمثابة قيود على نظام الألم الفموي الوجهي الموصوف هنا. تدريب القوارض ضروري ويستغرق أسابيع. قبل كل جلسة اختبار ، يكون تقييد الطعام ضروريا في الفئران ولكن ليس في الفئران. لقد ثبت أن الفئران غير الصائمة لديها أعداد لعق منخفضة وغير متسقة مقارنة بالفئران الصائمة27. نظرا لأن نظام OPAD هو نموذج صراع المكافأة ، فقد يتأثر بالسلوك الفاتح للشهية للحيوانات أو بدواء يؤثر على الشهية. يعد وجود أجهزة متعددة مفيدا أيضا لتقليل الوقت الإجمالي لاختبار الحيوانات ، مما قد يزيد من التكاليف. ومع ذلك ، لا تزال فحوصات الألم الفموية الوجهية مفيدة على المقايسات التقليدية القائمة على المنعكس ، لأنها تسمح باختبار متعددة في نفس الوقت وتحد من تفاعل الحيوانات مع المجربين.
التكييف الفعال أثناء حالات الألم يعدل سلوك الإنسان والحيوان وفقا لعواقبها28. لذلك ، يعد استخدام نموذج صراع المكافأة مفيدا لتقييم حالات الألم لأنه يسمح للحيوانات بأداء استجابات فعالة. هذا أكثر أهمية من الناحية السريرية لأن خصائص السلوكيات الفعالة تنطوي على النية والدافع ، وعادة ما تكون المعالجة القشرية29. عندما تقترب الحيوانات طواعية من زجاجة المكافأة ويمكنها الانسحاب بحرية من القضبان المسننة في أي وقت ، فإن هذا يدمج المراكز العليا للدماغ ويسمح بتقييم الحالات العاطفية التحفيزية المتعلقة بالألم10. وبالتالي ، توفر فحوصات الألم الفعالة بيانات فائقة عند تقييم الألم والمسكنات في الجسم الحي. كما أنها تساعد على فهم عمليات مسبب للألم في نظام مثلث التوائم ، وبالتالي المساهمة في تقدم مجال آلام الفم والوجه.
Disclosures
جون ك. نيوبرت وروبرت إم كودل هما مخترعو OPAD. شركة Stoelting هي الشركة المصنعة ل OPAD ، وريتشارد ميلز موظف في Stoelting. تم دفع رسوم النشر من قبل شركة Stoelting Co. Richard Mills و John K. Neubert و Robert M. Caudle هم المالكون السابقون ل Velocity Laboratories ، وهي شركة تقدم اختبارا سلوكيا مقابل الخدمة باستخدام فحوصات الألم الفعالة.
Acknowledgments
يتم تمويل هذه الدراسة من قبل مؤسسة أبحاث آلام الوجه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
| Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
| Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
| Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
| Dish sponge | ANY | ANY | |
| GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
| Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
| Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
| Oxygen tank | Medical | ||
| Paper towel | ANY | ANY | |
| Plastic food wrap | ANY | ANY | |
| Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
| Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
| Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
| Spoon | ANY | ANY | |
| Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
| Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
| Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |
References
- Dahlhamer, J., et al. Prevalence of chronic pain and high-impact chronic pain among adults - United States, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (36), 1001-1006 (2018).
- Ab del Shaheed, C., Maher, C. G., Williams, K. A., Day, R., McLachlan, A. J. Efficacy, tolerability, and dose-dependent effects of opioid analgesics for low back pain: A systematic review and meta-analysis. JAMA Internal Medicine. 176 (7), 958-968 (2016).
- Chou, R., et al. The effectiveness and risks of long-term opioid therapy for chronic pain: A systematic review for a National Institutes of Health Pathways to Prevention Workshop. Annals of Internal Medicine. 162 (4), 276-286 (2015).
- Vowles, K. E., et al. Rates of opioid misuse, abuse, and addiction in chronic pain: A systematic review and data synthesis. Pain. 156 (4), 569-576 (2015).
- Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 211, 39-50 (2012).
- Bove, G. Mechanical sensory threshold testing using nylon monofilaments: The pain field's "tin standard". Pain. 124 (1-2), 13-17 (2006).
- Negus, S. S. Core outcome measures in preclinical assessment of candidate analgesics. Pharmacological Reviews. 71 (2), 225-266 (2019).
- Vierck, C. J., Hansson, P. T., Yezierski, R. P. Clinical and pre-clinical pain assessment: Are we measuring the same thing. Pain. 135 (1-2), 7-10 (2008).
- Anderson, E. M., et al. Use of the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) to measure changes in nociceptive behavior. Journal of Visualized Experiments. (76), e50336 (2013).
- Murphy, N. P., Mills, R. H., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Operant assays for assessing pain in preclinical rodent models: Highlights from an orofacial assay. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 20, 121-145 (2014).
- Neubert, J. K., et al. Use of a novel thermal operant behavioral assay for characterization of orofacial pain sensitivity. Pain. 116 (3), 386-395 (2005).
- Neubert, J. K., Rossi, H. L., Malphurs, W., Vierck, C. J., Caudle, R. M. Differentiation between capsaicin-induced allodynia and hyperalgesia using a thermal operant assay. Behavioural Brain Research. 170 (2), 308-315 (2006).
- Kumada, A., et al. Intradermal injection of Botulinum toxin type A alleviates infraorbital nerve constriction-induced thermal hyperalgesia in an operant assay. Journal of Oral Rehabilitation. 39 (1), 63-72 (2012).
- Ma, F., Zhang, L., Lyons, D., Westlund, K. N. Orofacial neuropathic pain mouse model induced by Trigeminal Inflammatory Compression (TIC) of the infraorbital nerve. Molecular Brain. 5, 44 (2012).
- Deseure, K., Hans, G. H. Chronic constriction injury of the rat's infraorbital nerve (IoN-CCI) to study trigeminal neuropathic pain. Journal of Visualized Experiments. (103), e53167 (2015).
- Rohrs, E. L., et al. A novel operant-based behavioral assay of mechanical allodynia in the orofacial region of rats. Journal of Neuroscience Methods. 248, 1-6 (2015).
- Cha, M., Kohan, K. J., Zuo, X., Ling, J. X., Gu, J. G. Assessment of chronic trigeminal neuropathic pain by the orofacial operant test in rats. Behavioural Brain Research. 234 (1), 82-90 (2012).
- Zuo, X., Ling, J. X., Xu, G. Y., Gu, J. G. Operant behavioral responses to orofacial cold stimuli in rats with chronic constrictive trigeminal nerve injury: Effects of menthol and capsazepine. Molecular Pain. 9, 28 (2013).
- Nolan, T. A., Hester, J., Bokrand-Donatelli, Y., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Adaptation of a novel operant orofacial testing system to characterize both mechanical and thermal pain. Behavioural Brain Research. 217 (2), 477-480 (2011).
- Rossi, H. L., et al. Characterization of bilateral trigeminal constriction injury using an operant facial pain assay. Neuroscience. 224, 294-306 (2012).
- Ramirez, H. E., et al. Assessment of an orofacial operant pain assay as a preclinical tool for evaluating analgesic efficacy in rodents. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 426-432 (2015).
- Rossi, H. L., Vierck, C. J., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Characterization of cold sensitivity and thermal preference using an operant orofacial assay. Molecular Pain. 2, 37 (2006).
- Sapio, M. R., et al. Pain control through selective chemo-axotomy of centrally projecting TRPV1+ sensory neurons. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1657-1670 (2018).
- Lambru, G., Zakrzewska, J., Matharu, M. Trigeminal neuralgia: A practical guide. Practical Neurology. 21 (5), 392-402 (2021).
- Doshi, T. L., Nixdorf, D. R., Campbell, C. M., Raja, S. N. Biomarkers in temporomandibular disorder and trigeminal neuralgia: A conceptual framework for understanding chronic pain. Canadian Journal of Pain. 4 (1), 1-18 (2020).
- Sadler, K. E., Mogil, J. S., Stucky, C. L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nature Reviews Neuroscience. 23 (2), 70-85 (2022).
- Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular Pain. 4, 43 (2008).
- Vlaeyen, J. W. S. Learning to predict and control harmful events: Chronic pain and conditioning. Pain. 156, Suppl 1 86-93 (2015).
- Vierck, C. J. Animal studies of pain: Lessons for drug development. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. Campbell, J. C., et al. , IASP Press. Chapter 23 475-495 (2006).
