Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Måling af kompressibiliteten af celle og kerne baseret på akustofluidisk mikroenhed

Published: July 14, 2022 doi: 10.3791/64225
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sino-French Institute of Nuclear Engineering and Technology, Sun Yat-sen University

Summary

Her præsenteres en protokol for at opbygge et hurtigt og ikke-destruktivt system til måling af celle- eller kernekompressibilitet baseret på akustofluidisk mikroenhed. Ændringer i tumorcellernes mekaniske egenskaber efter epitel-mesenkymal overgang eller ioniserende stråling blev undersøgt, hvilket demonstrerede anvendelsesudsigten for denne metode i videnskabelig forskning og klinisk praksis.

Abstract

Cellemekanik spiller en vigtig rolle i tumormetastase, ondartet transformation af celler og radiofølsomhed. Under disse processer er det ofte udfordrende at studere cellernes mekaniske egenskaber. Konventionelle målemetoder baseret på kontakt såsom kompression eller strækning er tilbøjelige til at forårsage celleskader, hvilket påvirker målenøjagtigheden og efterfølgende cellekultur. Målinger i vedhæftet tilstand kan også påvirke nøjagtigheden, især efter bestråling, da ioniserende stråling vil flade celler og forbedre vedhæftningen. Her er der udviklet et cellemekanisk målesystem baseret på akustofluidisk metode. Cellekompressibiliteten kan opnås ved at registrere cellebevægelsesbanen under virkningen af den akustiske kraft, som kan realisere hurtig og ikke-destruktiv måling i suspenderet tilstand. Dette papir rapporterer detaljeret protokollerne for chipdesign, prøveforberedelse, baneregistrering, parameterekstraktion og analyse. Kompressibiliteten af forskellige typer tumorceller blev målt ud fra denne metode. Måling af kernens kompressibilitet blev også opnået ved at justere resonansfrekvensen af den piezoelektriske keramik og mikrokanalens bredde. Kombineret med verifikation på molekylært niveau af immunfluorescensforsøg blev cellekompressibiliteten før og efter lægemiddelinduceret epitel til mesenkymal overgang (EMT) sammenlignet. Endvidere blev ændringen af cellekompressibilitet efter røntgenbestråling med forskellige doser afsløret. Cellemekanik målemetoden, der foreslås i dette papir, er universel og fleksibel og har brede anvendelsesmuligheder inden for videnskabelig forskning og klinisk praksis.

Introduction

Cellemekaniske egenskaber spiller en vigtig rolle i tumormetastase, ondartet transformation af celler og radiosensitivitet 1,2. For at få en dybdegående forståelse af cellemekaniske egenskabers rolle i ovenstående proces er nøjagtig måling af cellulær mekanik kritisk, og målingen bør ikke forårsage skade på cellerne til efterfølgende dyrkning og analyse. Måleprocessen skal være så hurtig som muligt, ellers kan cellelevedygtigheden blive påvirket, hvis celler fjernes fra dyrkningsmiljøet i lang tid.

Eksisterende cellemekaniske målemetoder står over for nogle begrænsninger. Nogle metoder, såsom magnetisk vridningscytometri, magnetisk pincet og partikelsporingsmikroreologi, forårsager celleskader på grund af indførelsen af partikler i celler 3,4,5. Metoder, der måler ved kontakt med celler, såsom atomkraftmikroskop (AFM), mikropipetteaspiration, mikroindsnævring og parallelpladeteknik, er også tilbøjelige til celleskader, og gennemstrømningen er vanskelig at øge 6,7,8. Derudover vil ioniserende stråling flade celler og øge deres vedhæftning9; Det er derfor nødvendigt at måle helcellemekanik i suspension.

Som svar på ovenstående udfordringer er der udviklet et cellemekanikmålesystem baseret på acoustofluidisk metode 10,11,12,13,14. Kanalbredden matches med den akustiske halvbølgelængde, hvilket skaber en stående bølgeknude ved mikrokanalens midterlinje. Under virkningen af akustisk strålingskraft kan cellerne eller standardperlerne flytte til den akustiske trykknude. Da standardperlernes fysiske egenskaber (størrelse, densitet og kompressibilitet) er kendt, kan den akustiske energitæthed bestemmes. Derefter kan cellekompressibiliteten opnås ved at registrere bevægelsesbanerne for celler i det akustiske felt. Ikke-destruktiv måling af høj kapacitet af celler i suspensionstilstand kan opnås. Dette papir vil introducere designet af den mikrofluidiske chip, etableringen af systemet og måletrinnene. Måling af forskellige typer tumorceller er blevet udført for at verificere metodens nøjagtighed. Anvendelsesområdet for denne metode var blevet udvidet til subcellulære strukturer (såsom kerne) ved at justere resonansfrekvensen af den piezoelektriske keramik og bredden af mikrokanalen. Desuden blev ændringerne i cellekompressibilitet efter lægemiddelinduceret EMT eller røntgenbestråling med forskellige doser undersøgt. Resultaterne viser den brede anvendelighed af denne metode som et kraftfuldt værktøj til at studere sammenhængen mellem biokemiske ændringer og cellulære mekaniske egenskaber.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling og samling af den akustofluidiske mikroenhed

  1. Fremstilling af den mikrofluidiske chip.
    1. Design en enkeltkanalschip med kun ét indløb og udløb som vist i figur 1. Til måling af celler skal mikrokanalens rektangulære tværsnit holdes på 740 μm bredt og 100 μm dybt. Til måling af cellekernen ændres mikrokanalens bredde og dybde til henholdsvis 250 μm og 100 μm.
    2. Forbered mikrokanalen på siliciumskive via reaktiv ionætsning. Forsegl toppen af mikrokanalen med et stykke gennemsigtigt varmebestandigt glas ved anodisk binding15. Vask chipsene med en ultralydsrenser i 10 min. Tør dem i en tørreovn ved 50 °C til senere brug.
  2. Fabriker polydimethylsiloxan (PDMS) blokke.
    1. Tilsæt 30 ml præpolymer til en 100 mm (i diameter) glasskål. Tilsæt 3 ml hærdningsmiddel til præpolymeren med en sprøjte.
      BEMÆRK: Volumenforholdet mellem hærdningsmidlet og præpolymeren er 1:10.
    2. Bland PDMS-præpolymeren og hærdningsmidlet kraftigt med en glasstang i ca. 10 minutter. Kig efter små og ensartet adskilte luftbobler i opløsningen, hvilket indikerer, at PDMS-præpolymeren og hærdningsmidlet er godt blandet.
    3. Placer glasskålen i en vakuum udtørring og evakuer i 15-25 s. Gentag denne proces, indtil der ikke er luftbobler i blandingen.
    4. Anbring glasskålen i en tørreovn, der er indstillet til 50 °C i 1 time, så blandingen kan hærde. Efter inkubationen skal du bruge en skalpel til at skære PDMS i blokke af passende størrelse ca. 1,2 cm lang og 1 cm bred.
      BEMÆRK: Længden af PDMS-blokken er i overensstemmelse med chipets bredde, og bredden er valgt for at sikre, at der er plads nok i midten til den piezoelektriske keramik, når to PDMS-blokke klæbes på chippen.
  3. Bind PDMS-blokken til chippen.
    1. Stans huller i PDMS-blokken til indløbs- og udløbsporte med en hul nål med en diameter på 1 mm. Sæt PDMS-blokkene og chippen (bagsiden opad) i en plasmarenser i 1 min.
    2. Juster hullerne på PDMS-blokkene med spånens indløb og udløb. Tryk forsigtigt PDMS-blokkene mod chippen i 15 s. Dette skulle medføre, at der opstår binding mellem PDMS-blokkene og overfladen af chippen.
  4. Tilslut polytetrafluorethylen (PTFE) kateteret til chippen (figur 2B).
    1. Skær to stykker PTFE-kateter med en indvendig diameter på 0,8 mm og en længde på 10 cm. Bøj en nål i rustfrit stål med en indvendig diameter på 0,7 mm og en længde på 1,5 cm x 90° i en L-form. Tilslut det til den ene ende af kateteret. Forbered to sådanne katetre med nåle.
    2. Indsæt nålene i rustfrit stål i hullerne i PDMS-blokkene. Til indløbet skal du tilslutte en 19 G dispenseringsnål til den anden ende af kateteret som et stik til en sprøjte.
    3. Efter at have gennemført ovenstående trin, injicer deioniseret vand for at teste tætheden af den samlede kanal. Uigennemtrængelig for vand betyder en god tætning.
  5. Piezoelektrisk keramisk samling (figur 2C)
    1. Brug en diamanttrådskærer til at skære piezoelektriske keramiske plader med en diameter på 2 cm i fire strimler med en bredde på 5 mm.
    2. Sørg for, at resonansfrekvensen af den piezoelektriske keramik matcher bredden af chipmikrokanalen. Til den 740 μm og 250 μm brede mikrokanal skal du bruge piezoelektrisk keramik med resonansfrekvenser på henholdsvis 1 MHz og 3 MHz.
    3. Svejsetråde på begge sider af den piezoelektriske keramik i den ene ende.
    4. Lim den piezoelektriske keramik til midten af bagsiden af chippen med cyanoacrylatlim.
    5. For at sprede limen jævnt skal du placere en dråbe lim på den piezoelektriske keramik, glatte limen med et tandstikker og fjerne overskydende lim. Tryk derefter hurtigt på den på chippen og fortsæt med at trykke i ca. 1 min. Sørg for, at den piezoelektriske keramik og chippen er fast bundet og jævnt kontaktet.
  6. Monter mikroenheden (figur 2D).
    1. Skær et stykke PDMS (ca. 1,5 cm langt og 1 cm bredt) som bunden af mikroenheden. Brug dobbeltsidet tape til at klæbe den ene side af basen til indløbs- og udløbs-PDMS-blokkene og den anden side til et gennemsigtigt glasglas. Fastgør hele mikroenheden til mikroskoptrinnet for at holde chippen i et fokusplan.

2. Forberedelse af prøver

  1. Fremstilling af polystyren standardpartikelopløsninger.
    1. Der tilsættes 0,05 ml polystyrenpartikelopløsning (6 μm i diameter) (2,1 x 108 partikel/ml) til 10 ml fosfatbufferet saltvand (PBS) og blandes godt.
      BEMÆRK: For at reducere målefejlen forårsaget af ændringen af den akustiske energitæthed blev polystyrenpartikelopløsningen blandet med prøveopløsningen i hvert eksperiment som kalibrering.
  2. Fremstilling af cellesuspensioner.
    1. Vask de vedhæftede celler (f.eks. MCF7, MDA-MB-231, HCT116) ved 90% sammenløb (~ 5 x 105 celler) med PBS. Tilsæt 500 μL 0,25% trypsin (1x) i 1-2 minutter ved stuetemperatur (25 °C). Fjern trypsin, tilsæt 1 ml komplet medium og dann en cellesuspension ved pipettering.
    2. Centrifuger cellesuspensionen ved 100 x g i 5 min. Supernatanten fjernes og resuspenderes i 0,5-1 ml PBS for at opnå en cellesuspension. Celler blev talt med et hæmocytometer, og koncentrationen var ca. 3-5 x 105 celler / ml.
  3. Fremstilling af cellekernesuspension
    1. Udfør trin 2.2. Fjern derefter supernatanten og tilsæt 200 μL cytoplasmatisk proteinekstraktionsreagens A (suppleret med 1% PMSF) pr. 20 μL cellepellet (ca. 5 millioner celler) og bland godt.
    2. Hvirvel ovenstående blanding ved 220 x g i 5 s, og læg derefter på isbad i 10 min. Efter inkubation tilsættes 10 μL cytoplasmatisk proteinekstraktionsreagens B til opløsningen.
    3. Hvirvel ved 220 x g i 5 s. Placer på isbad i 1 min og hvirvel igen ved 220 x g i 5 s. Derefter centrifugeres til sidst ved 1.000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
      BEMÆRK: Volumenforholdet mellem cytoplasmatiske proteinekstraktionsreagenser A og B er 20: 1.
    4. Supernatanten fjernes, og pelleten genoptages i 1 ml PBS. Derefter centrifugeres ved 1.000 x g ved 4 °C i 4 min. Supernatanten fjernes, og 100 μL PBS resuspenderes som cellekernesuspension.
    5. Tilsæt trypanblå til ovennævnte cellekernesuspension og plet ved stuetemperatur (25 °C) i 4 minutter. Volumenforholdet mellem trypanblå opløsning og kernesuspension er 1: 1. Tæl antallet af kerner under det omvendte mikroskop med et 10x mål.
      BEMÆRK: For tydeligt at identificere cellekernerne under mikroskopet kræves trypanblå farvning. Trypan blå opløsning skal være i et 37 °C vandbad i 10 minutter før brug for effektiv farvning.
    6. Ovennævnte cellekernesuspension fortyndes med PBS-buffer til en koncentration på 2-3 x 105 kerne/ml. Cellekernesuspensionen filtreres gennem en sigte på 70 μm.

3. Måling af kompressibiliteten af celle og kerne

  1. Opsætning af målesystemet (figur 3)
    1. Tænd for mikroskopets lyskilde, og åbn kamerasoftwaren. Brug 4x-målet til at finde mikrokanalens midterposition, dvs. placeringen af den piezoelektriske keramik.
    2. Tilslut ledningerne og svejs dem til de positive og negative terminaler på signalgeneratorudgangen på henholdsvis piezoelektrisk keramik.
    3. Placer sprøjten på mikroinjektionspumpen, og tilslut den til indløbskateteret. Placer en lille beholder i slutningen af udløbskateteret for at holde væsken, der strømmer ud af mikrokanalen.
  2. Bestem måleparametre
    1. Aspirer polystyrenpartikelopløsningen med sprøjten og injicer den i chipmikrokanalen. Undgå luftbobler i chipmikrokanalen for at sikre nøjagtig måling. Sørg for, at partikler fordeles jævnt i chipmikrokanalen.
      BEMÆRK: Måling kan udføres uden flow eller sprøjtepumpe. Om nødvendigt skal mikroinjektionspumpens strømningshastighed indstilles til en korrekt værdi. Her er intervallet for strømningshastighed 0-20 μL / t.
    2. Indstil signalgeneratorens udgang til et sinussignal med en frekvens på 1 MHz (3 MHz til måling af cellekerner) og spidsspænding (Vpp) på 10 V.
    3. Finjuster signalets frekvens, indtil det observeres, at partiklerne bevæger sig mod mikrokanalens midterlinje og forbliver i fremadgående bevægelse langs midterlinjen efter at have nået midterlinjen (figur 4).
      BEMÆRK: Partiklernes hastighed, der bevæger sig mod midterlinjen, bestemmes af spændingsamplituden, som kan justeres mellem 5 Vpp og 20 Vpp.
  3. Mål celler og kerner
    1. Bland 1 ml celle- eller kernesuspension med standardpartikelopløsningen i forholdet 1:1 og injicer den i mikrokanalen med en sprøjte.
    2. Start optagelse med CCD-kamera, når cellerne eller kernerne kommer ind i synsfeltet. Tænd derefter signalgeneratoren. Stop optagelsen, når cellerne eller kernerne når midterlinjen.
    3. Skyl mikrokanalen med deioniseret vand, 75% alkohol og deioniseret vand i rækkefølge til senere brug.

4. Databehandling

  1. Kort partikel- eller cellebaner.
    1. Importer den optagne video til ImageJ-software: Filen > åbnes> Vælg mappe. Klik på ellipseformen i værktøjslinjen i ImageJ-softwaren for at vælge en celle af interesse og dens tilstødende partikel (figur 5).
    2. Som vist i figur 5 er forudindstillede måleparametre i ImageJ-software som Analyser→ Indstil måling →Område, Centroid, Vis etiket.
    3. At tage rammen, hvor målcellen eller partiklen gennemgår langsgående forskydning som startrammen; Optag pixelpositionen og størrelsen af cellen eller partiklen i hver ramme, indtil den når mikrokanalens midterlinje. Eksportér dataene som en regnearksfil, og gentag trinnet, indtil der er opnået baner for alle celler af interesse.
  2. Koordiner transformation og korrektion.
    1. Optag pixelkoordinaterne for mikrokanalens fire hjørner i dette synsfelt som (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4). Her x3 = x4.
    2. For hvert målepunkt (xi, yi) beregnes den nye koordinat (xi', yi') efter rotationskorrektion ved hjælp af følgende formler:
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
    3. Konverter pixelkoordinater til koordinater i reel størrelse. De faktiske koordinater kan opnås ved at gange pixelkoordinater med forholdet. Forholdet var den faktiske bredde af mikrokanalen divideret med mikrokanalens pixelbredde (H).
    4. Transformér og korriger pixelkoordinaterne for de celler og partikler, der er opnået i trin 4.1, til dataene for den endelige bevægelsesbane. Alle koordinater minus koordinaterne i nederste venstre hjørne, dvs. (0, y2). Videoens billedhastighed er 40 billeder i sekundet, så multiplicer antallet af rammer svarende til hver koordinat med 0,025 s for at opnå tidspunktet for partikelbevægelse og derved opnå ændringen af positionen i y-retningen med tiden.
  3. Den akustiske energitæthed beregnes (figur 6A,B).
    1. Bevægelsen af cellen eller partiklen i Y-retningen drives af den akustiske kraft F ac og hydrodynamisk kraft FD. Beregn bevægelsesbanen ved hjælp af følgende formler:
      Equation 4(1)
      Equation 5(2)
      Equation 6(3)
      hvor r og D er cellens eller partiklens radius og diameter, ρ og β er densiteten og kompressibiliteten, ν er hastighedsvektoren. Abonnementerne c og f angiver henholdsvis cellen og væsken. d er afstanden fra den nærmeste akustiske trykknude, μ er væskens dynamiske viskositet, k er bølgetallet, og E er den akustiske energitæthed.
      BEMÆRK: Tætheden af MCF7, HCT116, A549 og cellekerner var 1068 kg / m 3, 1077 kg / m 3, 1073 kg / m 3 og 1155 kg / m 3, henholdsvis 12,16,17.
    2. I henhold til formlerne beskrevet i trin 4.3.1 skal du bruge MATLAB-softwaren til at opnå den numeriske løsning til standardpartikelbanen under det akustiske felt med endelig forskelsmetode.
    3. Inden for det forudindstillede akustiske feltområde ændres den akustiske energitæthed, og den numeriske løsning (opnået i trin 4.3.2) og den målte bevægelsesbane (opnået i trin 4.2) passer til standardpartiklen. Vælg det bedste tilpasningsresultat i henhold til monteringsmiddelkvadratfejlen. Den akustiske energitæthed opnået her anvendes som parameter til efterfølgende beregning af cellekompressibilitet.
  4. Beregn cellekompressibiliteten (figur 6C, D).
    1. Den akustiske energitæthed indstilles til den værdi, der opnås i trin 4.3.3.
    2. I henhold til formlerne beskrevet i trin 4.3.1 skal du bruge MATLAB-softwaren til at opnå den numeriske løsning for cellebanen under det akustiske felt med endelig forskelsmetode.
    3. I lighed med trin 4.3.3 ændres kompressibiliteten inden for det forudindstillede kompressibilitetsområde og passer til den numeriske opløsning (opnået i trin 4.4.2) og den målte bevægelsesbane for cellen (opnået i trin 4.2). Brug kompressibilitetskoefficienten, der svarer til det bedst tilpassede resultat, som den målte cellekompressibilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her præsenterede arbejdet en protokol til konstruktion af et hurtigt og ikke-destruktivt cellekompressibilitetsmålesystem baseret på akustofluidisk mikroenhed og demonstrerede dets fordele ved måling af celle og kerne under forskellige situationer. Figur 1 viser skemaet for den mikrofluidiske kanal. Komponenterne og samlingen af den akustofluidiske mikroenhed er vist i figur 2. Figur 3 viser opsætningen af målesystemet. Under virkningen af den akustiske feltkraft vil celler og partikler bevæge sig mod mikrokanalens midterlinje, som vist i figur 4A. Måling af størrelsen og placeringen af celler eller partikler er vist i figur 5. Beregningen af energitæthed og cellekompressibilitet ved montering er vist i figur 6. For at udvide anvendelsesområdet for denne enhed til cellulære organeller, især kernen, blev høj renhed og intakte kerner isoleret fra celler (figur 7A). Ved at justere resonansfrekvensen af den piezoelektriske keramik og mikrokanalens bredde i overensstemmelse hermed blev kernens bevægelsesbane opnået (figur 4B), og målingen af kernekompressibilitet blev opnået (figur 7B).

Baseret på dette system blev komprimerbarheden af forskellige typer kræftceller målt og sammenlignet (figur 8A). Desuden blev ændringerne i cellekompressibilitet efter lægemiddelinduceret EMT eller røntgenbestråling med forskellige doser undersøgt (figur 8B, C). Til EMT-induktion blev vækstfaktor såsom transformerende vækstfaktor beta (TGFβ), epidermal vækstfaktor (EGF) og basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) anvendt. Ved bestråling var dosishastigheden 153 mU/min., og de anvendte doser var 1, 2, 4 og 8 Gy. Disse resultater viser den brede anvendelighed af denne metode som et kraftfuldt værktøj til at studere sammenhængen mellem biokemiske ændringer og cellulære mekaniske egenskaber. Vigtigst af alt var denne metode en ikke-ødelæggelsesmåling. De målte celler blev opsamlet og podet i en cellekulturskål, og det blev konstateret, at der ikke var nogen signifikant forskel i celleproliferation og levedygtighed sammenlignet med den ubehandlede gruppe efter 48 timers dyrkning, som vist i figur 9, hvilket indikerer, at målingen ikke har nogen effekt på celleproliferation og overlevelse.

Figure 1
Figur 1: Skematisk diagram over chipmikrokanalen. Dette billede viser strukturen og dimensionerne af chipmikrokanalen med et enkelt indløb og udløb. Enheden er mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Monteringsfoto til den akustofluidiske mikroenhed . (A) For- og bagsidefotos af chippen. (B) Dette billede viser indløbs-PTFE-kateteret med påsat 19 G doseringsnål og nål i rustfrit stål. (C) Dette billede viser den piezoelektriske keramik med tråde svejset. (D) Dette billede viser samlingen af den akustofluidiske mikroenhed med base til fastgørelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Opsætning af cellekompressibilitetsmålesystemet. Dette billede viser opsætningen af målesystemet bestående af signalgenerator, sprøjtepumper, den akustofluidiske mikroenhed, mikroskop og CCD-kamera. Dette tal er ændret fra10. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Bevægelsen af celler og kerner. Denne figur viser bevægelsen af celler (A) og cellekerner (B) til mikrokanalens midterlinje under virkningen af den akustiske feltkraft. Skalabjælke = 250 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Måling af størrelsen og placeringen af en celle eller partikel ved hjælp af ImageJ-software. Denne figur viser knappen klik for at opnå parametre som område og centroid i ImageJ-softwaren. Pixelkoordinaterne for de fire hjørner af mikrokanalen blev registreret som (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4). Pixelbredden blev repræsenteret som H. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Beregning af energitæthed og cellekompressibilitet ved montering. (A) Gennemsnitlige kvadrerede fejlværdier (LS) ved forskellige energitætheder. Den akustiske energitæthed blev opnået fra det bedst passende resultat. Enheden for energitæthed er J / m3. (B) Denne figur viser tilpasningen af den numeriske opløsning og den målte bevægelsesbane for partiklen. (C) Gennemsnitlige kvadrerede fejlværdier (LS) ved forskellige cellekompressibiliteter. Cellekompressibiliteten blev opnået fra det bedst passende resultat. (D) Denne figur viser tilpasningen af den numeriske opløsning og den målte bevægelsesbane for cellen. Enheden for cellekompressibilitet er 10-10 Pa-1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Kerneekstraktion og kompressibilitetsmåling. (A) Dette billede viser cellekernerne ekstraheret fra A549-celler set med et 40x mål. Skalabjælke = 20 μm. (B) Dette billede viser sammenligningen af målte kompressibiliteter af A549-celler (N = 38) og deres kerner (N = 45). Enheden for cellekompressibilitet er 10-10 Pa-1. Kassens længde repræsenterer standardafvigelsen. Elevens t-test og chi-square analyse blev brugt til at vurdere betydning. **P < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Kompressibiliteten af forskellige typer kræftceller og celler efter lægemiddelinduceret EMT eller røntgenbestråling. (A) Cellekompressibiliteten af forskellige typer kræftceller. HCT116 (N = 36), A549 (N = 68) og MDA-MB-231 (N = 32) var cellelinjerne i henholdsvis kolorektalt karcinom, lungeadenocarcinom og brystadenocarcinom. (B) Cellekompressibiliteten af MCF7 og A549 før og efter induktion af EMT. (C) Cellekompressibilitet målt ved 3 timer efter bestråling med forskellige doser. Enheden for cellekompressibilitet er 10-10 Pa-1. Slutbjælkerne i boxplottet repræsenterer henholdsvis 10% og 90% værdierne. Kassens længde repræsenterer standardafvigelsen. Den midterste vandrette linje repræsenterer medianværdien. ns betyder ingen statistisk signifikans. Elevens t-test og chi-square analyse blev brugt til at vurdere betydning. *P < 0,05, **P < 0,01. En del af dette tal er ændret fra18,19. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Celleproliferation og levedygtighed efter kompressibilitetsmåling. Denne figur viser A549-celleproliferationen (A) og levedygtigheden (B) efter kompressibilitetsmåling. Kontrolgrupper er ubehandlede celler. Testgrupper er de celler, der dyrkes i 48 timer efter kompressibilitetsmåling. Hvert eksperiment har mindst tre replikater. For cellelevedygtighed blev mindst 300 celler talt. Elevens t-test og chi-square analyse blev brugt til at vurdere betydning. ns angiver ikke statistisk signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Almindeligt anvendte cellemekaniske målemetoder er AFM, mikropipetteaspiration, mikrofluidikmetoder, parallelpladeteknik, optisk pincet, optisk båre og akustiske metoder20. Microfluidics-metoder kan arbejde med tre tilgange: mikroindsnævring, ekstensiv strømning og forskydningsstrøm. Blandt dem er optisk båre, optisk pincet, akustiske metoder, ekstensiv strømning og forskydningsstrømningsmetoder ikke-kontaktmålinger. I modsætning til kontaktmålinger kan berøringsfri målinger effektivt undgå celleskadeproblemet forårsaget af kontakt eller lokal deformation. Optiske pincetter er meget følsomme over for målemiljøet21. Forstyrrelser under optiske forhold kan forårsage betydelige forskelle i måleresultater, og høj lasereffekt under måling kan også forårsage celleskader. Desuden har optisk båre og optisk pincet generelt lav kapacitet20,22. Mikrofluidiske metoder såsom ekstensiv strømning og forskydningsstrøm kan ikke måle mikromekanik af tumorceller direkte23. Sammenlignet med andre metoder har akustiske metoder fordelene ved ikke-destruktiv, høj kapacitet og bred anvendelighed til måling af cellemekanik.

Målemetoden baseret på akustofluidisk mikroenhed designet i dette papir bruger ikke-kontakt akustisk strålingskraft, og den største fordel er, at den ikke beskadiger celler, hvilket blev bekræftet af de eksperimentelle resultater vist her (figur 9). En anden fordel ved denne metode er den høje gennemstrømning, som kan justeres ved at ændre cellekoncentrationen. I øjeblikket kan der opnås en målehastighed på ca. 50-70 celler/min ud fra den forudsætning, at nøjagtigheden af efterfølgende dataanalyse sikres. Fordi cellerne måles i suspension, kan måling af ikke-klæbende celler også opnås, hvilket udvider dets anvendelsesområde. Desuden blev der i dette dokument opnået måling af cellekompressibiliteten efter bestråling, og forholdet mellem cellekompressibilitet og bestrålingsdosis blev afsløret (figur 8). Derudover kan måling af celler eller kerner med forskellig stivhed også tilpasses ved at justere resonansfrekvensen af den piezoelektriske keramik og mikrokanalens bredde. Som vist i figur 7 blev måling af kernens kompressibilitet opnået.

Her blev kun bevægelsen af celler langs længden og bredden af den mikrofluidiske kanal overvejet. Cellerne blev anset for at være i suspension, fordi cellernes tæthed er tæt på væskens. Hvis der var celleaflejring eller friktion med bunden, ville den blive fundet i den efterfølgende banetilpasningsproces. Sådanne data vil blive elimineret. For at validere den foreslåede metode blev to slags polystyrenperler med forskellig diameter (6 μm og 10 μm) testet. Perlerne med en diameter på 6 μm blev brugt som kontrol. Kompressibiliteten af perler med en diameter på 10 μm blev opnået som 2,37 ± 0,11 x 10-10 Pa-1, i overensstemmelse med værdien (2,1-2,4 x 10-10 Pa-1) rapporteret i en anden undersøgelse 15,24.

Baseret på denne metode blev kompressibiliteten af celler og kerner målt. Da kernen spiller en vigtig rolle i mekanosensing og mekanotransduktion, kan måling af kernens mekaniske egenskaber bidrage til bedre at forstå, hvordan de reagerer på ekstern stimulus såsom ioniserende strålingsinduceret DNA-skade (figur 8). Desuden viste eksperimenter, at cellekompressibilitet kan tjene som en ny indikator til overvågning af EMT-processen (figur 8), der viser dens anvendelsesmuligheder i kræftdiagnose. Da den akustiske strålingskraft er relateret til cellestørrelse, celletæthed og kompressibilitet, kan denne metode også bruges til celleisolering, såsom adskillelse af cirkulerende tumorceller (CTC'er) eller deres klynger fra blodprøven. CTC'er og deres klynger spiller en vigtig rolle i den tidlige påvisning af metastatiske tumorer og overvågningen af strålebehandlingseffekten25,26. Derfor har denne metode store kliniske anvendelsesmuligheder inden for tidlig screening og evaluering af kræft.

Det er værd at bemærke, at nøglefaktoren, der påvirker målingen af denne metode, er matchningen af resonansfrekvensen med mikrokanalens bredde, hvilket resulterer i udseendet af en stående bølgeknude ved mikrokanalens midterlinje. Samtidig skal man være opmærksom på klæbning af piezoelektrisk keramik. Desuden bør gennemstrømningen ikke være for høj for nøjagtigt at identificere og spore banen for celler eller partikler og undgå problemet med celleaggregering på grund af vedhæftning. Hvordan ændringer i andre parametre (såsom cellestørrelse, celletæthed osv.) påvirker målingen af kompressibilitet er blevet undersøgt i tidligere arbejde18. Desuden kræves der på grund af deres blødhed en stor akustisk strålingsdrivkraft ved måling af cellekerner for at få dem til at bevæge sig jævnt til mikrokanalens midterlinje, hvilket kræver et hurtigt kamera til nøjagtigt at fange banerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskudsnumre 12075330 og U1932165) og Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen, Kina (tilskudsnummer 2020A1515010270).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin(1x) GIBCO 15050-065
502 glue Evo-bond cyanoacrylate glue
A549 ATCC CCL-185 lung adenocarcinoma
Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit Beyotime P0027 Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  corning 10-013-CVRC
Fetal Bovine Srum(FBS) AUSGENEX FBS500-S
HCT116 ATCC CCL247 colorectal carcinoma
Heat-resistant glass Pyrex
Leibovitz’s L-15 medium  GIBCO 11415-064
MCF-7 ATCC HTB-22  breast Adenocarcinoma
MDA-MB-231 ATCC HTB-26  breast Adenocarcinoma
Minimum Essential Medium (MEM) corning 10-010-CV
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15140-122
Phosphate buffer corning 21-040-cvc
PMSF Beyotime ST506 100mM
Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere  polysciences 15714 The diameter of microshpere is 6.00µm
propidium iodide(PI) Sigma-Aldrich P4170
SYLGARD 184Silicone ELASTOMER Dow-Corning 1673921 Contains prepolymers and curing agents
Trypan Blue Beyotime C0011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  2. Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
  3. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
  4. Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
  5. Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
  6. Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
  7. Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
  8. Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
  9. Jung, J. -W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
  10. Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
  11. Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
  12. Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
  13. Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
  14. Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
  15. Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
  16. Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
  17. Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
  18. Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
  19. Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
  20. Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
  21. Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
  22. Wei, M. -T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
  23. Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
  24. Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
  25. Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
  26. Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).

Tags

Kræftforskning nummer 185
Måling af kompressibiliteten af celle og kerne baseret på akustofluidisk mikroenhed
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu,… More

Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu, Y. Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice. J. Vis. Exp. (185), e64225, doi:10.3791/64225 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter