Microscopía intravital para estudiar las interacciones plaqueta-leucocito-endotelial en el hígado de ratón

Resumen

La microscopía intravital es una herramienta poderosa que proporciona información sobre las relaciones temporales y espaciales de procesos rápidos y/o secuenciales. En este trabajo describimos un protocolo para evaluar tanto las interacciones proteína-proteína como las interacciones plaqueta-neutrófilos-endoteliales en sinusoides hepáticos en un modelo murino de sepsis experimental (endotoxemia).

Resumen

La inflamación y la trombosis son procesos complejos que ocurren principalmente en la microcirculación. Aunque la histología estándar puede proporcionar información sobre la vía final tanto para la inflamación como para la trombosis, no es capaz de mostrar los cambios temporales que ocurren a lo largo del curso temporal de estos procesos. La microscopía intravital (IVM) es el uso de imágenes de animales vivos para obtener información temporal sobre los procesos fisiológicos in vivo. Este método es particularmente poderoso cuando se evalúan las interacciones celulares y proteicas dentro de la circulación debido a los eventos rápidos y secuenciales que a menudo son necesarios para que ocurran estas interacciones. Si bien la MIV es una metodología de imagen extremadamente poderosa capaz de ver procesos complejos in vivo, hay una serie de factores metodológicos que es importante tener en cuenta al planificar un estudio de MIV. Este documento describe el proceso de realización de imágenes intravitales del hígado, identificando consideraciones importantes y posibles dificultades que pueden surgir. Por lo tanto, este artículo describe el uso de la MIV para estudiar las interacciones plaqueta-leucocito-endotelial en sinusoides hepáticos para estudiar las contribuciones relativas de cada uno en diferentes modelos de lesión hepática aguda.

Introducción

La inflamación y la trombosis son procesos complejos que ocurren principalmente en la microcirculación. Este protocolo describe la preparación quirúrgica que permite obtener imágenes de la microvasculatura hepática in vivo. Aunque la histología estándar puede proporcionar información sobre las vías finales tanto para la inflamación como para la trombosis, no puede mostrar los cambios temporales que ocurren a lo largo del proceso. Además, este método es particularmente poderoso cuando se evalúan las interacciones celulares y proteicas transitorias que ocurren dentro de la circulación microvascular debido ....

Protocolo

Todos los protocolos para animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Baylor College of Medicine y el Comité de Investigación y Desarrollo del Centro Médico de Asuntos de Veteranos Michael E. DeBakey. Todos los experimentos son terminales, con la eutanasia realizada al final bajo un plano quirúrgico de anestesia. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.

1. Preparación de anticuerpos y colorantes

1. Selección de anticuerpos....

Resultados

Evaluación del efecto del dominio de bastones de vimentina en la adhesión de los leucocitos al endotelio inflamado
La unión del ligando-1 de la glicoproteína P-selectina leucocitaria (PSGL-1) a la P-selectina endotelial y plaquetaria se produce durante la fase aguda de la inflamación por lesión hepática inducida por sepsis. Sin embargo, se ha demostrado que el dominio recombinante de bastones humanos de vimentina (rhRod) se une a la P-selectina y bloquea la adhesión de los leucocitos tanto al endoteli.......

Discusión

El propósito de este artículo de métodos es describir los pasos necesarios para capturar de manera confiable imágenes y videos intravitales de alta resolución del hígado de ratón en condiciones homeostáticas y después de la administración de endotoxina o APAP. Si bien este protocolo ha permitido la producción constante de datos sobre las interacciones plaqueta-leucocito-endotelial en el hígado, hay una serie de pasos críticos necesarios para el éxito, así como posibles trampas que es imp.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Surgical Supplies
esponjas no tejidas de 2" x 2"	McKesson Med. Surg	92242000	Para el aislamiento del hígado
#4-0 sutura trenzada de seda con aguja	SOFSILK	N/A	4-0 Softsilk recubierta de trenzado negro, no absorbible: C-1 aguja de corte
#4-0 sutura trenzada de seda sin aguja	Ethicon	N/A	4-0 Seda trenzada negra, no absorbible
Aguja roma de 21 G (0,5 pulgadas)	SAI Infusion Technologies	B21-50	Se utiliza para sujetar al extremo del tubo de traqueostomía para permitir la conexión al ventilador. Una fuente alternativa es la
aguja roma Instech 23 G (0,5 pulgadas)	SAI Infusion Technologies	B23-50	Se utiliza para que el catéter vascular permita la conexión a una jeringa. Una fuente alternativa es Instech
Tijeras de disección (punta puntiaguda)	Tijeras	INS600393-G	Micro de Kent Scientific; Cuchillas de carburo; Recto; Puntas afiladas; Longitud de la hoja de 24 mm; 4 1/2" de longitud total Micro
tijeras McPherson-Vannas (Vannas)	Kent Scientific	INS600124	Son útiles para crear las aberturas en la tráquea y los vasos
Tubo de polietileno 10	Instech	BTPE-10	Se utiliza para hacer la porción intravascular del catéter. Una fuente alternativa es el tubo de
polietileno	Instech	BTPE-50	Se utiliza para hacer la porción extravascular del catéter. Una fuente alternativa es el
tubo de polietileno	Instech	BTPE-90	que se utiliza para fabricar el tubo de traqueostomía. Una fuente alternativa es BD Intramedic Intramedic
salina normal estéril de grado USP	Coviden	8881570121	Hospira 0.0% Sodium Chloride Injection, USP
Microscopy Supplies
			anestésico volátil
Espaciador de espuma para la almohadilla de calentamiento durante la microscopía	N/A	N/A	Este espaciador debe estar cortado de espuma de alta calidad, debe caber alrededor de la bandeja del microscopio hepático y las dimensiones específicas de la altura dependen del sistema de microscopio
Sistema de microscopio confocal de escaneo láser con escáner de cabeza de resonancia	Olympus	FV3000	Aunque describimos el uso de una Olympus FV3000 utilizando un escáner de cabeza de resonancia, este protocolo funciona con la mayoría de los sistemas de imagen
Bandeja de microscopio hepático	N/A	N/A	La bandeja de microscopio hepático fue diseñada para un microscopio invertido
Anticuerpos & Reactivos relacionados
Violeta brillante 421/anti-ratón Ly6G anticuerpo BioLegend		127628	3 µ g/ratón. Para etiquetar los neutrófilos
BV421/F4/80 el anticuerpo	BioLegend	123132	0,75 mg/kg. Para etiquetar las células de Kupffer
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio	Gibco/ThermoFisher Scientific		14190144 Se utiliza como dializado para eliminar la azida de sodio de los anticuerpos
DyLight649/anti-GPIbβ anticuerpo	emfret Analytics	X649	3 µ g/ratón. Para etiquetar plaquetas
DyLight488/anti-ratón GPIbβ anticuerpo	emfret Analytics	X488	6 µ g/ratón. Para etiquetar plaquetas
Endotoxina de Escherichia coli serotipo O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024	5 mg/kg; La potencia de la endotoxina puede variar de un lote a otro. Por lo tanto, el mismo lote debe usarse para una serie de experimentos para minimizar la variación debida al lote de endotoxinas
PerCP-eFluor 710 / anticuerpo de P-selectina	de ratón Invitrogen	46-0626-82	4 µ g/ratón. Para etiquetar P-selectin
Slide-a-Lyzer 7,000 MWCO casete	Thermo Scientific	66370	Se utiliza para dializar anticuerpos para eliminar la azida de sodio
Dextrano marcado con Texas Red	Sigma-Aldrich	T1287	~ 150 kDa; 250 µ g/ratón
TRITC/albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A2289	500 µ g/ratón. Diluir hasta una concentración de 50 mg/mL (5%) en solución salina normal. Se utiliza para etiquetar la vasculatura. Puede filtrarse en el espacio intersticial más fácilmente que el dextrano de alto peso molecular durante la inflamación

de disección BD Intramedic 50 BD Intramedic 90 solución Isoflurane sistema de administración y ventilador Kent Scientific Somnosuite Combinación de ventilador para roedores y sistema de administración de