ATAC-Seq Optimalisatie voor Kanker Epigenetica Onderzoek

Samenvatting

ATAC-seq is een DNA-sequencingmethode die de hyperactieve mutant transposase, Tn5, gebruikt om veranderingen in chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen, gemedieerd door transcriptiefactoren. ATAC-seq maakt de ontdekking mogelijk van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische veranderingen in kankercellen. Dit protocol schetst optimalisatieprocedures voor ATAC-seq in epitheelceltypen, waaronder kankercellen.

Samenvatting

De test voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq) onderzoekt de toegankelijkheid van desoxyribonucleïnezuur (DNA) met behulp van het hyperactieve Tn5-transposase. Tn5 snijdt en ligeert adapters voor high-throughput sequencing binnen toegankelijke chromatinegebieden. In eukaryote cellen is genomisch DNA verpakt in chromatine, een complex van DNA, histonen en andere eiwitten, dat fungeert als een fysieke barrière voor de transcriptionele machinerie. Als reactie op extrinsieke signalen rekruteren transcriptiefactoren chromatineremodelleringscomplexen om toegang tot de transcriptionele machinerie mogelijk te maken voor genactivering. Daarom is het identificeren van open chromatinegebieden nuttig bij het monitoren van versterker- en genpromotoractiviteiten tijdens biologische gebeurtenissen zoals kankerprogressie. Omdat dit protocol gemakkelijk te gebruiken is en een lage celinvoervereiste heeft, is ATAC-seq op grote schaal gebruikt om open chromatinegebieden in verschillende celtypen, waaronder kankercellen, te definiëren. Voor succesvolle data-acquisitie moeten verschillende parameters worden overwogen bij het voorbereiden van ATAC-seq-bibliotheken. Onder hen zijn de keuze van de cellysebuffer, de titratie van het Tn5-enzym en het startvolume van cellen cruciaal voor de atac-seq-bibliotheekvoorbereiding in kankercellen. Optimalisatie is essentieel voor het genereren van hoogwaardige gegevens. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de ATAC-seq-optimalisatiemethoden voor epitheelceltypen.

Inleiding

Chromatine toegankelijkheid is een belangrijke vereiste voor de regulatie van genexpressie op een genoombrede schaal¹. Veranderingen in de toegankelijkheid van chromatine worden vaak geassocieerd met verschillende ziektetoestanden, waaronder kanker ^2,3,4. In de loop der jaren zijn tal van technieken ontwikkeld om onderzoekers in staat te stellen het chromatinelandschap te onderzoeken door gebieden van chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen. Sommigen van hen omvatten DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)⁵, F....

Protocol

1. Voorbereidingen voordat het experiment begint

1. Bereid lysis buffervoorraad voor.
   OPMERKING: De optimale nucleaire isolatiebuffer kan voor elk celtype anders zijn. We raden aan om zowel de hypotone buffer die in het originele artikel⁸ is gebruikt als een CSK-buffer^12,13 voor elk celtype te testen met behulp van trypanblauwe kleuring.
   1. Om hypotone buffer (Greenleaf buffer) te bereiden, mengt u 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ en 0,1% NP-40.
   2. Om CSK-buffer te bereiden, mengt u 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM su....

Resultaten

Om succesvolle en hoogwaardige ATAC-seq-gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om de experimentele omstandigheden te optimaliseren. ATAC-seq bibliotheekvoorbereiding kan worden onderverdeeld in de vijf belangrijkste stappen (figuur 1), namelijk cellyse, tagmentatie (fragmentatie en adapterinbrenging door Tn5), genomische DNA-zuivering, PCR-amplificatie en gegevensanalyse. Als eerste proces moet de cellysisbuffer (nucleaire isolatie) eerst voor elk celtype worden geoptimaliseerd. Ofwel de .......

Discussie

ATAC-seq is op grote schaal gebruikt voor het in kaart brengen van open en actieve chromatinegebieden. De progressie van kankercellen wordt vaak aangedreven door genetische veranderingen en epigenetische herprogrammering, wat resulteert in veranderde chromatinetoegankelijkheid en genexpressie. Een voorbeeld van deze herprogrammering wordt gezien tijdens de epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) en het omgekeerde proces, mesenchymale naar epitheliale overgang (MET), waarvan bekend is dat het belangrijke cellulaire h.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500	Natural
10 µL XL TipOne tips	USA Scientific	1120-3810	Gefilterd en met lage retentie
100 µL XL TipOne RPT tips	USA Scientific	1182-1830	Gefilterd en met lage retentie
100 µL XL TipOne tips	USA Scientific	1120-1840	Gefilterd en met lage retentie. Bevelled Grade
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352096
20 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1183-1810	Gefilterd en met lage retentie
200 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1180-8810	Gefilterd en met lage retentie
50 mL Centrifuge Tubes	Fisherbrand	06-443-19
Agarose	ThermoFisher Scientific	YBP136010	Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCC	ATCC
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman Coulter	364658	SX2415
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	Bead purification kit
CellDrop Cell Counter	DeNovix	CellDrop FL	Cell counter
EDTA	MilliporeSigma	EDS	BioUltra, watervrij, ≥99% (titratie)
EGTA	MilliporeSigma	E3889
Ethanol 100%	ThermoFisher Scientific	AC615100020	Watervrij; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET Tested	R&D Systems	S10350	Drievoudig 0,1 µm gefilterd
Gibco DMEM 1x	ThermoFisher Scientific	11965092	[+] 4,5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1x	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7,4
Gibco Trypsin-EDTA 1x	ThermoFisher Scientific	25200056	(0,25%), fenolrood
Glycerol	IBI Scientific	56-81-5
Glycine	MilliporeSigma	G8898
HCl	MilliporeSigma	H1758
HEPES	MilliporeSigma	H3375
Invitrogen Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q32857
MgCl2	MilliporeSigma	M3634
MinElute PCR Purification kit	Qiagen	28004	DNA-zuiveringskit
NaCl	IBI Scientific	7647-14-5
NaOH	MilliporeSigma	S8045	BioXtra, ≥98% (acidimetrisch), pellets (watervrij)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541
Nextera DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-121-1030	2x TD en Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)	MilliporeSigma	I8896	voor moleculaire biologie
PCR Detection System	BioRad	1855484	CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPES	MilliporeSigma	P1851	BioPerformance Certified, geschikt voor celcultuur
Qubit dsDNA HS Assay kit	ThermoFisher Scientific	Q32854	Invitrogen; Nucleïnezuurkwantitatiekkit
Quibit Assay Tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856	Invitrogen
SDS	MilliporeSigma	L3771
Sodium Acetate	Homemade	-	pH 5,2
Sucrose	IBI Scientific	57-50-1
SYBR Gold	ThermoFisher Scientific	S11494
SYBR Green Supermix, 1,25 mL	BioRad	1708882
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
TempAssure 0,2 mL PCR 8-Tube Strips	USA Scientific	1402-4700	Flex-free, natuurlijk, polypropyleen
TempPlate 384-WELL PCR PLATE	USA Scientific	1438-4700	Single notch. Natuurlijk polypropyleen
Tris Base	MilliporeSigma	648311	ULTROL Grade
Triton x-100	IBI Scientific	9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit	Illumina	PE-121-1003	paired-end
Trypan Blue Stain	ThermoFisher Scientific	Q32851
Tween-20	MilliporeSigma	P7949	BioXtra, stroperige vloeistof
Water	MilliporeSigma	W3500	sterieel gefilterd, BioReagent, geschikt voor celcultuur