Summary
Detta protokoll beskriver bedömningen av mekanisk överkänslighet i en råttmodell av neuropatisk orofacial smärta med hjälp av en operantbaserad orofacial smärtbedömningsanordning.
Abstract
Smärta har sensoriska och affektiva komponenter. Till skillnad från traditionella, reflexbaserade smärtanalyser kan operanta smärtanalyser ge mer kliniskt relevanta resultat genom att ta itu med de kognitiva och motiverande aspekterna av smärta hos gnagare. Detta dokument presenterar ett protokoll för bedömning av mekanisk överkänslighet efter kronisk förträngningsskada i de infraorbitala nerverna (CCI-ION) hos råttor med hjälp av ett orofacialt operant smärtsystem. Före CCI-ION-operationen utbildades råttor i en orofacial smärtbedömningsanordning (OPAD) för att dricka sötad kondenserad mjölk medan de fick ansiktskontakt med metallspetsstängerna och slickröret.
I denna analys kan råttor välja mellan att ta emot mjölk som en positiv förstärkare eller fly från en aversiv mekanisk stimulans som produceras av en vertikal rad med små pyramidformade spikar på varje sida av belöningsåtkomsthålet. Efter 2 veckors träning i OPAD och före CCI-ION-operationen registrerades grundläggande mekaniska känslighetsdata i 5 dagar för varje råtta under en 10 minuters testsession. Under en session registrerar operantsystemet automatiskt antalet belöningsflaskaktiveringar (slickar) och ansiktskontakter, kontaktlängd och latens till den första slickningen, bland andra åtgärder.
Efter baslinjemätningar genomgick råttor antingen CCI-ION eller skenkirurgi. I detta protokoll kvantifierades mekanisk överkänslighet genom att mäta antalet slickar, latens till den första slickningen, antalet kontakter och förhållandet mellan slickar och ansiktskontakter (L / F). Data visade att CCI-ION resulterade i en signifikant minskning av antalet slickar och L / F-förhållandet och en ökning av latensen till den första slickningen, vilket indikerar mekanisk överkänslighet. Dessa data stöder användningen av operantbaserade smärtanalyser för att bedöma mekanisk smärtkänslighet i preklinisk smärtforskning.
Introduction
Kronisk smärta drabbar miljontals amerikaner årligen1. Tyvärr är kronisk smärta utmanande att behandla, eftersom befintliga terapier är relativt ineffektiva för att mildra kronisk smärta och ofta har oönskade biverkningar med långvarig användning 2,3,4. Traditionella prekliniska smärtanalyser, såsom von Frey-analysen, förlitar sig på reflexiva resultat eller smärtstimulerade svar5. Medan von Frey-analysen har använts i årtionden för att mäta mekanisk allodyni, är den mottaglig för flera förvirrande faktorer, särskilt experimenterbias6. Användningen av von Frey-testning för att utvärdera orofacial smärta är också problematisk på grund av graden av återhållsamhet som behövs för att säkra djurets huvud för att framgångsrikt testa ansiktsområdet, vilket kan ge oönskade stresseffekter, såsom att öka smärta eller omvänt stressinducerad analgesi.
Smärtstimulerade beteenden är också mottagliga för falskt positiva resultat7 och tar inte hänsyn till den affektiva komponenten av smärta, som är integrerad i den mänskliga smärtupplevelsen8. Därför finns det ett växande intresse för att använda operanta smärtmodeller som bedömer smärtdeprimerade beteenden som omfattar både de sensoriska och affektiva komponenterna i smärta för att förbättra innehållet och prediktiv validitet i preklinisk testning. Den operant orofaciala smärtbedömningsanalysen som beskrivs här är baserad på ett belöningskonfliktparadigm 9,10,11. I denna analys kan gnagaren välja mellan att ta emot en positiv förstärkare och utsätta sig för en nociceptiv stimulans eller avstå från belöningen och undvika den nociceptiva stimulansen och därigenom kontrollera mängden smärta den upplever. Till skillnad från traditionella smärtanalyser är den operantbaserade analysen experimentoberoende och är inte mottaglig för falskt positiva resultat på grund av obehagliga lugnande effekter.
Skadliga känslor från huvudet och ansiktet bärs av de oftalmiska, maxillära och mandibulära grenarna i trigeminusnerven. Skada eller inflammation i trigeminusnerven ökar känsligheten hos sensoriska neuroner för termiska eller mekaniska stimuli12,13,14,15. Operantbaserade orofaciala smärtanalyser ger en automatiserad mätning av termisk eller mekanisk orofacial smärta som överförs av trigeminusnerven hos gnagare 11,12,16,17,18. Stimulering med icke-skadliga och skadliga stimuli är en viktig skillnad mellan testning av termisk och mekanisk allodyni och hyperalgesi i orofacialregionen med OPAD, eftersom de kan representera manifestationer av olika underliggande mekanismer.
I den orofaciala termiska analysen pressar djuren ansiktet mot släta termoder för att komma åt belöningen. Termoderna kan ställas in på olika svala, varma och heta temperaturer, vilket möjliggör bedömning av beteende under neutrala eller nociceptiva förhållanden. I den orofaciala mekaniska analysen trycker djuren ansiktet mot spikade stänger under operanttestning; Eftersom dessa spikar orsakar en viss nivå av obehag kan gnagare dricka mindre när deras ansikten rör vid spikarna kontra termodernas släta ytor. Således kan den operanta orofaciala mekaniska analysen bedöma effekten av varierande grader av mekanisk nociceptiv stimulering. Vi har tidigare visat att OPAD är en användbar och pålitlig metod för att bedöma akut termisk9, samt akut mekanisk19, nociception och hyperalgesi.
Detta dokument rapporterar användningen av en nyutvecklad version av OPAD för att bedöma mekanisk nociception och överkänslighet. Dessutom visar vi genom validering förmågan hos CCI-ION att inducera kronisk neuropati som resulterar i ett förutsägbart svar i OPAD. Också detaljerat är hur man använder OPAD och dess tillhörande programvara för att snabbt få och analysera gnagare beteendedata.
Protocol
Alla experimentella förfaranden godkändes av University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee och uppfyllde de standarder som anges i National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur. Här beskrivs bedömningen av mekanisk överkänslighet med hjälp av OPAD med hjälp av en råttmodell av neuropatisk orofacial smärta. Ett schema över tidslinjen som används i studien visas i figur 1. Alla beteendebedömningar utfördes av kvinnliga experimenter.
1. Djur
- Hushonråttor av typen Sprague-Dawley (n = 8/grupp, 150-200 g) i par i ett temperaturkontrollerat rum (22 °C ± 1 °C) med en ljus-mörk cykel på 12 h:12 h. Ge mat och vatten ad libitum. Håll råttorna i anläggningen i 5 dagar för acklimatisering före experimenten.
- Utför operant smärtanalyser på samma veckodag och tid (9-11).
- I slutet av experimenten avlivas råttorna genom halshuggning efter isoflurananestesi.
2. Ställa in OPAD
- Placera mjölkdroppbrickor, plexiglasburar och metallgolvgaller på OPAD. Fäst ledningar i burarna. Skjut flaskhållaren på metallstången på baksidan av enheten.
- Förbered ett förhållande 2: 1 mellan vatten och sötad kondenserad mjölk som belöningslösning genom att öppna en burk sötad kondenserad mjölk och hälla den i en 1 L bägare. Tillsätt ~ 600 ml kranvatten till 300 ml mjölk. Rör först lösningen med en sked och använd sedan en omrörningsstång och varmplåtsomröraren. Fyll sedan belöningsflaskorna med mjölklösningen och förvara stammjölkslösningen vid 4 °C.
OBS: Täck lagermjölkslösningen med plastfolie. Värm mjölklösningen före varje användning. Lager mjölklösning i kylskåpet kan koagulera efter en vecka. När det koagulerar kan det ockludera slickröret. Kassera därför den och förbered en ny stamlösning. - Placera belöningsmjölkflaskorna på flaskhållaren och justera dem så att pipen kan nås av djuret. Dra åt hållarens vänstra vred för att säkra flaskan på plats.
- Slå på burarna med strömbrytaren på frontpanelen.
3. Ställa in ett protokoll och skapa en experimentfil
Konfigurera först protokollet för att köra experimentet. Protokollet beskriver hur ANY-maze-programvaran utför experimentet.
- Öppna programvaran. Skriv lösenordet. Klicka på Logga in mig eller tryck på Enter.
- Klicka på Nytt tomt experiment | Protokoll-menyn .
- Välj det läge som detta protokoll ska använda och namnge protokollet. Under Apparat klickar du på Namnlöst protokoll, klickar på avsnittet Välj det läge som detta protokoll ska använda och under Utrustningsspecifika lägen väljer du OPAD mekaniskt burläge och klickar på OK. Namnge sedan protokollet (t.ex. OPAD-mekaniskt).
- Lägg till OPAD-burar.
- Under Apparat klickar du på Apparat | Lägg till objekt som finns högst upp i fönstret Protokoll | Ny OPAD-bur | Lägg till alla anslutna OPAD-burar.
OBS: Innan du lägger till burarna, se till att alla burar är påslagna.
- Under Apparat klickar du på Apparat | Lägg till objekt som finns högst upp i fönstret Protokoll | Ny OPAD-bur | Lägg till alla anslutna OPAD-burar.
- Lägg till experimentteststeg.
- Under Testning klickar du på Steg | Första etappen och namnstadiet (t.ex. baslinjedag 1). Typ 10 min för testets varaktighet. Om du vill lägga till fler steg klickar du på Lägg till objekt högst upp i fönstret Protokoll | Ny scen.
OBS: Varje steg hänvisar till sessionen när en analys utförs. Till exempel, för 10 dagars träning behövs 10 steg. Testets varaktighet kan ökas eller minskas baserat på den experimentella designen.
- Under Testning klickar du på Steg | Första etappen och namnstadiet (t.ex. baslinjedag 1). Typ 10 min för testets varaktighet. Om du vill lägga till fler steg klickar du på Lägg till objekt högst upp i fönstret Protokoll | Ny scen.
- Tilldela behandlingsgrupper.
- Under Ytterligare information klickar du på Behandlingsgrupper. Kontrollera Använd behandlingsgrupper | Användaren tilldelar djuren manuellt till sina grupper.
OBS: Den refererade programvaran (se materialförteckningen) gör det också möjligt att tilldela djur slumpmässigt eller i en viss ordning. Experiment kan köras blinda. Om du vill se de tilldelade behandlingsgrupperna avmarkerar du Kör experiment blinda.
- Under Ytterligare information klickar du på Behandlingsgrupper. Kontrollera Använd behandlingsgrupper | Användaren tilldelar djuren manuellt till sina grupper.
- Tilldela djuridentifikationer (ID).
- Klicka på protokollmenyn; under Ytterligare information klickar du på Djur-ID och markerar Använd mina ID:n för att referera till djur.
- Klicka på experimentmenyn.
- Skriv en experimentrubrik.
- Namnge behandlingarna genom att klicka på Visa behandlingar och skriv in behandlingsnamnen (t.ex. Behandling 1: CCI-ION, Behandling 2: bluff).
- Lägg till djur och tilldela behandlingar och djur-ID genom att klicka på Visa djur | Lägg till djur, ange antalet djur som ska testas och klicka på OK. Vänta tills listan över djur visas och lägg till djur-ID och behandlingar för varje råtta.
OBS: En statuslista som visas bredvid djur-ID kommer att ställas in på Normal i början av studien. Djur kan senare tas bort från testschemat genom att ändra deras status till antingen Tillbakadragen eller Borttagen.
- Spara protokollet genom att klicka på Protokoll-menyn | Spara protokoll som finns högst upp i fönstret Protokoll . Skriv Filnamn och programvarans (ANY-maze) lösenord och klicka på Spara.
Sparade protokoll kan återanvändas för nya experiment. - Spara experimentfilen genom att klicka på Arkiv | Spara, skriv programvarulösenordet och klicka på Spara.
4. Utbildnings- och baslinjetestsessioner
OBS: Ta med råttor till rummet minst 15 min före testet om beteendetestrummet ligger på samma djurhållningsanläggning. Om de transporteras till ett testrum utanför djuranläggningen, ge råttorna 1 h att acklimatisera sig till rummet.
- Innan baslinjeinspelningar, träna råttorna i OPAD: erna i 2 veckor (5 dagar / vecka, 10 min / dag) för att trycka sina ansikten mot metallspetsstängerna för att få mjölklösningen.
OBS: En representativ bild av spikade staplar och en råtta som utför analysen visas i figur 2. - Ställ in OPAD-utrustningen.
- Slå på burarna med strömbrytaren på frontpanelen. Leta efter grönt ljus på buret, vilket innebär att buret är redo att testa.
- Dubbelklicka på den sparade experimentfilen för att öppna. Skriv lösenordet. Klicka på Logga in mig eller tryck på Enter.
- Vänta tills testmenyn visas. På vänster sida av skärmen antecknar du antalet djur och motsvarande bur (t.ex. kommer djur 1 att testas i bur 1), scenen som kommer att köras den dagen och teststatusen ("klar"). På höger sida av skärmen, observera diagrammet för varje djur som visar antalet slickar och kontakter.
- Observera skärmen på burarna som visar ID för det djur som ska testas. Placera varje råtta i motsvarande bur och tryck två gånger på knappen på buret. Observera att det gröna ljuset förvandlas till ett orange ljus när testningen startar och ett varningsljud hörs när testsessionen är över.
- Under de första 2 dagarna av träningen, placera mjölkflaskor helt i buret så att råttorna kan dricka mjölk utan att komma i kontakt med stimulansen.
- På dag 3-8 av träning, när djuren börjar dricka, flytta flaskorna gradvis bakåt för att uppmuntra råttorna att trycka sina ansikten mot de spikade staplarna.
- På dag 9-10 av träningen, när djuren trycker helt mot de spikade stängerna och slicknumren är konsekventa (minst 500 slickar under testsessionerna på 10 minuter), notera platsen för mjölkflaskan för varje djur och använd detta avstånd för baslinjeinspelningar.
- Efter 2 veckors träning, samla in data från det noterade mjölkflaskavståndet i 5 dagar som baslinje (10 min / dag).
5. Induktion av orofacial neuropatisk smärta och utvärdering av mekanisk överkänslighet
OBS: Efter baslinjemätningar genomgick råttor CCI-ION-kirurgi, vilket involverade bilateral ligering av ION, som tidigare beskrivits20. Kontrollråttor opererades i skenoperationer. Ingen pre- eller postoperativ analgesi användes i proceduren eftersom det kan förändra neuropatins tidsförlopp. VARNING: Avfallsisofluran måste rensas genom kolbehållare. Skalpellblad och nålar måste kasseras i biologiskt farligt avfall.
- Bedöva råttan i induktionskammaren med en blandning avO2 (1 L/min) och 4% isofluran och bibehålla bedövningstillståndet med en specialiserad näskotte under hela operationen.
- Placera den bedövade råttan på en kirurgisk arbetsbänk och håll fast den. Håll kroppstemperaturen vid 37 °C med en värmedyna. Applicera oftalmisk salva på ögonen för att förhindra att de torkar ut. Kontrollera anestesidjupet genom att klämma på tån och starta proceduren när tåuttagsreflexen inte längre observeras.
- Utför det kirurgiska ingreppet under ett stereomikroskop. Öppna munnen med retraktorer och dra tillbaka läppen med ett litet klipp.
- Gör ett litet snitt mellan ryggmärget och läppen med ett skalpellblad (#15). Skär försiktigt bort mjukvävnad med hjälp av skalpellbladets spets för att avslöja en gren av JONEN.
- Placera två kroma tarmligaturer (#5-0) runt jonen med en trubbig, böjd sprutnål.
- Stäng såret med vävnadslim.
- För skenoperationen, exponera JON med samma procedur men ligera inte nerven.
- Efter operationen, ge mjölkmjukad gnagare chow i 2 dagar för att uppmuntra till att äta och förhindra uttorkning.
- Testa råttorna i OPAD dagen efter operationen i 3 dagar i följd och sedan 3 dagar / vecka (t.ex. varje tisdag, torsdag och fredag) under de följande veckorna tills slicknumren når sina baslinjevärden.
OBS: Varaktigheten av den CCI-ION-inducerade mekaniska känsligheten kan bero på kön, stammen hos den använda gnagaren och experimentörens prestanda. Det kan därför vara inte korrekt att ange en viss varaktighet för att testa djur. Därför är testning tills slicknummer når baslinjevärden mer exakt.
6. Rengöring av enheten
- När testningen är klar avslutar du programvaran genom att klicka på x-ikonen längst upp till höger och vänta tills data sparas automatiskt.
- Stäng av burarna med strömbrytaren på frontpanelen.
- Koppla ur ledningarna från metallgolvgallren. Ta bort och tvätta mjölkdroppbrickorna, plexiglasburarna, metallgolvgallren och flaskhållarna med diskmedel. Lägg allt på torkstället.
- Torka av metallspetsarna, testanordningen och labbbänkarna med 70% isopropylalkohol.
OBS: Instrumenten måste hanteras med försiktighet. Använd mjuka borstar när du rengör mjölkflaskorna och slickrören. Smutsig utrustning kan leda till bakterieuppbyggnad.
7. Analys av data
- Dubbelklicka på experimentfilen för att öppna den.
- Klicka på menyn Resultat . Välj vilka mått (dvs. slicka, kontakta) eller testdagar att se.
- Klicka på Text eller diagram eller Statistik högst upp på resultatpanelen om du vill visa en text-, diagram- eller statistisk analysrapport.
- För att se rådata, klicka på Data-menyn . Klicka på Spara högst upp på datapanelen om du vill spara data som ett kalkylblad eller klicka på Skicka om du vill ta emot dem via e-post.
- Om du vill ändra eller lägga till fler variabler att se klickar du på Välj data, markerar måtten och klickar på Visa kalkylblad.
- Statistisk analys
- Härled automatiskt antalet slicks och kontakter och latensen till den första slicken från programvaran och exportera data från programvaran till ett kalkylblad.
- Beräkna L/F-förhållandet som ett överkänslighetsindex genom att dividera antalet slickar med antalet kontakter21,22,23.
OBS: I denna studie uteslöts en av råttorna i bluffgruppen från studien på grund av lågt slicktal (<500 slickar) före operationen. - Analysera den statistiska signifikansen av skillnaderna mellan L/F, antalet slicks och kontakterna, och latensen till den första slicken via tvåvägs upprepade mätningar ANOVA följt av Dunnetts flera jämförelser eller Šídáks flera jämförelsetester där så är lämpligt.
OBS: P < 0,05 ansågs statistiskt signifikant. Data presenterades som medelvärde ± medelfel (SEM).
Representative Results
Ett exempel på en enda råttas slickar på belöningsflaskan och kontakter med metallspetsstängerna vid baslinjen och 2 veckor, 4 veckor och 6 veckor efter operationen presenteras i figur 3. Under de icke-skadliga perioderna har råttor i allmänhet långa sessioner av att dricka (t.ex. vid baslinjen och återhämtningen efter CCI-ION: vecka 6 i bilden), och efter CCI-ION minskar antalet slickningar eftersom de inte kan upprätthålla ansiktskontakt med de spikade staplarna under lång tid (figur 3A), utan några signifikanta förändringar i dricksperioderna i bluffgruppen (figur 3B).
Råttor med CCI-ION hade en signifikant minskning av antalet slickar fram till 4 veckor efter operationen och en ökning av latensen för att först slicka på operationsveckan (vecka 0) och 1 vecka efter operationen jämfört med baslinjen. Det fanns ingen signifikant förändring i skengruppen (figur 4A,B). CCI-ION gav en minskning av antalet kontakter, men denna skillnad var inte signifikant (figur 4C). CCI-ION orsakade också en signifikant minskning av L/F, och minskningen för CCI-ION-gruppen var större än minskningen för bluffgruppen (figur 4D).
Dessa resultat indikerar att råttor, efter CCI-ION, visar mindre belöningsmjölkdrickande beteende, och det tar dem ett tag att göra den första slicken, vilket indikerar ett nocifensivt beteende. CCI-ION påverkar dock inte deras önskan att nå mjölken. Dessutom indikerar minskningen av L / F hos råttor med CCI-ION mekanisk överkänslighet, eftersom L / F är högre under icke-smärtsamma tillstånd.
Figur 1: Schematisk representation av studiedesignen. Förkortningar: OPAD = enhet för bedömning av orofacial smärta; CCI-ION = kronisk förträngningsskada hos de infraorbitala nerverna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativ bild av spikade staplar och en råtta som utför analysen. Spikade stänger är gjorda av rostfritt stålmetall. Längden på hela stången är 7 cm. Spikarnas höjd är 0,3 cm. Avståndet mellan spikarna är 0,5 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa kontaktförsök och slickdata för en enda CCI-ION- och skenopererad råtta under standard 10 minuters testsession vid baslinjen och 2 veckor, 4 veckor och 6 veckor efter operationen. Förkortningar: CCI-ION = kronisk förträngningsskada hos de infraorbitala nerverna; AS = efter operationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Utveckling av mekanisk överkänslighet efter CCI-ION hos Sprague-Dawley-råttor. (A) Råttor med CCI-ION (n = 8) hade en signifikant minskning av slickantalet fram till 4 veckor efter operationen och (B) en ökning av latensen för att först slicka på operationsveckan (vecka 0) och 1 vecka efter operationen (** p < 0,01, * p < 0,05: efter operationsveckor jämfört med baslinjen. #p < 0,05: CCI-ION mot bluff). Det fanns ingen signifikant minskning i skengruppen (n = 7, p > 0, 05). (C) CCI-ION eller skenkirurgi gav ingen signifikant förändring i antalet kontakter. (D) Råttor med CCI-ION visade en signifikant minskning av L/F under operationsveckan och 3 veckor efter och uppvisade en minskande trend 2 veckor efter operationen. Jämfört med bluffgruppen råttor var denna minskning signifikant högre hos CCI-ION-råttor och började 1 vecka efter operationen och fortsatte till 3 veckor efter operationen. Det fanns ingen signifikant skillnad i skengruppen (**p < 0,01, *p < 0,05: efter operationsveckor jämfört med baslinjen. # p < 0,05: CCI-ION vs. sham). I diagrammen representerar den röda linjen CCI-ION-gruppen och den blå linjen representerar skengruppen. Uppgifterna presenteras som medelvärde ± SEM. Signifikanta skillnader analyserades med tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA följt av Šídáks eller Dunnetts flera jämförelsetester, beroende på vad som är lämpligt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Smärta som utlöses av oskyldig mekanisk stimulering av ansiktet och intraoral slemhinna är ett framträdande inslag i orofaciala smärttillstånd, inklusive trigeminusneuralgi och temporomandibulära ledsjukdomar24,25. Även om trigeminal neuropatisk smärta är kliniskt väl beskriven, är bedömningen av neuropatiska nociceptiva beteenden hos gnagare utmanande. Smärtanalyser som mäter reflexiva beteenden är de vanligaste metoderna inom preklinisk smärtforskning. Testning av apparatrelaterad stress, oförmågan att bedöma det affektiva tillståndet och experimenterbias väcker emellertid oro över användbarheten och giltigheten av reflexanalyser26.
Denna studie introducerar bedömningen av mekanisk känslighet i den orofaciala regionen hos råttor, vilket visar dess känslighet för CCI-ION med hjälp av en operantbaserad smärtanalys. Samma operantsystem kan också användas för att testa mössens mekaniska känslighet. Det bör noteras att mus- och råttstammar kan uppvisa variation i deras svar på CCI-ION, och därmed kan nivåerna av mekanisk överkänslighet skilja sig åt. Baserat på vår erfarenhet utvecklar Sprague-Dawley-råttor vanligtvis en stabil mekanisk överkänslighet 2 veckor efter CCI-ION, de börjar återhämta sig 4 veckor efter CCI-ION, och efter 6 veckors CCI-ION ser vi återhämtning från operationen.
I detta protokoll kvantifierades mekanisk överkänslighet genom att mäta antalet slickar och kontakterna, L / F och latens till den första slickningen. Data visade att CCI-ION resulterade i minskningar av L/F och antalet slickande svar och ökningar av latensen till det första slicksvaret, vilket indikerar att djur var ovilliga att trycka sina ansikten mot spikade stänger på grund av ökad orofacial smärtkänslighet.
OPAD är en belöningskonfliktanalys där djur måste uthärda nociceptiva stimuli för att få tillgång till en välsmakande belöning. Slickbeteende i analysen kan påverkas av aptitligt beteende. Dessutom använde vi i denna studie råttor som hade ansiktshår. Baserat på tidigare erfarenhet av operant smärtanalyser, bland gnagare, är hårlösa stammar bättre för att upptäcka ansiktskontakter16; Vid tidpunkten för publiceringen var dock hårlösa råttstammar inte längre kommersiellt tillgängliga. Detta kan betraktas som en begränsning av studien. Eftersom vi också bara använde kvinnliga Sprague-Dawley-råttor, bör köns- och stamrelaterade skillnader i smärtsvar förväntas.
Det finns också några kritiska steg för att säkerställa optimala resultat med analysen. Korrekta slick- och kontaktdata måste visas som heltäckande röda respektive vita block i den refererade programvaran (se figur 3). Avståndet mellan spikarna och mjölkflaskan är avgörande för experimentets framgång. Om mjölkflaskans spets är för långt framåt, kommer djuret inte att komma i kontakt med spikarna, och programvaran registrerar inte korrekt kontakter eller slicknummer. Omvänt, om mjölkflaskan är för långt tillbaka, kommer kontakter att registreras, men djuret kommer inte att kunna nå mjölken. Under träningspass kan slickdata visas som fasta vita block, eftersom mjölkflaskans spets är för långt framåt. Det ändras till röda fasta block när mjölkflaskan skjuts bakåt. Av någon anledning, om slickdata börjar visas som vita block från det avstånd som noterades, kan det hjälpa att trycka flaskan lite och flytta mjölkhållaren något nedåt / uppåt.
Flera punkter kan också betraktas som begränsningar av det orofaciala operanta smärtsystemet som beskrivs här. Träningen av gnagarna är nödvändig och tar veckor. Före varje testsession är matbegränsning nödvändig hos möss men inte hos råttor. Orakade möss har visat sig ha låga och inkonsekventa slicknummer jämfört med fastande möss27. Eftersom OPAD-systemet är en belöningskonfliktmodell kan det påverkas av djurens aptitliga beteende eller av ett läkemedel som påverkar aptiten. Att ha flera apparater är också fördelaktigt för att minska den totala tiden för att testa djuren, vilket kan öka kostnaderna. Orofacial operant smärtanalyser är dock fortfarande fördelaktiga jämfört med konventionella reflexbaserade analyser, eftersom de tillåter testning av flera djur samtidigt och begränsar interaktionen mellan djur och experiment.
Operant konditionering under smärttillstånd ändrar människors och djurs beteende enligt deras konsekvenser28. Att använda en belöningskonfliktmodell är därför fördelaktigt för att utvärdera smärttillstånd eftersom det gör det möjligt för djuren att utföra operanta svar. Detta är mer kliniskt relevant eftersom egenskaperna hos operant beteenden involverar avsikt, motivation och vanligtvis kortikal bearbetning29. När djur frivilligt närmar sig belöningsflaskan och fritt kan dra sig tillbaka från de spikade staplarna när som helst, integrerar detta högre centra i hjärnan och möjliggör utvärdering av de affektiva motivationstillstånden relaterade till smärta10. Således ger operant smärtanalyser överlägsna data vid bedömning av smärta och smärtstillande medel in vivo. De hjälper också till att förstå de nociceptiva processerna i trigeminalsystemet och bidrar därmed till utvecklingen av orofacialt smärtfält.
Disclosures
John K. Neubert och Robert M. Caudle är uppfinnarna av OPAD. är tillverkaren av OPAD, och Richard Mills är anställd hos Stoelting. Richard Mills, John K. Neubert och Robert M. Caudle är tidigare ägare till Velocity Laboratories, ett företag som tillhandahåller beteendetester mot avgift för service med hjälp av operant smärtanalyser.
Acknowledgments
Denna studie finansieras av Facial Pain Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
| Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
| Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
| Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
| Dish sponge | ANY | ANY | |
| GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
| Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
| Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
| Oxygen tank | Medical | ||
| Paper towel | ANY | ANY | |
| Plastic food wrap | ANY | ANY | |
| Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
| Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
| Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
| Spoon | ANY | ANY | |
| Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
| Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
| Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |
References
- Dahlhamer, J., et al. Prevalence of chronic pain and high-impact chronic pain among adults - United States, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (36), 1001-1006 (2018).
- Ab del Shaheed, C., Maher, C. G., Williams, K. A., Day, R., McLachlan, A. J. Efficacy, tolerability, and dose-dependent effects of opioid analgesics for low back pain: A systematic review and meta-analysis. JAMA Internal Medicine. 176 (7), 958-968 (2016).
- Chou, R., et al. The effectiveness and risks of long-term opioid therapy for chronic pain: A systematic review for a National Institutes of Health Pathways to Prevention Workshop. Annals of Internal Medicine. 162 (4), 276-286 (2015).
- Vowles, K. E., et al. Rates of opioid misuse, abuse, and addiction in chronic pain: A systematic review and data synthesis. Pain. 156 (4), 569-576 (2015).
- Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 211, 39-50 (2012).
- Bove, G. Mechanical sensory threshold testing using nylon monofilaments: The pain field's "tin standard". Pain. 124 (1-2), 13-17 (2006).
- Negus, S. S. Core outcome measures in preclinical assessment of candidate analgesics. Pharmacological Reviews. 71 (2), 225-266 (2019).
- Vierck, C. J., Hansson, P. T., Yezierski, R. P. Clinical and pre-clinical pain assessment: Are we measuring the same thing. Pain. 135 (1-2), 7-10 (2008).
- Anderson, E. M., et al. Use of the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) to measure changes in nociceptive behavior. Journal of Visualized Experiments. (76), e50336 (2013).
- Murphy, N. P., Mills, R. H., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Operant assays for assessing pain in preclinical rodent models: Highlights from an orofacial assay. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 20, 121-145 (2014).
- Neubert, J. K., et al. Use of a novel thermal operant behavioral assay for characterization of orofacial pain sensitivity. Pain. 116 (3), 386-395 (2005).
- Neubert, J. K., Rossi, H. L., Malphurs, W., Vierck, C. J., Caudle, R. M. Differentiation between capsaicin-induced allodynia and hyperalgesia using a thermal operant assay. Behavioural Brain Research. 170 (2), 308-315 (2006).
- Kumada, A., et al. Intradermal injection of Botulinum toxin type A alleviates infraorbital nerve constriction-induced thermal hyperalgesia in an operant assay. Journal of Oral Rehabilitation. 39 (1), 63-72 (2012).
- Ma, F., Zhang, L., Lyons, D., Westlund, K. N. Orofacial neuropathic pain mouse model induced by Trigeminal Inflammatory Compression (TIC) of the infraorbital nerve. Molecular Brain. 5, 44 (2012).
- Deseure, K., Hans, G. H. Chronic constriction injury of the rat's infraorbital nerve (IoN-CCI) to study trigeminal neuropathic pain. Journal of Visualized Experiments. (103), e53167 (2015).
- Rohrs, E. L., et al. A novel operant-based behavioral assay of mechanical allodynia in the orofacial region of rats. Journal of Neuroscience Methods. 248, 1-6 (2015).
- Cha, M., Kohan, K. J., Zuo, X., Ling, J. X., Gu, J. G. Assessment of chronic trigeminal neuropathic pain by the orofacial operant test in rats. Behavioural Brain Research. 234 (1), 82-90 (2012).
- Zuo, X., Ling, J. X., Xu, G. Y., Gu, J. G. Operant behavioral responses to orofacial cold stimuli in rats with chronic constrictive trigeminal nerve injury: Effects of menthol and capsazepine. Molecular Pain. 9, 28 (2013).
- Nolan, T. A., Hester, J., Bokrand-Donatelli, Y., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Adaptation of a novel operant orofacial testing system to characterize both mechanical and thermal pain. Behavioural Brain Research. 217 (2), 477-480 (2011).
- Rossi, H. L., et al. Characterization of bilateral trigeminal constriction injury using an operant facial pain assay. Neuroscience. 224, 294-306 (2012).
- Ramirez, H. E., et al. Assessment of an orofacial operant pain assay as a preclinical tool for evaluating analgesic efficacy in rodents. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 426-432 (2015).
- Rossi, H. L., Vierck, C. J., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Characterization of cold sensitivity and thermal preference using an operant orofacial assay. Molecular Pain. 2, 37 (2006).
- Sapio, M. R., et al. Pain control through selective chemo-axotomy of centrally projecting TRPV1+ sensory neurons. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1657-1670 (2018).
- Lambru, G., Zakrzewska, J., Matharu, M. Trigeminal neuralgia: A practical guide. Practical Neurology. 21 (5), 392-402 (2021).
- Doshi, T. L., Nixdorf, D. R., Campbell, C. M., Raja, S. N. Biomarkers in temporomandibular disorder and trigeminal neuralgia: A conceptual framework for understanding chronic pain. Canadian Journal of Pain. 4 (1), 1-18 (2020).
- Sadler, K. E., Mogil, J. S., Stucky, C. L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nature Reviews Neuroscience. 23 (2), 70-85 (2022).
- Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular Pain. 4, 43 (2008).
- Vlaeyen, J. W. S. Learning to predict and control harmful events: Chronic pain and conditioning. Pain. 156, Suppl 1 86-93 (2015).
- Vierck, C. J. Animal studies of pain: Lessons for drug development. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. Campbell, J. C., et al. , IASP Press. Chapter 23 475-495 (2006).
