Summary
Questo protocollo descrive la valutazione dell'ipersensibilità meccanica in un modello di ratto di dolore orofacciale neuropatico utilizzando un dispositivo di valutazione del dolore orofacciale basato su operante.
Abstract
Il dolore ha componenti sensoriali e affettive. A differenza dei tradizionali test del dolore basati sul riflesso, i test del dolore operante possono produrre risultati clinicamente più rilevanti affrontando gli aspetti cognitivi e motivazionali del dolore nei roditori. Questo articolo presenta un protocollo per la valutazione dell'ipersensibilità meccanica a seguito di lesioni croniche da costrizione dei nervi infraorbitali (CCI-ION) nei ratti che utilizzano un sistema di dolore operante orofacciale. Prima della chirurgia CCI-ION, i ratti sono stati addestrati in un dispositivo di valutazione del dolore orofacciale (OPAD) a bere latte condensato zuccherato mentre entravano in contatto facciale con le barre chiodate metalliche e il tubo da leccare.
In questo test, i ratti possono scegliere tra ricevere latte come rinforzo positivo o sfuggire a uno stimolo meccanico avversivo prodotto da una fila verticale di piccole punte a forma di piramide su ciascun lato del foro di accesso alla ricompensa. Dopo 2 settimane di allenamento nell'OPAD e prima dell'intervento chirurgico CCI-ION, i dati di sensibilità meccanica al basale sono stati registrati per 5 giorni per ciascun ratto durante una sessione di test di 10 minuti. Durante una sessione, il sistema operativo registra automaticamente il numero di attivazioni della bottiglia di ricompensa (leccate) e i contatti facciali, la durata del contatto e la latenza alla prima leccata, tra le altre misure.
Dopo le misurazioni di base, i ratti sono stati sottoposti a CCI-ION o a interventi chirurgici fittizi. In questo protocollo, l'ipersensibilità meccanica è stata quantificata misurando il numero di leccate, la latenza alla prima leccata, il numero di contatti e il rapporto tra leccate e contatti facciali (L / F). I dati hanno mostrato che CCI-ION ha comportato una significativa diminuzione del numero di leccate e del rapporto L / F e un aumento della latenza al primo lick, indicando ipersensibilità meccanica. Questi dati supportano l'uso di saggi del dolore basati su operanti per valutare la sensibilità meccanica al dolore nella ricerca preclinica sul dolore.
Introduction
Il dolore cronico colpisce milioni di americani ogni anno1. Sfortunatamente, il dolore cronico è difficile da trattare, poiché le terapie esistenti sono relativamente inefficaci nel mitigare il dolore cronico e spesso hanno effetti collaterali indesiderati con l'uso a lungo termine 2,3,4. I tradizionali test preclinici del dolore, come il test di von Frey, si basano su esiti riflessivi o risposte stimolate dal dolore5. Mentre il saggio di von Frey è stato utilizzato per decenni per misurare l'allodinia meccanica, è suscettibile a diversi fattori confondenti, in particolare il bias dello sperimentatore6. L'uso del test di von Frey per valutare il dolore orofacciale è anche problematico a causa del grado di contenzione necessario per assicurare la testa dell'animale per testare con successo l'area del viso, che può produrre effetti indesiderati sullo stress, come aumentare il dolore o, al contrario, l'analgesia indotta dallo stress.
I comportamenti stimolati dal dolore sono anche suscettibili di risultati falsi positivi7 e non tengono conto della componente affettiva del dolore, che è parte integrante dell'esperienza del dolore umano8. Pertanto, vi è un crescente interesse nell'utilizzo di modelli di dolore operante che valutano i comportamenti depressi dal dolore che comprendono sia le componenti sensoriali che affettive del dolore per migliorare il contenuto e la validità predittiva nei test preclinici. Il test operante di valutazione del dolore orofacciale qui descritto si basa su un paradigma di ricompensa-conflitto 9,10,11. In questo test, il roditore può scegliere tra ricevere un rinforzo positivo e sottoporsi a uno stimolo nocicettivo o rinunciare alla ricompensa ed evitare lo stimolo nocicettivo, controllando così la quantità di dolore che prova. A differenza dei tradizionali test del dolore, il test basato sull'operante è indipendente dallo sperimentatore e non è suscettibile di risultati falsi positivi a causa di effetti sedativi spiacevoli.
Le sensazioni nocive dalla testa e dal viso sono trasportate dai rami oftalmici, mascellari e mandibolari del nervo trigemino. La lesione o l'infiammazione del nervo trigemino aumenta la sensibilità dei neuroni sensoriali agli stimoli termici o meccanici12,13,14,15. I saggi del dolore orofacciale basati su operanti forniscono una misurazione automatizzata del dolore orofacciale termico o meccanico trasmesso dal nervo trigemino nei roditori 11,12,16,17,18. La stimolazione con stimoli non nocivi e nocivi è un'importante distinzione tra testare l'allodinia termica e meccanica e l'iperalgesia nella regione orofacciale con l'OPAD, in quanto possono rappresentare manifestazioni di diversi meccanismi sottostanti.
Nel test termico orofacciale, gli animali premono il viso contro i termodi lisci per accedere alla ricompensa. I termodi possono essere impostati su varie temperature fredde, calde e calde, consentendo così la valutazione del comportamento in condizioni neutre o nocicettive. Nel saggio meccanico orofacciale, gli animali premono la faccia contro barre chiodate durante i test operanti; Poiché queste punte causano un certo livello di disagio, i roditori potrebbero bere meno quando i loro volti toccano le punte rispetto alle superfici lisce dei termodi. Pertanto, il saggio meccanico orofacciale operante può valutare l'effetto di vari gradi di stimolazione nocicettiva meccanica. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'OPAD è un metodo utile e affidabile per valutare la temperatura acuta9, così come la meccanica acuta19, la nocicezione e l'iperalgesia.
Questo documento riporta l'uso di una versione di nuova concezione dell'OPAD per valutare la nocicezione meccanica e l'ipersensibilità. Inoltre, a titolo di convalida, dimostriamo la capacità di CCI-ION di indurre neuropatia cronica che si traduce in una risposta prevedibile nell'OPAD. Inoltre, è dettagliato come utilizzare l'OPAD e il software associato per ottenere e analizzare rapidamente i dati comportamentali dei roditori.
Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Florida e sono conformi agli standard indicati nella Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Qui, la valutazione dell'ipersensibilità meccanica utilizzando l'OPAD è descritta utilizzando un modello di ratto di dolore orofacciale neuropatico. Uno schema della sequenza temporale utilizzata nello studio è mostrato nella Figura 1. Tutte le valutazioni comportamentali sono state eseguite da sperimentatrici donne.
1. Animali
- Ospita ratti Sprague-Dawley femmina (n = 8/gruppo, 150-200 g) in coppia in una stanza a temperatura controllata (22 °C ± 1 °C) con un ciclo luce-buio di 12 h:12 h. Fornire cibo e acqua ad libitum. Tenere i ratti nella struttura per 5 giorni per l'acclimatazione prima degli esperimenti.
- Eseguire i test del dolore operante lo stesso giorno della settimana e ora (9:00-11:00).
- Alla fine degli esperimenti, eutanasia i ratti per decapitazione dopo anestesia con isoflurano.
2. Istituzione dell'OPAD
- Posizionare vassoi antigoccia per il latte, gabbie in plexiglas e griglie metalliche per pavimenti sull'OPAD. Collegare il cablaggio alle gabbie. Far scivolare il portabottiglie sul palo metallico sul retro del dispositivo.
- Preparare un rapporto 2: 1 di acqua per latte condensato zuccherato come soluzione di ricompensa aprendo una lattina di latte condensato zuccherato e versandolo in un becher da 1 L. Aggiungere ~ 600 ml di acqua di rubinetto a 300 ml di latte. Inizialmente mescolare la soluzione usando un cucchiaio, quindi utilizzare una barra di agitazione e l'agitatore della piastra calda. Quindi, riempire i flaconi di ricompensa con la soluzione di latte e mantenere la soluzione di latte brodo a 4 °C.
NOTA: Coprire la soluzione di latte brodo con un involucro di plastica per alimenti. Riscaldare la soluzione di latte prima di ogni utilizzo. La soluzione di latte in frigo può coagulare dopo una settimana. Quando coagula, potrebbe occludere il tubo da leccare. Pertanto, scartarlo e preparare una nuova soluzione madre. - Posizionare le bottiglie di latte di ricompensa sul portabottiglie e regolarle in modo che il beccuccio possa essere raggiunto dall'animale. Stringere la manopola sul lato sinistro del supporto per fissare il flacone in posizione.
- Accendere le gabbie utilizzando l'interruttore sul pannello frontale.
3. Impostazione di un protocollo e creazione di un file di esperimento
NOTA: innanzitutto impostare il protocollo per eseguire l'esperimento. Il protocollo descrive come il software ANY-maze esegue l'esperimento.
- Aprire il software. Digitare la password. Fai clic su Accedi o premi Invio.
- Fai clic su Nuovo esperimento vuoto | Menu Protocollo .
- Selezionare la modalità che questo protocollo utilizzerà e assegnare un nome al protocollo. In Apparatus, fare clic su Unnamed Protocol, fare clic sulla sezione Selezionare la modalità che questo protocollo utilizzerà e, in Modalità specifiche dell'apparecchiatura, selezionare Modalità gabbia meccanica OPAD e fare clic su OK. Quindi, assegnare un nome al protocollo (ad esempio, OPAD meccanico).
- Aggiungi gabbie OPAD.
- In Apparatus, fare clic su Apparatus | Aggiungi elemento nella parte superiore del riquadro Protocollo | Nuovo | a gabbia OPAD Aggiungi tutte le gabbie OPAD collegate.
NOTA: prima di aggiungere le gabbie, assicurarsi che tutte le gabbie siano accese.
- In Apparatus, fare clic su Apparatus | Aggiungi elemento nella parte superiore del riquadro Protocollo | Nuovo | a gabbia OPAD Aggiungi tutte le gabbie OPAD collegate.
- Aggiungere fasi di test dell'esperimento.
- In Test fare clic su Fasi | Primo stadio e nome Stadio (ad esempio, Giorno di base 1). Digitare 10 min per la durata del test. Per aggiungere altre fasi, fare clic su Aggiungi elemento nella parte superiore del riquadro Protocollo | Nuovo palcoscenico.
NOTA: Ogni fase si riferisce alla sessione in cui viene eseguito un test. Ad esempio, per 10 giorni di allenamento, sono necessarie 10 fasi. La durata del test può essere aumentata o diminuita in base al disegno sperimentale.
- In Test fare clic su Fasi | Primo stadio e nome Stadio (ad esempio, Giorno di base 1). Digitare 10 min per la durata del test. Per aggiungere altre fasi, fare clic su Aggiungi elemento nella parte superiore del riquadro Protocollo | Nuovo palcoscenico.
- Assegnare gruppi di trattamento.
- In Ulteriori informazioni fare clic su Gruppi di trattamento. Seleziona Utilizzare gruppi di trattamento | L'utente assegnerà manualmente gli animali ai propri gruppi.
NOTA: Il software di riferimento (vedere la tabella dei materiali) consente anche di assegnare gli animali in modo casuale o in un ordine specifico. Gli esperimenti possono essere eseguiti alla cieca. Per visualizzare i gruppi di trattamento assegnati, deselezionare Esegui esperimenti alla cieca.
- In Ulteriori informazioni fare clic su Gruppi di trattamento. Seleziona Utilizzare gruppi di trattamento | L'utente assegnerà manualmente gli animali ai propri gruppi.
- Assegnare identificazioni degli animali (ID).
- Fare clic sul menu Protocollo ; in Informazioni aggiuntive, fai clic su ID animale e seleziona Usa i miei ID per fare riferimento agli animali.
- Fai clic sul menu Esperimento .
- Digita il titolo di un esperimento.
- Assegnare un nome ai trattamenti facendo clic su Visualizza trattamenti e digitare i nomi dei trattamenti (ad esempio, Trattamento 1: CCI-ION, Trattamento 2: fittizio).
- Aggiungi animali e assegna trattamenti e ID animali facendo clic su Visualizza animali | Aggiungere animali, immettere il numero di animali che verranno sottoposti a test e fare clic su OK. Attendi che appaia l'elenco degli animali e aggiungi ID animali e trattamenti per ogni ratto.
NOTA: all'inizio dello studio viene visualizzato un elenco di stato accanto all'ID animale. Gli animali possono essere successivamente rimossi dal programma di test modificando il loro stato in Ritirato o Cancellato.
- Salvare il protocollo facendo clic sul menu Protocollo | Salva protocollo nella parte superiore del riquadro Protocollo . Digitare il nome del file e la password del software (ANY-maze) e fare clic su Salva.
NOTA: i protocolli salvati possono essere riutilizzati per nuovi esperimenti. - Salvare il file dell'esperimento facendo clic su File | Salva, digitare la password del software e fare clic su Salva.
4. Sessioni di formazione e test di base
NOTA: Portare i ratti nella stanza almeno 15 minuti prima del test se la stanza dei test comportamentali si trova nella stessa struttura di stabulazione degli animali. Se vengono trasportati in una sala di prova al di fuori della struttura per animali, dare ai ratti 1 ora per acclimatarsi nella stanza.
- Prima delle registrazioni al basale, addestrare i ratti negli OPAD per 2 settimane (5 giorni alla settimana, 10 minuti al giorno) a premere le loro facce contro le barre chiodate metalliche per ricevere la soluzione di latte.
NOTA: Un'immagine rappresentativa delle barre chiodate e di un ratto che esegue il test è mostrata nella Figura 2. - Configurare l'apparecchiatura OPAD.
- Accendere le gabbie utilizzando l'interruttore sul pannello frontale. Cerca la luce verde sulla gabbia, il che significa che la gabbia è pronta per il test.
- Fai doppio clic sul file dell'esperimento salvato per aprirlo. Digitare la password. Fai clic su Accedi o premi Invio.
- Attendere che venga visualizzato il menu Test . Sul lato sinistro dello schermo, prendi nota del numero di animali e della gabbia corrispondente (ad esempio, l'animale 1 sarà testato nella gabbia 1), la fase che verrà eseguita in quel giorno e lo stato del test ("pronto"). Sul lato destro dello schermo, osserva il grafico di ciascun animale che mostra il numero di leccate e contatti.
- Osservare lo schermo delle gabbie che visualizza l'ID dell'animale da testare. Posizionare ogni topo nella gabbia corrispondente e premere due volte il pulsante sulla gabbia. Si noti che la luce verde si trasformerà in una luce arancione una volta avviato il test e verrà emesso un suono di avviso al termine della sessione di test.
- Per i primi 2 giorni di allenamento, posizionare completamente le bottiglie di latte nella gabbia per consentire ai ratti di bere latte senza contattare lo stimolo.
- Nei giorni 3-8 di addestramento, una volta che gli animali iniziano a bere, spostare progressivamente le bottiglie all'indietro per incoraggiare i ratti a premere la faccia contro le barre chiodate.
- Nei giorni 9-10 di allenamento, una volta che gli animali premono completamente contro le barre chiodate e i numeri di leccatura sono coerenti (un minimo di 500 leccate durante le sessioni di test di 10 minuti), annotare la posizione della bottiglia di latte per ciascun animale e utilizzare questa distanza per le registrazioni di base.
- Dopo 2 settimane di allenamento, raccogliere i dati dalla distanza indicata del biberon per 5 giorni come linea di base (10 min/giorno).
5. Induzione del dolore neuropatico orofacciale e valutazione dell'ipersensibilità meccanica
NOTA: Dopo le misurazioni basali, i ratti sono stati sottoposti a chirurgia CCI-ION, che ha comportato la legatura bilaterale dello ION, come descritto in precedenza20. I ratti di controllo hanno subito un intervento chirurgico fittizio. Nessuna analgesia pre o post-operatoria è stata utilizzata nella procedura in quanto può modificare il decorso temporale della neuropatia. ATTENZIONE: L'isoflurano di scarto deve essere recuperato attraverso contenitori di carbone. Le lame e gli aghi di bisturi devono essere smaltiti nei rifiuti a rischio biologico.
- Anestetizzare il ratto nella camera di induzione con una miscela di O2 (1 L/min) e isoflurano al 4% e mantenere lo stato anestetico con un cono nasale specializzato per tutta la durata dell'intervento.
- Posizionare il ratto anestetizzato su un banco di lavoro chirurgico e trattenerlo. Mantenere la temperatura corporea a 37 °C utilizzando un termoforo. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per evitare che si secchino. Controllare la profondità dell'anestetico pizzicando la punta e avviare la procedura quando il riflesso di ritiro della punta non viene più osservato.
- Eseguire la procedura chirurgica al microscopio stereo. Apri la bocca usando i divaricatori e ritrai il labbro usando una piccola clip.
- Fai una piccola incisione tra la gengiva dorsale e il labbro usando una lama di bisturi (# 15). Tagliare delicatamente i tessuti molli usando la punta della lama del bisturi per rivelare un ramo dello ION.
- Posizionare due legature dell'intestino cromico (# 5-0) attorno allo ION usando un ago da siringa smussato e piegato.
- Chiudere la ferita usando un adesivo per tessuti.
- Per la finta chirurgia, esporre lo ION usando la stessa procedura ma non legare il nervo.
- Dopo l'intervento chirurgico, fornire latte ammorbidito roditore chow per 2 giorni per incoraggiare a mangiare e prevenire la disidratazione.
- Testare i ratti nell'OPAD il giorno dopo l'intervento chirurgico per 3 giorni consecutivi e poi 3 giorni / settimana (ad esempio, ogni martedì, giovedì e venerdì) per le settimane successive fino a quando i numeri di leccata raggiungono i loro valori basali.
NOTA: La durata della sensibilità meccanica indotta da CCI-ION può dipendere dal sesso, dal ceppo del roditore utilizzato e dalle prestazioni dello sperimentatore. Pertanto, potrebbe non essere accurato indicare una certa durata per testare gli animali. Quindi, il test fino a quando i numeri lick raggiungono i valori di base è più accurato.
6. Pulizia del dispositivo
- Al termine del test, esci dal software facendo clic sull'icona x nell'angolo in alto a destra e attendi che i dati vengano salvati automaticamente.
- Spegnere le gabbie utilizzando l'interruttore sul pannello frontale.
- Scollegare i fili dalle griglie metalliche del pavimento. Rimuovere e lavare i vassoi antigoccia del latte, le gabbie in plexiglas, le griglie metalliche per pavimenti e i portabottiglie con sapone per piatti. Metti tutto sullo stendino.
- Pulire le barre chiodate di metallo, il dispositivo di test e i banchi da laboratorio utilizzando alcol isopropilico al 70%.
NOTA: Gli strumenti devono essere maneggiati con cura. Utilizzare spazzole morbide durante la pulizia delle bottiglie di latte e dei tubi da leccare. Le attrezzature sporche possono portare all'accumulo di batteri.
7. Analisi dei dati
- Fare doppio clic sul file dell'esperimento per aprirlo.
- Fare clic sul menu Risultati . Seleziona quali misure (ad esempio, leccare, contattare) o i giorni di test da visualizzare.
- Fare clic su Testo o Grafico o Statistica nella parte superiore del pannello Risultati per visualizzare un rapporto di analisi testuale, grafico o statistico.
- Per visualizzare i dati grezzi, fare clic sul menu Dati . Fare clic su Salva nella parte superiore del pannello Dati per salvare i dati come foglio di calcolo oppure fare clic su Invia per riceverli tramite posta elettronica.
- Per modificare o aggiungere altre variabili da visualizzare, fai clic su Seleziona dati, seleziona le misure e fai clic su Visualizza foglio di calcolo.
- Analisi statistica
- Deriva automaticamente il numero di lick e contatti e la latenza al primo lick dal software ed esporta i dati dal software in un foglio di calcolo.
- Calcola il rapporto L/F come indice di ipersensibilità dividendo il numero di leccate per il numero di contatti21,22,23.
NOTA: In questo studio, uno dei ratti nel gruppo sham è stato escluso dallo studio a causa del basso numero di leccate (<500 leccate) prima dell'intervento chirurgico. - Analizzare la significatività statistica delle differenze tra L/F, il numero di leccate e i contatti e la latenza al primo lick tramite misure ripetute bidirezionali ANOVA seguite dai confronti multipli di Dunnett o dai test di confronto multiplo di Šídák ove appropriato.
NOTA: P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. I dati sono stati presentati come errore medio ± standard della media (SEM).
Representative Results
Un esempio di leccate di un singolo ratto sulla bottiglia di ricompensa e contatti con le barre chiodate metalliche al basale e 2 settimane, 4 settimane e 6 settimane dopo l'intervento chirurgico è presentato nella Figura 3. Durante i periodi non nocivi, i ratti hanno generalmente lunghe sessioni di bere (ad esempio, al basale e al recupero dopo CCI-ION: settimana 6 nell'immagine) e, dopo CCI-ION, il numero di leccate diminuisce in quanto non possono mantenere il contatto facciale con le barre chiodate per una lunga durata (Figura 3A), senza cambiamenti significativi nei periodi di bere nel gruppo sham (Figura 3B).
I ratti con CCI-ION hanno avuto una significativa diminuzione del numero di leccate fino a 4 settimane dopo l'intervento chirurgico e un aumento della latenza alla prima leccata nella settimana chirurgica (settimana 0) e 1 settimana dopo l'intervento chirurgico rispetto al basale. Non c'è stato alcun cambiamento significativo nel gruppo fittizio (Figura 4A,B). CCI-ION ha prodotto una diminuzione del numero di contatti, ma questa differenza non è stata significativa (Figura 4C). CCI-ION ha anche causato una diminuzione significativa del gruppo L / F, e la diminuzione per il gruppo CCI-ION è stata maggiore della diminuzione per il gruppo sham (Figura 4D).
Questi risultati indicano che, seguendo CCI-ION, i ratti mostrano meno comportamento di consumo di latte di ricompensa, e ci vuole un po 'di tempo per fare la prima leccata, indicando un comportamento nocifensivo. Tuttavia, CCI-ION non influisce sul loro desiderio di raggiungere il latte. Inoltre, la diminuzione di L/F dei ratti con CCI-ION indica ipersensibilità meccanica, poiché L/F è maggiore in condizioni non dolorose.
Figura 1: Rappresentazione schematica del disegno dello studio. Abbreviazioni: OPAD = dispositivo di valutazione del dolore orofacciale; CCI-ION = lesione cronica da costrizione dei nervi infraorbitali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagine rappresentativa delle barre chiodate e di un ratto che esegue il test. Le barre chiodate sono realizzate in metallo inossidabile. La lunghezza dell'intera barra è di 7 cm. L'altezza delle punte è di 0,3 cm. La distanza tra le punte è di 0,5 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Tentativi di contatto rappresentativi e dati di leccamento di un singolo ratto CCI-ION e sham-operated durante la sessione di test standard di 10 minuti al basale e 2 settimane, 4 settimane e 6 settimane dopo l'intervento chirurgico. Abbreviazioni: CCI-ION = lesione cronica da costrizione dei nervi infraorbitali; AS = dopo l'intervento chirurgico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Sviluppo di ipersensibilità meccanica dopo CCI-ION nei ratti Sprague-Dawley. (A) I ratti con CCI-ION (n = 8) hanno avuto una significativa diminuzione del numero di leccate fino a 4 settimane dopo l'intervento chirurgico e (B) un aumento della latenza alla prima leccata alla settimana chirurgica (settimana 0) e 1 settimana dopo l'intervento chirurgico (**p < 0,01, *p < 0,05: dopo le settimane chirurgiche rispetto al basale. #p < 0,05: CCI-ION contro sham). Non c'è stata alcuna diminuzione significativa nel gruppo sham (n = 7, p > 0,05). (C) CCI-ION o chirurgia fittizia non ha prodotto alcun cambiamento significativo nel numero di contatti. (D) I ratti con CCI-ION hanno mostrato una significativa diminuzione di L/F nella settimana chirurgica e 3 settimane dopo e hanno mostrato una tendenza decrescente 2 settimane dopo l'intervento. Rispetto ai ratti del gruppo fittizio, questa diminuzione è stata significativamente più alta nei ratti CCI-ION ed è iniziata 1 settimana dopo l'intervento chirurgico ed è continuata fino a 3 settimane dopo l'intervento. Non c'era alcuna differenza significativa nel gruppo sham (**p < 0,01, *p < 0,05: dopo settimane chirurgiche rispetto al basale. # p < 0,05: CCI-ION vs. sham). Nei grafici, la linea rossa rappresenta il gruppo CCI-ION e la linea blu rappresenta il gruppo fittizio. I dati sono presentati come media ± SEM. Le differenze significative sono state analizzate mediante misure ripetute bidirezionali ANOVA seguite da test di confronto multiplo di Šídák o Dunnett, a seconda dei casi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussion
Il dolore innescato da innocua stimolazione meccanica del viso e della mucosa intraorale è una caratteristica importante delle condizioni di dolore orofacciale, tra cui nevralgia del trigemino e disturbi dell'articolazione temporo-mandibolare24,25. Sebbene il dolore neuropatico del trigemino sia clinicamente ben descritto, la valutazione dei comportamenti nocicettivi neuropatici nei roditori è impegnativa. I saggi del dolore che misurano i comportamenti riflessivi sono i metodi più frequentemente utilizzati nella ricerca preclinica sul dolore. Tuttavia, lo stress correlato all'apparato di test, l'incapacità di valutare lo stato affettivo e il pregiudizio dello sperimentatore sollevano preoccupazioni riguardo all'utilità e alla validità dei saggi riflessi26.
Questo studio introduce la valutazione della sensibilità meccanica nella regione orofacciale dei ratti, dimostrando la sua sensibilità a CCI-ION utilizzando un test del dolore basato su operante. Lo stesso sistema operante può essere utilizzato anche per testare la sensibilità meccanica dei topi. Va notato che i ceppi di topo e ratto possono mostrare variazioni nella loro risposta a CCI-ION e, quindi, i livelli di ipersensibilità meccanica possono differire. Sulla base della nostra esperienza, i ratti Sprague-Dawley sviluppano tipicamente un'ipersensibilità meccanica stabile 2 settimane dopo CCI-ION, iniziano a recuperare 4 settimane dopo CCI-ION e, dopo 6 settimane di CCI-ION, vediamo il recupero dall'intervento chirurgico.
In questo protocollo, l'ipersensibilità meccanica è stata quantificata misurando il numero di leccate e i contatti, L / F e la latenza al primo lick. I dati hanno dimostrato che CCI-ION ha provocato diminuzioni di L / F e del numero di risposte di leccamento e aumenti della latenza alla prima risposta di leccata, indicando che gli animali non erano disposti a premere i loro volti contro le barre chiodate a causa della maggiore sensibilità al dolore orofacciale.
OPAD è un test di ricompensa-conflitto in cui gli animali devono sopportare stimoli nocicettivi per accedere a una ricompensa appetibile. Il comportamento di leccare nel test potrebbe essere influenzato dal comportamento appetitivo. Inoltre, in questo studio, abbiamo usato ratti che avevano peli facciali. Sulla base di precedenti esperienze con i saggi del dolore operante, tra i roditori, i ceppi glabri sono migliori per rilevare i contatti facciali16; Tuttavia, al momento della pubblicazione, i ceppi di ratti glabri non erano più disponibili in commercio. Questo può essere considerato un limite dello studio. Poiché abbiamo utilizzato solo ratti Sprague-Dawley femmina, dovrebbero essere previste differenze legate al sesso e allo sforzo nelle risposte al dolore.
Ci sono anche alcuni passaggi critici per garantire risultati ottimali con il test. I dati accurati di lick e contatto devono apparire rispettivamente come blocchi rossi e bianchi solidi nel software di riferimento (vedere la Figura 3). La distanza tra le punte e la bottiglia di latte è cruciale per il successo dell'esperimento. Se la punta della bottiglia del latte è troppo in avanti, l'animale non entrerà in contatto con le punte e il software non registrerà correttamente i contatti o leccherà i numeri. Al contrario, se la bottiglia del latte è troppo indietro, i contatti si registreranno, ma l'animale non sarà in grado di raggiungere il latte. Durante le sessioni di allenamento, i dati di lick potrebbero apparire come blocchi bianchi solidi, poiché la punta della bottiglia del latte è troppo in avanti. Si trasforma in blocchi solidi rossi una volta che la bottiglia di latte viene spinta all'indietro. Per qualche ragione, se i dati di lick iniziano ad apparire come blocchi bianchi dalla distanza che è stata notata, spingere leggermente la bottiglia e spostare leggermente il supporto del latte verso il basso / verso l'alto potrebbe aiutare.
Diversi punti potrebbero anche essere considerati come limitazioni del sistema di dolore operante orofacciale qui descritto. La formazione dei roditori è necessaria e richiede settimane. Prima di ogni sessione di test, la restrizione alimentare è necessaria nei topi ma non nei ratti. I topi non a digiuno hanno dimostrato di avere numeri di leccate bassi e incoerenti rispetto ai topi a digiuno27. Poiché il sistema OPAD è un modello di ricompensa-conflitto, potrebbe essere influenzato dal comportamento appetitivo degli animali o da un farmaco che influenza l'appetito. Avere più apparecchiature è anche vantaggioso per ridurre il tempo complessivo per testare gli animali, il che potrebbe aumentare i costi. Tuttavia, i test del dolore operante orofacciale sono ancora vantaggiosi rispetto ai test convenzionali basati sui riflessi, in quanto consentono di testare più animali contemporaneamente e limitano l'interazione animale-sperimentatore.
Il condizionamento operante durante gli stati di dolore modifica il comportamento umano e animale in base alle loro conseguenze28. L'utilizzo di un modello di ricompensa-conflitto è, quindi, vantaggioso per valutare le condizioni di dolore perché consente agli animali di eseguire risposte operative. Questo è clinicamente più rilevante perché le caratteristiche dei comportamenti operanti coinvolgono l'intenzione, la motivazione e, tipicamente, l'elaborazione corticale29. Poiché gli animali si avvicinano volontariamente alla bottiglia della ricompensa e possono ritirarsi liberamente dalle barre chiodate in qualsiasi momento, questo integra i centri superiori del cervello e consente la valutazione degli stati affettivo-motivazionali correlati al dolore10. Pertanto, i saggi del dolore operante forniscono dati superiori nella valutazione del dolore e degli analgesici in vivo. Aiutano anche a comprendere i processi nocicettivi nel sistema trigemino, contribuendo così all'avanzamento del campo del dolore orofacciale.
Disclosures
John K. Neubert e Robert M. Caudle sono gli inventori dell'OPAD. Stoelting Co. è il produttore dell'OPAD e Richard Mills è un dipendente di Stoelting. La tassa di pubblicazione è stata pagata da Stoelting Co. Richard Mills, John K. Neubert e Robert M. Caudle sono i precedenti proprietari di Velocity Laboratories, una società che fornisce test comportamentali a pagamento utilizzando saggi del dolore operanti.
Acknowledgments
Questo studio è finanziato dalla Facial Pain Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
| Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
| Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
| Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
| Dish sponge | ANY | ANY | |
| GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
| Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
| Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
| Oxygen tank | Medical | ||
| Paper towel | ANY | ANY | |
| Plastic food wrap | ANY | ANY | |
| Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
| Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
| Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
| Spoon | ANY | ANY | |
| Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
| Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
| Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |
References
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