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Genetics

Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

Published: September 11, 2022 doi: 10.3791/64240
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, 2Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, 3Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

Summary

Los ensayos de captura de bucle D (DLC) y extensión de bucle D (DLE) utilizan el principio de ligadura de proximidad junto con PCR cuantitativa para cuantificar la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos en el sitio de una ruptura ducible de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

El daño del ADN, incluidas las roturas de doble cadena del ADN y los enlaces cruzados entre cadenas, incurridos durante las fases S y G2 del ciclo celular pueden repararse mediante recombinación homóloga (HR). Además, HR representa un mecanismo importante de rescate de la bifurcación de replicación después de un estancamiento o colapso. La regulación de los muchos pasos reversibles e irreversibles de esta compleja vía promueve su fidelidad. El análisis físico de los intermedios de recombinación formados durante la FC permite la caracterización de estos controles por diversos factores de nucleoproteínas y sus interactores. Aunque existen métodos bien establecidos para evaluar eventos específicos e intermedios en la vía de recombinación, la detección de la formación y extensión del bucle D, dos pasos críticos en esta vía, ha demostrado ser un desafío hasta hace poco. Aquí, se describen métodos eficientes para detectar eventos clave en la vía HR, a saber, la formación de rotura de doble cadena de ADN, la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos a través de la replicación inducida por rotura (BIR) en Saccharomyces cerevisiae . Estos ensayos detectan sus intermedios de recombinación relevantes y productos con alta sensibilidad y son independientes de la viabilidad celular. La detección de D-loops, extensión D-loop y el producto BIR se basa en la ligadura de proximidad. Juntos, estos ensayos permiten el estudio de la cinética de la FC a nivel de la población para abordar con precisión las funciones de las proteínas y reguladores de la FC en pasos significativos en la vía.

Introduction

La recombinación homóloga (HR) es un mecanismo de alta fidelidad de reparación de roturas bicatenarias de ADN (DSB), enlaces cruzados entre cadenas y brechas de ssDNA, así como una vía para la tolerancia al daño del ADN. La FC difiere de las vías propensas a errores para la reparación/tolerancia al daño del ADN, como la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la síntesis de translesiones, en que utiliza un ADN dúplex homólogo intacto como donante para modelar el evento de reparación. Además, muchos de los intermedios clave en la vía de FC son reversibles, lo que permite una regulación exquisita de los pasos individuales de la vía. Durante las fases S, G2 y M del ciclo celular, HR compite con NHEJ para la reparación de los DSB de dos extremos1. Además, la FC es esencial para la replicación del ADN para la reparación del daño del ADN asociado a la replicación, incluidas las brechas de ssDNA y los DSB unilaterales, y como mecanismo de derivación de la lesión del ADN2.

Un intermediario crítico en la vía HR es el bucle de desplazamiento, o bucle D (Figura 1). Después de la resección final, la recombinasa central en la reacción, Rad51, se carga sobre el ssDNA recién resecado de la molécula rota, formando un filamento helicoidal2. Rad51 luego lleva a cabo una búsqueda de homología para identificar un donante homólogo adecuado, típicamente la cromátida hermana en células somáticas. El D-loop se forma cuando el filamento Rad51-ssDNA invade un ADN dúplex homólogo, lo que conduce al emparejamiento de la base Watson-Crick de la hebra rota con la hebra complementaria del donante, desplazando la hebra donante opuesta. La extensión del extremo 3' de la hebra rota por una ADN polimerasa reemplaza las bases que se perdieron durante el evento de daño del ADN y promueve la resolución del intermedio de bucle D extendido en un producto de dsDNA a través del recocido de hebra dependiente de la síntesis (SDSA), la unión de doble Holliday (dHJ) o las subvías HR de replicación inducida por rotura (BIR).

Los ensayos que monitorean físicamente los intermediarios en la vía HR permiten el análisis de los requisitos genéticos para cada paso (es decir, análisis de vía). La formación de DSB, la resección final, las dHJ, las burbujas de replicación BIR y los productos HR se observan fácilmente mediante Southern blotting 3,4,5,6,7. Sin embargo, Southern blotting no informa sobre los bucles D nacientes y extendidos y, por lo tanto, se requiere un método alternativo para medir de manera confiable estas moléculas conjuntas 4,8,9. Una estrategia ampliamente utilizada para analizar la formación naciente del bucle D es la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de Rad51 junto con la PCR cuantitativa (qPCR)10,11. Sin embargo, la asociación de Rad51 con dsDNA medida por ChIP-qPCR es independiente de la homología de secuencia y del factor accesorio Rad51 Rad5410,11. En contraste, una señal apreciable utilizando el método de análisis de bucle D presentado aquí, llamado ensayo de captura de bucle D (DLC), depende de la formación de DSB, homología de secuencia, Rad51 y las proteínas accesorias Rad51 Rad52 y Rad548. El hallazgo de que la formación del bucle D promovido por Rad51 por Saccharomyces cerevisiae depende de Rad54 in vivo está de acuerdo con numerosos experimentos de reconstitución in vitro que indican que Rad54 es necesario para la búsqueda de homología y la formación del bucle D por la levadura en ciernes Rad51 8,12,13,14,15.

Los enfoques actuales para medir la extensión del bucle D, principalmente a través de PCR semicuantitativa, son igualmente problemáticos. Un ensayo típico basado en PCR para detectar la extensión del bucle D amplifica una secuencia única, resultante de la recombinación entre un sitio de ruptura y un donante ectópico y la posterior síntesis de ADN asociada a la recombinación, a través de un cebador aguas arriba de la región de homología en la hebra rota y otro cebador aguas abajo de la región de homología en la cadena donante. Utilizando este método, la detección de la síntesis de ADN asociada a la recombinación requiere el factor de procesividad Pol δ no esencial Pol3216. Este hallazgo entra en conflicto con la observación de que la eliminación de POL32 tiene solo un efecto leve sobre la conversión génica in vivo17. Además, estos ensayos basados en PCR no logran resolver temporalmente la extensión del bucle D y la formación del producto BIR, lo que sugiere que la señal resulta de productos de dsDNA en lugar de intermedios de ssDNA17,18,19. El ensayo de extensión de bucle D (DLE) se desarrolló recientemente para abordar estas discrepancias. El ensayo DLE cuantifica la síntesis de ADN asociada a la recombinación en un sitio ~ 400 pares de bases (pb) aguas abajo del extremo invasor inicial3' 9. Mediante este método, la extensión del bucle D es independiente de Pol32 y es detectable dentro de las 4 h posteriores a la inducción DSB, mientras que los productos BIR se observan por primera vez a las 6 h. De hecho, una publicación reciente de los laboratorios Haber y Malkova señaló que el uso de este método de preparación de ADN genómico resulta singularmente en la preservación del ssDNA 9,20.

Aquí, los ensayos DLC y DLE se describen en detalle. Estos ensayos se basan en la ligadura de proximidad para detectar bucles D nacientes y extendidos en S. cerevisiae (Figura 2)8,9. Los productos BIR se pueden cuantificar utilizando este mismo sistema de ensayo. Para ambos ensayos, la formación de DSB en un sitio de corte de endonucleasa HO ubicado en el locus URA3 en el cromosoma (Chr.) V es inducida por la expresión de la endonucleasa HO bajo el control de un promotor inducible por galactosa. La invasión de la cadena de ADN mediada por Rad51 conduce a la formación naciente del bucle D en el sitio de un donante ectópico ubicado en el locus LYS2 en Chr. II. Como el lado derecho del DSB carece de homología con el donante, la reparación a través de SDSA y la formación de dHJ no es factible. La reparación inicial del DSB por BIR es posible, pero la formación de productos viables es inhibida por la presencia del centrómero21. Este diseño deliberado impide la reparación productiva de DSB, evitando así la reanudación del crecimiento de las células con DBS reparadas, que de otro modo podrían superar el cultivo durante el análisis del curso del tiempo.

En el ensayo DLC, la reticulación de psoraleno de las dos hebras del ADN heterodúplex dentro del bucle D preserva el intermedio de recombinación. Después de la restauración del sitio de la enzima de restricción en la hebra rota (resecada) y la digestión, la reticulación permite la ligadura de las secuencias únicas aguas arriba de los ADN rotos homólogos y donantes. Usando qPCR, se cuantifica el nivel de molécula de ADN quimérico presente en cada muestra. En el ensayo DLE, no se requiere reticulación, y la restauración del sitio de la enzima de restricción y la digestión seguida de la ligadura intramolecular en su lugar vinculan el extremo 5' de la molécula rota al extremo 3' recién extendido. Una vez más, la qPCR se utiliza para cuantificar las cantidades relativas de este producto quimérico en cada muestra. En ausencia de restauración del sitio de la enzima de restricción, el ensayo DLE informa sobre los niveles relativos del producto BIR (dsDNA) que se forma después de la extensión del bucle D.

Se muestran los resultados representativos de cada ensayo con una cepa de tipo salvaje, y los lectores son remitidos a Piazza et al.8 y Piazza et al.9 para el uso de estos ensayos para el análisis de mutantes de recombinación 8,9. La intención de esta contribución es permitir que otros laboratorios adopten los ensayos DLC y DLE, y el soporte para ellos está disponible a pedido.

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Protocol

1. Precrecimiento, inducción DSB y recolección de muestras

NOTA: Se recomienda la suplementación de todos los medios con 0,01% de adenina para las cepas de Ade.

  1. Rayar las cepas haploides apropiadas (ver Tabla 1) en levadura peptona dextrosa adenina (YPDA) ( 1% extracto de levadura, 2% peptona, 2% glucosa, 2% agar, 0,001% adenina) y crecer durante 2 días a 30 °C.
  2. Use una sola colonia para inocular 5 ml de YPDA en un tubo de cultivo de vidrio de 15 ml. Cultivar cultivos hasta la saturación a 30 °C con agitación o rotación para aireación.
  3. Ensayo DLC: Prepare la solución madre de psoraleno 5x (0.5 mg / ml de trioxaleno en etanol a prueba de 200) en una campana extractora disolviendo psoraleno en un tubo cónico de 50 ml envuelto en papel de aluminio durante la noche a temperatura ambiente con agitación o inversión continua. Selle la parte superior de tornillo con una película transparente para evitar la evaporación. No prepare más de 7 ml de solución madre de psoraleno 5x por tubo cónico de 50 ml para asegurar la disolución adecuada del psoraleno.
  4. Al día siguiente, use 5 ml del cultivo YPDA cultivado durante la noche para inocular 50-100 ml de YEP-lactato (1% de extracto de levadura, 2% peptona, 2% p/p de lactato, 0,001% de adenina) en un matraz de tamaño adecuado (la levadura en ciernes crece de manera óptima en un matraz que es al menos 5 veces el volumen del cultivo) a un OD600 de ~0,03.
  5. Cultivar el cultivo durante ~16 h a 30 °C con agitación a 220 rpm. Después de ~16 h, mida el OD600 del cultivo y debe ser ~0.5-0.8. No utilice cultivos submaduros o demasiado grandes.
  6. Para cada punto de tiempo, recoja el volumen apropiado de células en un tubo cónico y colóquelo en hielo. Típicamente, esto es 1 x 108 células (aproximadamente 7,5 ml de cultivo en OD 600 1,0 para una cepa haploide de tipo salvaje) para el ensayo DLC y 5 x 107 células (aproximadamente 2,5 ml de cultivo en OD600 1.0) para el ensayo DLE.
  7. Para garantizar la precisión de los valores de OD 600, prepare diluciones 1:5 para cultivos con un OD600≥0.2 para mantener la lectura de OD en 0.2 o menos. Para las cepas de tipo salvaje, los puntos de tiempo óptimos para el análisis DLC son entre 2 h y 6 h, y los puntos de tiempo óptimos para el análisis DLE son entre 4 h y 8 h (ver Figura 3 y Figura 4).
  8. Ensayo DLC
    1. Antes de cada punto de tiempo, prepare suficiente solución de psoraleno 1x (0,1 mg/ml de trioxsaleno, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% de etanol) en una campana extractora para todas las muestras en un tubo cónico de 50 ml envuelto en papel de aluminio. Salir en RT.
    2. Centrifugar las muestras a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspender el pellet en 2,5 ml de 1x solución de psoraleno en una campana extractora y transferir a una placa de Petri de 60 mm x 15 mm. Alternativamente, resuspenda el pellet en 2,5 ml de solución TE1 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) para un control sin reticulación.
    3. Entrecruza las muestras. Para un ajuste de reticulación UV con bombillas de onda larga (365 nm), coloque las placas de Petri 1-2 cm por debajo de la fuente de luz UV con la tapa retirada sobre una placa de plástico o plexiglás que se haya enfriado previamente a -20 ° C. Para una caja de luz UV, coloque las placas de Petri directamente encima de la fuente de luz UV. Exponga las muestras durante 10 minutos con una agitación suave.
      NOTA: Se recomienda colocar la fuente de luz UV encima de un agitador orbital configurado a ~ 50 rpm.
    4. En una campana extractora, transfiera la muestra a un nuevo tubo de 15 ml. Enjuague la placa de Petri con 2,5 ml de solución TE1 y agréguela al tubo. Centrifugar las muestras a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C, desechar adecuadamente el sobrenadante y almacenar el pellet a -20° C. Las muestras se pueden almacenar hasta 1 semana antes de pasar al siguiente paso.
  9. Ensayo DLE
    1. Centrifugar las muestras a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C. Lavar el pellet de la celda en 2,5 ml de solución TE1 fría antes de repetir el centrifugado y almacenar los gránulos a -20 °C. Las muestras se pueden almacenar hasta 1 semana antes de pasar al siguiente paso.
  10. Para la recolección de muestras a las 0 h, recolectar las muestras antes de la adición de galactosa al 20%. Para puntos de tiempo posteriores, inducir la formación de DSB agregando 20% de galactosa a los cultivos a una concentración final de 2%. Recolectar las muestras restantes como se describió anteriormente, pellets y congelar en relación con el tiempo posterior a la inducción DSB (es decir, la muestra de 4 h se recolecta 4 h después de la adición de galactosa al 20%).

2. Esferoplastia celular, lisis y restauración del sitio de restricción

  1. Descongele las muestras en hielo. Precalentar un baño seco a 30 °C.
  2. Resuspender las muestras en 1 mL de tampón de esferoplasting (0,4 M de sorbitol, 0,4 M KCl, tampón fosfato de sodio de 40 mM pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. Añadir 3,5 μL de solución de zimolyase (2% de glucosa, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/ml de zymolyase 100T; 17,5 μg/ml de zymolyase concentración final). Mezclar suavemente dando golpecitos o inversión. Incubar a 30 °C durante 15 min, y luego colocar en hielo. Durante la incubación de 15 minutos, obtenga nitrógeno líquido o hielo seco.
  4. Centrifugar durante 3 min a 2.500 x g a 4 °C y colocar las muestras en hielo. Lave las muestras 3 veces en 1 ml de tampón de esferaturado. Centrifugar las muestras durante 3 min a 2.500 x g a 4 °C.
  5. Resuspender las muestras en 1 ml de tampón enzimático de restricción 1x frío (50 mM de acetato de potasio, 20 mM de Tris-acetato, 10 mM de acetato de magnesio, 100 μg/mL BSA pH ~8,0 a RT) y centrifugar durante 3 min a 16.000 x g a 4 °C. Coloque las muestras en hielo. Repita el lavado 1x.
  6. Resuspender las muestras en 1 ml de tampón enzimático de restricción 1x frío. Divida la muestra (0,5 ml cada una) en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar las muestras durante 3 min a 16.000 x g a 4 °C.
  7. Resuspender un tubo de cada muestra en 180 μL de tampón enzimático de restricción 1,4x con oligos hibridantes (ver Tabla 2) y un tubo en 180 μL de tampón enzimático de restricción 1,4x sin oligos hibridantes. Cada oligo hibridante se resuspende en 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) y se utiliza a una concentración final de 7 nM. El TE 1x reemplaza los oligos hibridantes en el tampón de la enzima de restricción 1.4x sin hibridar oligos.
    NOTA: Los oligos hibridantes deben almacenarse a −20 °C en pequeñas alícuotas en la dilución de trabajo. La concentración de los oligos hibridantes puede requerir optimización; véase Discusión.
  8. Congele rápidamente las muestras en nitrógeno líquido o hielo seco/etanol y guárdelas a -80 °C. Las muestras se pueden almacenar en esta etapa durante varios meses.

3. Digestión enzimática de restricción y ligadura intramolecular

  1. Descongele las muestras en hielo. Precalentar un baño seco a 65 °C y otro a 37 °C.
  2. Pipet 36 μL de la muestra en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo. Devuelva rápidamente la muestra restante a −80 °C para su almacenamiento.
  3. Añadir 4 μL de SDS al 1% (0,1% de concentración final) y mezclar golpeando suavemente el lado del tubo. Incubar a 65 °C durante 15 min con golpecitos suaves cada 5 min. Colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación.
    NOTA: Este tratamiento SDS promueve la desnaturalización de las proteínas asociadas al ADN, la solubilización de la envoltura nuclear y la accesibilidad a la cromatina antes de los pasos de digestión de enzimas de restricción y ligadura intramolecular.
  4. Añadir 4,5 μL de Triton X-100 al 10% (concentración final al 1%) y mezclar por pipeteo. Añadir 20-50 U de enzima de restricción (EcoRI-HF o HindIII-HF) a cada muestra e incubar a 37 °C durante 1 h con agitación suave cada 20-30 min. Durante este tiempo, precaliente un baño seco a 55 °C y preajuste un baño maría a 16 °C.
  5. Añadir 8,6 μL de SDS al 10% (concentración final del 1,5%) a cada muestra y mezclar mediante pipeteo y roscado. Incubar a 55 °C durante 10 min. Añadir 80 μL de Triton X-100 al 10% (concentración final al 6%) a cada muestra y mezclar por pipeteo.
  6. Añadir 660 μL de 1x tampón de ligadura sin ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2,5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA ligasa (8 U/muestra) a cada muestra y mezclar mediante una inversión suave. Incubar a 16 °C durante 1,5 h con inversión cada 30 min. Colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación.

4. Purificación del ADN

  1. Precalentar un baño seco a 65 °C y otro a 37 °C. Añadir 1 μL de proteinasa K de 10 mg/ml (preparada en 1x TE pH 8,0) a cada muestra (concentración final de 12,5 μg/ml). Incubar a 65 °C durante 30 min y colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación hasta que se hayan enfriado.
  2. Transfiera las muestras a tubos de 2 ml. Trabajando en una campana extractora, agregue un volumen igual (~ 800 μL) de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (P / C / IA; pH 8.0) a cada muestra. Vortex las muestras durante ~30 s y centrifugar las muestras durante 5-10 min a 16.000 x g en una microcentrífuga.
  3. Retire con cuidado 600 μL de la fase superior de cada muestra en un nuevo tubo de 1,5 ml. Deseche adecuadamente los tubos de fase inferior y de 2 ml.
  4. Precipitar el ADN añadiendo un volumen de 1/10 de acetato de sodio 3 M pH 5.2 (~60 μL) a cada muestra, seguido de 1 volumen de isopropanol (~660 μL). Invierta las muestras 5x-10x e incube a RT durante 30 min.
  5. Colocar las muestras en hielo durante 2 min, y luego centrifugar las muestras a 16.500 x g durante 15 min a 4 °C en una microcentrífuga. Devuelva las muestras al hielo, vierta el sobrenadante y drene el tubo en una toalla de papel.
  6. Lave el pellet de ADN con 200 μL de etanol al 70%. Centrifugar a 16.500 x g durante 3 min a 4 °C, volver a colocar las muestras en hielo, verter el sobrenadante y eliminar el alcohol residual con una pipeta. Secar las muestras con las tapas de los tubos abiertas a 37 °C durante 15-20 min.
  7. Resuspender los gránulos de ADN en 50 μL de 1x TE por vórtice. Incubar a RT durante 30 min, vórtice, y luego incubar a 37 °C en un baño seco durante 30 min. Vuelva a vomitar las muestras y luego colóquelas en hielo. Las muestras se pueden almacenar en esta etapa a -20 °C durante varios meses, pero es aconsejable proceder inmediatamente para los pasos de desenlace (DLC solamente) y qPCR.

5. Reversión de enlaces cruzados de psoraleno (solo para el ensayo DLC)

  1. Pipet 9 μL de ADN purificado en un tubo de PCR sobre hielo. Añadir 1 μL de 1 M KOH (0,1 M concentración final). Incubar las muestras a 90 °C durante 30 min en un termociclador.
  2. Añadir 19,73 μL de solución de acetato de sodio (0,1 M de acetato de sodio, 9,6 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). Las muestras pueden almacenarse en esta etapa a -20 °C durante varios meses, pero es aconsejable proceder inmediatamente a la etapa de qPCR.

6. PCR cuantitativa, controles y análisis

  1. Usando 2 μL de ADN purificado, con o sin reticulación, configure una reacción qPCR de 20 μL de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Configura cada reacción por duplicado. Para los ensayos DLC y DLE, hay cinco reacciones de control y una reacción de cuantificación DLC/DLE, o un total de seis reacciones por muestra, ejecutadas por duplicado. La Tabla Suplementaria S1 y la Tabla Suplementaria S2 proporcionan una plantilla para configurar estas reacciones y análisis, y las secuencias de los cebadores de qPCR se enumeran en la Tabla 3.
  2. Las condiciones de ciclo de qPCR deben optimizarse para cada kit de qPCR.
    1. Utilice las siguientes condiciones de qPCR DLC, dependiendo de los kits de qPCR utilizados: desnaturalización inicial (95 °C durante 3 min); 50 rondas de amplificación (95 °C durante 15 s, 61 °C durante 25 s, 72 °C durante 15 s con una sola adquisición); análisis de la curva de fusión (95 °C durante 5 s, 65 °C durante 1 min, 97 °C con adquisición continua); y refrigeración (37 °C durante 30 s).
    2. Utilice las siguientes condiciones de qPCR para el ensayo de DLA: desnaturalización inicial (95 °C durante 5 min); 50 rondas de amplificación (95 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 15 s con una sola adquisición); análisis de la curva de fusión (95 °C durante 5 s, 65 °C durante 1 min, 97 °C con adquisición continua); y refrigeración (37 °C durante 30 s). Tenga en cuenta que puede ser necesaria la optimización para diferentes máquinas/kits de qPCR.
  3. Ensayo DLC
    1. Controles: Consulte la lista de cebadores de qPCR en la Tabla 3. En la Figura S1 se muestra un mapa de los sitios de unión de imprimación. Para archivos de secuencia suplementarios para las características genómicas y amplicones relevantes, verifique los archivos A plásmidos Editor (ApE); Archivos de secuencia suplementaria 1-5.
      1. ADN genómico en ARG4: Utilice olWDH1760/olWDH1761 para amplificar el dsDNA localizado en ARG4. Utilice esta reacción como control de carga y normalice todas las demás reacciones, excepto la reacción de la señal DLC a este control.
      2. Eficiencia de la ligadura intramolecular en DAP2: Utilice el fragmento de 1.904 pb creado por la digestión EcoRI para la ligadura intramolecular en paralelo con la ligadura DLC. La amplificación a través de esta unión de ligadura informa sobre la eficiencia de la ligadura intramolecular y sirve como un control al que se normaliza la señal DLC.
      3. Inducción DSB: Utilice olWDH1766/olWDH1767 para amplificar una región que abarca el DSB inducido.
      4. Reticulación y resección de psoraleno: use olWDH2019/olWDH2020 para amplificar la región única de PhiX aguas abajo del sitio de reconocimiento EcoRI. Sin inversión de reticulación, utilice la proporción de ssDNA (sin reticulación) sobre ARG4 (dsDNA reticulado) para determinar la eficiencia de reticulación. Con la inversión de reticulación, la resección conducirá a una disminución progresiva de 1 a 0,5 de la señal en relación con ARG4.
      5. EcoR I restauración y corte del sitio de reconocimiento: Utilice olWDH1768/olWDH1764 para amplificar una región que abarca el sitio de reconocimiento EcoRI restaurado aguas arriba del DSB en la hebra resecada. olWDH1769/olWDH1763 amplifican una región que abarca el sitio de la enzima de restricción EcoRI en DAP2. Realizar la escisión EcoRI en este sitio para usarla como control de ligadura intramolecular.
    2. Señal DLC: Utilice olWDH1764/olWDH1765 para amplificar la molécula de ADN quimérico creada por la ligadura intramolecular de la hebra resecada (invasora) y el donante.
    3. Análisis: Calcular la media y la desviación estándar de los valores de Cp para cada una de las reacciones duplicadas. Utilice los valores de Cp de qPCR de ADN genómico ARG4 como referencia para normalizar todas las demás qPCR de control. Normalizar la señal DLC al control de ligadura intramolecular en DAP2. Consulte la Figura 3 para conocer los valores típicos de la señal DLC a las 2 h.
  4. Ensayo DLE
    1. Controles: Consulte la lista de cebadores de qPCR en la Tabla 3. En la Figura S1 se muestra un mapa de los sitios de unión de imprimación. Para archivos de secuencia suplementarios para las características genómicas y amplicones relevantes, verifique los archivos A plásmidos Editor (ApE) (Archivos de secuencia suplementaria 1-5).
      1. ADN genómico en ARG4: Ver sección 6.3.1.1.
      2. Eficiencia de la ligadura intramolecular en YLR050C: Utilice la digestión HindIII para crear un fragmento de 765 pb que se someterá a la ligadura intramolecular en paralelo con la ligadura DLE. La amplificación a través de esta unión de ligadura informa sobre la eficiencia de la ligadura intramolecular y sirve como un control al que se normaliza la señal DLE.
      3. Inducción del OSD: Véase la sección 6.3.1.3.
      4. Cierva III restauración y corte del sitio de reconocimiento: Utilice olWDH2010/olWDH2012 y olWDH2009/2011 para amplificar una región que abarca los sitios de enzimas de restricción HindIII en la hebra rota donde se ha resecado y extendido, respectivamente.
    2. Señal DLE: Utilice olWDH2009/olWDH2010 para amplificar la molécula de ADN quimérico creada por la ligadura intramolecular del extremo resecado de la hebra invasora aguas arriba del DSB al extremo recién extendido aguas abajo del DSB.
    3. Análisis: Calcular la media y la desviación estándar de los valores de Cp para cada una de las reacciones duplicadas. Utilice los valores de Cp de qPCR de ADN genómico ARG4 como referencia para normalizar todas las demás qPCR de control. Normalizar la señal DLE al control de ligadura intramolecular en YLR050C. Los valores típicos de la señal DLE a las 6 h se informan en la Figura 4 y en publicaciones anteriores9.

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Representative Results

Ensayo DLC
El ensayo DLC detecta bucles D nacientes y extendidos formados por la invasión de un DSB específico del sitio en un solo donante (Figura 2). La reticulación del psoraleno une físicamente la hebra rota y el donante a través del ADN heterodúplex dentro del bucle D. La restauración del sitio de la enzima de restricción con un oligo hibridante largo en la hebra resecada de la ruptura permite la escisión de la enzima de restricción, seguida de la ligadura de la hebra rota al donante proximal para formar un producto quimérico que se cuantifica mediante qPCR. En particular, la señal DLC depende de la reticulación del psoraleno, el oligo hibridante, la recombinasa central, Rad51 y los factores accesorios Rad51 Rad52 y Rad548. La eliminación de las helicasas/topoisomerasas de ADN Sgs1-Top3-Rmi1, Mph1 y Srs2 conduce a un aumento de la señal DLC.

La Figura 3 muestra los resultados representativos para la cepa estándar de tipo salvaje a 2 h después de la inducción DSB por triplicado con y sin oligo hibridante. Una muestra que falta en un paso clave, la reticulación de psoraleno, también se muestra por duplicado.

Como se muestra en la Figura 3, la reticulación de psoraleno es un paso crítico. Prácticamente no hay señal detectable sin ella8. La eficiencia de reticulación se mide en función de la proporción de amplificación de ssDNA a dsDNA. A diferencia de dsDNA, ssDNA experimenta una reticulación mínima de psoraleno y, por lo tanto, una señal alta indica una reticulación exitosa. La eficiencia de la reticulación varía según el tiempo transcurrido entre la recolección de la muestra y la preparación para la qPCR (Figura 3, panel inferior izquierdo). Cuanto más tiempo transcurra entre la recolección y preparación de la muestra, menos señal se observará para el control de qPCR de eficiencia de reticulación. La variación significativa entre muestras en la señal observada para el control de qPCR de la eficiencia de reticulación es motivo de preocupación, y el curso del tiempo debe descartarse.

ARG4 Los valores de Cp son similares entre las muestras oligo hibridantes y sin hibridación (Figura 3, panel superior izquierdo). Un valor bajo de Cp indica que hay más ADN amplificable. Esto explica por qué los valores de Cp ARG4 para las muestras sin reticulación son significativamente más bajos: la reticulación interfiere con la amplificación por qPCR. Esta diferencia entre las muestras de reticulación con y sin reticulación se aplica a todas las qPCR, excepto al control de qPCR de escisión EcoRI, que amplificará ssDNA/dsDNA no reticulado. Todos los controles de qPCR, pero no la señal DLC, se normalizan a la señal de qPCR ARG4 .

Para todas las muestras, el control de qPCR de ligadura intramolecular está dentro del rango apropiado (Figura 3, panel medio superior), y hay una inducción DSB robusta, como lo demuestra la señal baja para el control de qPCR que se amplifica a través del sitio de reconocimiento de endonucleasas HO (Figura 3, panel superior derecho). En las muestras oligo hibridantes, se observa un corte EcoRI eficiente, y este control de qPCR da una señal baja (Figura 3, panel central inferior). Por el contrario, las muestras de oligo sin hibridación con reticulación dan una señal alta, similar a lo que se muestra para el control de qPCR de eficiencia de reticulación, ya que, en este caso, el ssDNA sin cortar se amplifica y normaliza a la señal de qPCR ARG4 (dsDNA).

A diferencia de las otras qPCR, la señal de qPCR para el ensayo DLC se normaliza al control de qPCR de ligadura intramolecular, ya que la molécula quimérica cuantificada por la qPCR DLC depende de la ligadura. La mediana de la señal DLC a las 2 h con oligo hibridante es de 0,030 ± 0,0055 (Figura 3, panel inferior derecho), de acuerdo con los resultados publicados previamente para este ensayo8. Como era de esperar, esta señal depende tanto de la hibridación del oligo como de la reticulación del psoraleno.

Ensayo DLE
El ensayo DLE permite el monitoreo preciso de la extensión del bucle D en respuesta a un DSB específico del sitio (Figura 2). Se demostró previamente que la señal DLE depende de Rad51, la recombinasa central en la reacción, que media la invasión de la cadena y, por lo tanto, es necesaria para la síntesis de ADN asociada a la recombinación9. Además, la señal DLE depende de la subunidad catalítica de Pol δ, Pol3 (DR, AP, WDH, datos no publicados) pero no del factor de procesividad no esencial Pol32. En contraste con la señal DLC, que primero se vuelve detectable a las 2 h después de la inducción DSB, la señal DLE primero aumenta notablemente a las 4 h después de la inducción DSB, aumenta dramáticamente entre 4 h y 6 h, y comienza a estabilizarse a partir de entonces, con gran parte del aumento de la señal entre 6 h y 8 h atribuible a la formación de productos BIR8, 9.

Como el producto de ligadura quimérica cuantificado en el ensayo DLE es monocatenario, el esferógrafo celular y la etapa de lisis son críticos. La disminución de la señal DLE puede deberse a problemas con este paso, que pueden liberar nucleasas y provocar la degradación del ssDNA objetivo.

La Figura 4 muestra resultados representativos para la cepa estándar de tipo salvaje a las 6 h después de la inducción DSB por triplicado con y sin oligos hibridantes. La muestra de tipo salvaje sin oligos hibridantes representa solo el producto dsDNA BIR, mientras que la señal con oligo se deriva tanto del ssDNA del D-loop extendido como del producto dsDNA BIR. Se incluye una tercera muestra como ejemplo de un experimento fallido.

ARG4 Los valores de Cp fueron similares entre las muestras de oligos hibridantes y sin hibridación (Figura 4, panel superior izquierdo). ARG4 Los valores de Cp fueron notablemente más bajos para la muestra fallida, lo que indica que esta muestra tiene más ADN genómico que las muestras exitosas. Las señales de qPCR para los controles de qPCR, pero no la señal de DLE, se normalizaron a la señal de qPCR ARG4 . El control de qPCR de ligadura intramolecular reveló una señal aceptable para las muestras de oligos hibridantes con y sin hibridación (entre ~0.15-0.35) pero una señal sustancialmente menor para la muestra fallida (Figura 4, panel medio superior). En esta muestra fallida, la alta cantidad de ADN genómico indicada por el control de qPCR ARG4 probablemente causó que la ligadura intramolecular fallara, ya que una alta concentración de ADN genómico conducirá a la ligadura intermolecular.

En las tres muestras, hubo una inducción DSB robusta (Figura 4, panel superior derecho). Cierva La escisión III tanto en las hebras resecadas como en las extendidas depende de la presencia de los oligos hibridantes. En la hebra extendida, también depende de la extensión del bucle D. Por lo tanto, hubo una diferencia significativa en la amplificación a través del sitio de escisión Hind III en la hebra resecada entre las muestras con y sin oligo (Figura 4, panel inferior izquierdo) y una diferencia menor en la amplificación en el sitio de reconocimiento HindIII en la hebra extendida entre estas muestras (Figura 4, panel central inferior).

Como la señal DLE depende de la ligadura intramolecular, se normaliza al control de qPCR de ligadura intramolecular. La mediana de la señal DLE a las 6 h con oligos hibridantes fue de 0,53 ± 0,17 (Figura 4, panel inferior derecho), consistente con los resultados publicados previamente para este ensayo9. La señal DLE para la muestra de tipo salvaje sin oligos hibridantes fue igualmente compatible con esta publicación anterior. La señal DLE fue más baja de lo esperado para la muestra fallida, lo que probablemente refleja los problemas con esa muestra mencionados anteriormente.

Inversión de enlaces cruzados
El psoraleno intercalado entre pares de bases ApT/TpA en dsDNA puede unirse covalentemente a través de sus anillos de furano y pirona a una o ambas bases de timina opuestas a la irradiación UV, lo que resulta en monoaductos (predominantemente furanos) o diaductos interhebrales (es decir, enlaces cruzados), respectivamente22. Se espera que estas modificaciones bloqueen la progresión de la ADN polimerasa, inhibiendo así la reacción de síntesis de ADN integral a la PCR cuantitativa. En consecuencia, la mayoría de las plantillas de dsDNA no se pueden amplificar (Figura 5A, B). En contraste, la ausencia de pares de bases en ssDNA lo hace menos propenso a la reticulación de psoraleno. Por lo tanto, se amplifica más fácilmente que el dsDNA, lo que distorsiona la cuantificación relativa de ssDNA versus dsDNA y de amplicones de dsDNA de diferentes longitudes y contenido de ApT/TpA (Figura 5A, B). Para superar estas limitaciones, se aplicó una reversión catalizada por bases y calor del paso23 de reversión de reticulación de psoraleno antes de la PCR cuantitativa. Este método solo deja las especies menores de monoaductos de lado de pirona23,24. Condujo a una recuperación de 80 veces del dsDNA genómico y los amplicones de control de ligadura intramolecular, lo que indica que la gran mayoría de las moléculas plantilla tenían al menos un monoaducto del lado del furano o un reticulamiento entre cadenas (Figura 5B, C). La comparación de los valores de Cp del control genómico del ADN dsDNA antes y después de la reversión de la reticulación proporciona una estimación de la eficiencia de reticulación, que debe estar en el rango que se muestra aquí. Más allá de los amplicones cortos, este procedimiento puede restaurar plantillas de hasta 3 kb de longitud (Figura S2). No se observaron cambios para el amplicón de ssDNA, consistente con una falta de reticulación de psoraleno a ssDNA (Figura 5B-D). También muestra que el procedimiento de inversión de reticulación no daña detectablemente el ADN23. La recuperación del amplicón quimera DLC, que contiene un segmento dsDNA reticulado ligado a un segmento ds-ssDNA no reticulado (50 pb y 118 pb/nt; Figura 5A) fue intermedio al de los amplicones de dsDNA y ssDNA, con una mejoría de 8 veces en la recuperación (Figura 5B, C). La reversión de la reticulación no afectó los niveles relativos de los dos amplicones de dsDNA, permaneciendo el control de ligadura intramolecular en el rango de 0.2-0.25 en relación con el control genómico del ADN (Figura 5E). Sin embargo, cambió la cantidad relativa del amplicón de ssDNA en relación con el control de ADN genómico de dsDNA de un exceso de 40 veces al 0,5 veces esperado para un ssDNA en relación con una plantilla de dsDNA (Figura 5D). Del mismo modo, la señal DLC parcialmente ssDNA disminuyó de 6.6 x 10−2 a 6.6 x 10−3 en relación con los controles de ligadura intramolecular de dsDNA (Figura 5F). Esto nos lleva a estimar que el número de moléculas de la articulación del bucle D en un donante intercromosómico detectado por este enfoque 4 h después de la inducción DSB es un promedio del 1,3% del total de moléculas rotas en la población celular. Tales estimaciones absolutas no se pudieron hacer con la distorsión basada en psoraleno de la amplificación de dsDNA y ssDNA, lo que resalta el valor de este paso adicional de inversión de reticulación.

Figure 1
Figura 1: Subvías homólogas de recombinación y resolución. Después del daño del ADN que resulta en un DSB de uno o dos extremos (mostrado) o una brecha de ssDNA, la resección de 5' a 3' de los extremos de ADN revela 3' voladizos de ssDNA en los que se forma el filamento Rad51, ayudado por sus factores accesorios. Rad51 luego busca en el genoma un ADN dúplex intacto (es decir, el donante) en el que modelar el evento de reparación. Este proceso culmina en la invasión de la cadena de ADN, en la que la base de Watson-Crick de la hebra rota se empareja con la hebra complementaria del donante de ADN bicatenario, desplazando la hebra opuesta y formando el naciente bucle D. Este bucle D puede revertirse para permitir que la búsqueda de homología Rad51 seleccione un donante diferente o extenderse mediante una ADN polimerasa para reemplazar las bases perdidas durante el evento de daño del ADN. Hay tres subvías de recursos humanos disponibles para resolver este intermedio de bucle D extendido en un producto. Primero, el D-loop extendido puede ser interrumpido por una helicasa, permitiendo que el extremo recién extendido de la rotura se reúna hasta el segundo extremo en un proceso denominado recocido de hebra dependiente de síntesis (SDSA). La síntesis de ADN de relleno y la ligadura conducen a la formación del producto. Alternativamente, el segundo extremo de la rotura puede recunirse a la hebra donante desplazada, formando una unión de doble Holliday (dHJ). La resolución nucleolítica del dHJ da como resultado un cruce (CO) o no cruzado (NCO), mientras que la disolución de dHJ (no mostrada) da como resultado solo productos NCO. Por último, si no se activa el segundo extremo del OSD, se produce la replicación inducida por rotura (BIR), un proceso mutagénico en el que se copian miles de pares de bases del donante a la hebra rota. Este proceso puede extenderse hasta la horquilla de replicación convergente o el final del cromosoma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La premisa de los ensayos de formación de productos de captura de bucle D (DLC), extensión de bucle D (DLE) y replicación inducida por rotura (BIR). La formación de DSB es impulsada por una endonucleasa específica del sitio bajo el control del promotor GAL1 . La inducción DSB conduce a la formación de un naciente D-loop. En el ensayo DLC, la reticulación entre hebras del ADN preserva esta estructura, que luego se extrae. La restauración del sitio de la enzima de restricción se logra a través de la hibridación con un oligonucleótido largo, y luego el ADN se digiere y se liga para formar un producto que puede cuantificarse mediante PCR cuantitativa (qPCR). El ensayo DLE difiere en que el ADN no está reticulado, y en su lugar, el producto de ligadura intramolecular se forma entre los dos extremos del ssDNA en un lado de la ruptura, el extremo 3' ha sido extendido por una ADN polimerasa. La qPCR se utiliza de nuevo para cuantificar la formación del producto de ligadura quimérica. La detección de la extensión del bucle D a través del ensayo DLE también requiere la restauración del sitio de la enzima de restricción. Por el contrario, el producto BIR bicatenario se detecta utilizando los cebadores del ensayo DLE sin los oligonucleótidos hibridantes. R indica que un sitio enzimático de restricción es competente para la escisión enzimática; (R) indica un sitio de enzima de restricción que no se puede cortar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Resultados representativos del análisis de ensayo DLC de bucles D a las 2 h posteriores a la inducción DSB. Las muestras fueron recolectadas, preparadas y analizadas por qPCR como se describe en este protocolo. Los símbolos azules representan los resultados de la cepa estándar de tipo salvaje con oligos hibridantes para n = 3. Los símbolos verdes representan los resultados de la cepa de tipo salvaje sin hibridar oligos para n = 3. La línea roja gruesa muestra la mediana. Los símbolos púrpuras representan muestras sin reticulación de psoraleno pero con oligos hibridantes para n = 2. Los símbolos indican que las muestras se derivan de la misma referencia. Las diferencias interexperimentales en la eficiencia de reticulación pueden introducir variabilidad en ciertos controles de qPCR, pero no son problemáticas siempre que no haya variabilidad entre muestras en estos controles de qPCR dentro de un experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados representativos del análisis del ensayo DLE 6 h después de la inducción DSB. Las muestras fueron recolectadas, preparadas y analizadas por qPCR como se describe en este protocolo. Los símbolos azules representan los resultados de la cepa estándar de tipo salvaje con oligos hibridantes para n = 3. Los símbolos verdes representan los resultados de la cepa de tipo salvaje sin hibridar oligos para n = 3. La línea roja gruesa muestra la mediana. Tenga en cuenta que las muestras de oligos con y sin hibridación se derivan de las mismas culturas. El diamante púrpura representa una muestra fallida sin oligos hibridantes para n = 1. Los símbolos indican que las muestras se derivan de la misma referencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Resultados representativos de la reversión de enlaces cruzados de psoraleno. (A) Los monoaductos de psoraleno-ADN (*) y los enlaces cruzados entre cadenas (X) ocurren específicamente en el dsDNA y evitan su amplificación por las ADN polimerasas, a diferencia de las plantillas de ssDNA. Esta diferencia introduce un sesgo en la cuantificación de las plantillas que contienen dsDNA y ssDNA mediante qPCR. Este sesgo se puede superar al revertir la reticulación del psoraleno. (B) Valores representativos de Cp de dsDNA (genómica, ligadura), ssDNA y amplicones mixtos ds-ssDNA (DLC) obtenidos 4 h después de la inducción DSB. Los datos representan valores individuales y la mediana de cuatro réplicas biológicas. (C) Recuperación de amplificación tras la inversión de reticulación, calculada a partir de los valores de Cp en (B). (D) La amplificación de ssDNA en relación con el control genómico de dsDNA con y sin reversión de enlaces cruzados de psoraleno. Tras la reversión, el amplicón de ssDNA se amplifica al 0,5 esperado del control genómico de dsDNA. (E) El control de la ligadura intramolecular de dsDNA en relación con el control genómico de dsDNA con y sin reversión de reticulación de psoraleno. (F) La señal DLC relativa al control de ligadura de dsDNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Sistema de ensayo DLC/DLE actual y las modificaciones propuestas. Arriba: Se muestra el sitio de ruptura del ensayo DLC / DLE actual y el donante. Abajo: Modificaciones planificadas al sitio de interrupción del ensayo DLC/DLE y al donante. (I) El sitio de corte de la endonucleasa HO de 117 pb está indicado en amarillo. Para evitar efectos de confusión mientras se monitorea la interrupción del bucle D, el lado izquierdo del HOcs (74 pb) se introducirá en el donante, de modo que la recombinación entre los dos crea un bucle D perfectamente emparejado que carece de un colgajo de 3 '. (II) Para que el sistema sea reparable y, por lo tanto, más fisiológico, se insertará ADN homólogo al donante (indicado en verde azulado y lila) en el lado derecho del HOcs. (III) La invasión y extensión por la hebra a la derecha del HOcs se controlará utilizando secuencias únicas para ese lado de la ruptura (indicadas en naranja). (IV) Los sitios y secuencias adicionales de enzimas de restricción espaciadas uniformemente únicas para el donante permitirán que la extensión del bucle D (a través de la invasión desde el lado izquierdo del HOcs) se monitoree en sitios más distantes. En este sistema modificado, el recocido de hebra dependiente de la síntesis (SDSA) o la formación de unión de doble Holliday (dHJ) pueden ocurrir en los sitios mostrados en verde azulado o lila. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria S1: Mapa de los cebadores qPCR utilizados en los ensayos DLC y DLE. Mapa de los loci genómicos utilizados para el análisis en los ensayos DLC y DLE, sus características relevantes y los sitios de unión aproximados del cebador (consulte la Tabla 3 para obtener una lista de cebadores qPCR). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S2: Evaluación cualitativa de la inversión de enlaces cruzados en amplicones grandes. El ADN genómico se preparó a partir de muestras reticuladas o no reticuladas, cuando se indicó, como se describe en el protocolo, secciones 1-5. Se utilizó PCR no cuantitativa para amplificar el segmento de 3 kbp que abarca la región de homología compartida entre el sitio de ruptura y el donante. Tenga en cuenta que, debido a las diferencias en la eficiencia de amplificación entre el ADN reticulado y no reticulado y la cantidad limitada de muestra, no fue posible estandarizar el ADN de entrada. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 1: Cepa de S. cerevisiae utilizada para el análisis de ensayos DLC y DLE. Genotipo de la cepa de levadura en gemación haploide utilizada en este estudio. La variedad está disponible bajo petición. Se pueden encontrar cepas adicionales disponibles para el análisis de ensayos DLC/DLE en Piazza et al.8 y Piazza et al.9. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Oligonucleótidos hibridantes utilizados para el análisis de ensayos DLC y DLE. Las secuencias de los oligonucleótidos largos e hibridantes utilizados en los ensayos DLC y DLE. Se recomienda la purificación adicional SDS-PAGE de los oligonucleótidos hibridantes por parte del proveedor de oligonucleótidos personalizados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: cebadores qPCR utilizados para el análisis de ensayos DLC y DLE. Los pares de cebadores de qPCR para los ensayos DLC y DLE y las descripciones de sus propósitos. Tenga en cuenta que olWDH1764, olWDH2009 y olWDH2010 se utilizan en dos qPCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria S1: Plantilla para la configuración y análisis de qPCR del ensayo DLC. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria S2: Plantilla para la configuración y análisis de qPCR del ensayo DLE. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivos de secuencia suplementaria 1-5. Archivos de secuencia suplementarios para las características genómicas y amplicones relevantes. Los archivos de secuencia están en el formato de archivo ApE; ApE es un software disponible gratuitamente para ver y editar secuencias de ADN. Los archivos ApE también son compatibles con todos los principales programas de edición de secuencias. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Los ensayos presentados permiten la detección de bucles D nacientes y extendidos (ensayo DLC), extensión de bucle D (ensayo DLE) y formación de productos BIR (ensayo DLE sin oligonucleótidos hibridantes) utilizando ligadura de proximidad y qPCR. La ChIP-qPCR de Rad51 a sitios distantes del DSB se ha utilizado previamente como un proxy para la búsqueda de homología mediada por Rad51 y la formación de bucle D. Sin embargo, esta señal ChIP-qPCR es independiente de la homología de secuencia entre el sitio de ruptura y un donante potencial, así como del factor Rad54 asociado a Rad51, y es, por lo tanto, más probable que represente una asociación transitoria entre el filamento Rad51-ssDNA y dsDNA en lugar de un intermedio D-loop10,11. En contraste, la señal DLC depende de la formación de DSB, Rad51, Rad52, Rad54 y la homología de secuencia compartida entre el DSB y el sitio donante ensayado8. Además, se observa un aumento de las señales DLC en ausencia de las helicasas Mph1 y Srs2, y el complejo helicasa-topoisomerasa Sgs1-Top3-Rmi1, en consonancia con informes anteriores de que estos tres factores pueden desmontar los bucles D nacientes fabricados por Rad51/Rad54 in vitro 8,25,26,27. El ensayo DLE representa de manera similar una mejora con respecto a los métodos anteriores para seguir la síntesis de ADN asociada a la recombinación, ya que puede distinguir entre la extensión del bucle D y la formación de productos BIR19.

Como se mencionó anteriormente, los controles de qPCR, incluidos los del ADN genómico, la inducción DSB, la reticulación de psoraleno, la ligadura intramolecular y la hibridación de oligonucleótidos, son fundamentales para el éxito y la reproducibilidad de estos ensayos. Los valores de qPCR de ADN genómico bruto deben ser aproximadamente equivalentes entre las muestras. Los valores bajos de Cp para el control genómico del ADN ARG4 indican un exceso de ADN, y se debe ajustar el número de células recolectadas. Los valores altos de Cp para este control indican una recuperación insuficiente del ADN o contaminación con reactivos que interfieren con la qPCR. Después del esferoplastoplasto, la lisis celular se puede observar utilizando un microscopio óptico estándar y volúmenes iguales de muestra y agua estéril. Si se observa una lisis insuficiente tras la adición de agua, la solución de zimolyase debe rehacerse, o la incubación a 30 °C debe prolongarse. La muestra también puede perderse o introducirse contaminantes durante la purificación del ADN mediante extracción P / C / IA. Para la recuperación eficiente del ADN, uno debe asegurarse de que el pH del P / C / IA se haya ajustado a ~ 8.0 y que la fase inferior no se altere mientras se elimina la fase superior. Por último, la resuspensión ineficiente del pellet de ADN en 1x TE puede resultar en valores bajos de Cp. Una incubación más larga a 37 °C y vórtice mejorará la resuspensión del pellet de ADN.

Además del control genómico del ADN genómico, las reacciones de control de escisión de la enzima de inducción y restricción DSB también deben ser similares en todas las muestras. El corte de la endonucleasa HO o de la enzima de restricción en el sitio del DSB o el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción impide la amplificación en esta región; por lo tanto, los valores normalizados típicos de qPCR para estos controles son cercanos a cero, y un valor alto de qPCR indica una escisión insuficiente. Si se observa una señal alta en el sitio del DSB, la solución de galactosa debe rehacerse. Para mutantes con un defecto conocido del ciclo celular, la inducción DSB debe cuantificarse mediante el recubrimiento de cantidades iguales de cultivo cultivadas de acuerdo con el protocolo (ver sección 1) en YPDA e YPA media suplementados con galactosa. Las colonias que crecen en medios que contienen galactosa representan levaduras en las que la unión final creó un HOcs tío. Si hay significativamente más eventos de unión final en un mutante de interés en relación con el tipo comodín, se debe aplicar una corrección para compensar esta diferencia en la inducción DSB, que afectará la señal DLC/DLE.

Tres pares de cebadores (olWDH1764/olWDH1768, olWDH2010/olWDH2012 y olWDH2009/olWDH2011) evalúan la restauración del sitio de la enzima de restricción mediante la hibridación de oligos y el corte por las enzimas de restricción EcoRI-HF y HindIII-HF. Además, los controles de ligadura intramolecular también dependen de una digestión enzimática de restricción adecuada. Por lo tanto, una muestra con baja eficiencia de ligadura intramolecular y una señal alta para uno de estos tres pares de cebadores tiene un corte enzimático de restricción insuficiente. Se debe proporcionar una enzima de restricción adicional en preparaciones posteriores, y la eficacia de la enzima de restricción debe evaluarse en el ADN genómico. El par de cebadores olWDH1769/olWDH1763 representa un control adicional para el ensayo DLC, que mide la escisión de EcoRI en DAP2, donde también se mide la eficiencia de la ligadura intramolecular. Una muestra con una señal de ligadura intramolecular adecuada pero una señal alta para uno de estos tres pares de cebadores tiene una restauración inadecuada del sitio enzimático de restricción por los oligos hibridantes. Para abordar este problema, se deben recolectar muestras duplicadas y se debe variar la concentración de los oligos hibridantes afectados. Los valores típicos de qPCR obtenidos para estas reacciones con y sin oligos hibridantes se pueden encontrar en la Figura 3 y la Figura 4 y en Piazza et al.8 y Piazza et al.9.

Tanto para el DLC como para el ensayo DLE, una eficiencia de ligadura intramolecular de 0.15-0.35 normalizada al control genómico del ADN se considera normal. Como la detección de bucles D nacientes y extendidos y el producto BIR depende de una ligadura eficiente, las muestras con señales de ligadura bajas deben descartarse. El tampón de ligadura 10x que carece de ATP debe almacenarse a 4 °C durante no más de 6 meses. La recolección de demasiadas células puede conducir a la ligadura intermolecular, lo que dará como resultado una baja eficiencia de ligadura intramolecular y una señal DLC / DLE.

Aunque estos controles para los ensayos DLC y DLE informan sobre casi todos los pasos sensibles, todavía es posible obtener valores no fisiológicos para la señal DLC o DLE cuando estos controles están dentro del rango apropiado. Una señal DLC o DLE baja puede ser el resultado de errores en el paso de esferatomizado celular, que es extremadamente sensible. Se deben procesar solo unas pocas muestras en paralelo y mantenerlas a 4 °C en todo momento. Una señal DLC/DLE alta/baja también puede resultar de recolectar demasiadas/pocas celdas en cada punto de tiempo. Este problema se puede solucionar recolectando múltiples OD600s de celdas en cada punto de tiempo para cada muestra.

Existen varias limitaciones técnicas y conceptuales para los ensayos DLC y DLE en su forma actual. Primero, la densidad de reticulación entre hebras mediada por psoraleno es ~ 1 en 500 pb8. Por lo tanto, una señal DLC aumentada puede indicar que hay más bucles D en la población, que la longitud promedio de los bucles D en la población ha aumentado (suponiendo que los bucles D pueden ser menores de 500 pb), o ambos. Además, la probabilidad de que un D-loop sea capturado por el ensayo DLC disminuye con la disminución de la longitud del D-loop. Dado que los bucles D muy cortos pueden representar una fracción significativa de la población total de bucles D en ciertos fondos mutantes, esta limitación del ensayo debe considerarse al interpretar los resultados. En segundo lugar, el ensayo DLC requiere reticulación de ADN, mientras que el ensayo DLE no. Anteriormente, para un experimento determinado, esto significaba que las muestras DLC y DLE tenían que ser recolectadas y analizadas por separado. El método que se muestra en la Figura 5 logra una inversión robusta de la reticulación, aliviando la necesidad de recolectar varias muestras de la misma cultura. La introducción de un segundo sitio de enzimas de restricción EcoRI en la hebra rota, aguas abajo del sitio de reconocimiento HindIII, permitirá el análisis secuencial de DLC y DLE.

Además de estas limitaciones técnicas, el sistema de ensayo DLC y DLE actualmente no permite la recuperación de productos HR viables porque el lado derecho del DSB inducible carece de homología con el donante. Para comprender mejor la cinética y el mecanismo del compromiso y la síntesis del segundo extremo, el sistema podría modificarse de tal manera que sea factible la reparación utilizando una región de homología proximal o distal compartida entre el segundo extremo de la ruptura y el donante (Figura 6). De cara al futuro, puede resultar perspicaz combinar los ensayos DLC y DLE con otras tecnologías, como ChIP-qPCR, captura de conformación cromosómica de alto rendimiento (Hi-C) y mapeo de bucle D in vivo , para lograr un análisis exhaustivo de la cinética y la regulación de los pasos en la vía HR, incluida la formación de roturas, la resección final, la formación de filamentos Rad51, la formación de bucle D naciente, Extensión del bucle D, inversión del bucle D, compromiso del segundo extremo, síntesis del segundo extremo y resolución28.

En resumen, los ensayos DLC y DLE permiten la cuantificación de bucles D nacientes y extendidos, extensión de bucle D y formación de productos BIR utilizando el principio de ligadura de proximidad. Estos ensayos representan avances importantes en el campo, ya que son los primeros en permitir la medición semicuantitativa de la formación y extensión del bucle D independientemente de la viabilidad celular.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El trabajo en el laboratorio Heyer está respaldado por las subvenciones GM58015 y GM137751 a W.-D.H. La investigación en el laboratorio Piazza cuenta con el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (ERC-StG 3D-loop, gran acuerdo 851006). D.R. cuenta con el apoyo de T32CA108459 y la Fundación A.P. Giannini. Agradecemos a Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) por compartir los resultados de su ensayo DLC/DLE y por validar adicionalmente los cambios en los ensayos que se detallan en este protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup Sigma-Aldrich L1375 For media preparation
Agar Fisher BP1423500 For media preparation
Bacto peptone BD Difco 211840 For media preparation
Bacto yeast extract BD Difco 212750 For media preparation
D-(+)-glucose BD Difco 0155-17-4 For media preparation
Trioxsalen Sigma-Aldrich T6137 For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T US Biological Z1004 For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF New England Biolabs R3101 Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF New England Biolabs R3104 Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 Sigma-Aldrich P2069 DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480 Roche 5015278001 qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white Roche 4729692001 96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix BioRad 1725271 qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001 qPCR kit used by the authors

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References

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Genética Número 187 D-loop estabilidad del genoma molécula articular Rad51 replicación inducida por rotura
Detección de intermediarios de recombinación homóloga <em>mediante</em> ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
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Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A.,… More

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A., Heyer, W. D. Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (187), e64240, doi:10.3791/64240 (2022).

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