ATAC-seq è un metodo di sequenziamento del DNA che utilizza la trasposasi mutante iperattiva, Tn5, per mappare i cambiamenti nell'accessibilità della cromatina mediati da fattori di trascrizione. ATAC-seq consente la scoperta dei meccanismi molecolari alla base delle alterazioni fenotipiche nelle cellule tumorali. Questo protocollo delinea le procedure di ottimizzazione per ATAC-seq nei tipi di cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali.
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Articolo metodologico
Ottimizzazione ATAC-Seq per la ricerca sull'epigenetica del cancro
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il test per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) sonda l'accessibilità dell'acido desossiribonucleico (DNA) utilizzando la trasposasi Tn5 iperattiva. Tn5 taglia e lega gli adattatori per il sequenziamento ad alta produttività all'interno di regioni di cromatina accessibili. Nelle cellule eucariotiche, il DNA genomico è impacchettato in cromatina, un complesso di DNA, istoni e altre proteine, che funge da barriera fisica al meccanismo trascrizionale. In risposta a segnali estrinseci, i fattori di trascrizione reclutano complessi di rimodellamento della cromatina per consentire l'accesso al meccanismo trascrizionale per l'attivazione genica. Pertanto, l'identificazione delle regioni aperte della cromatina è utile quando si monitorano le attività del potenziatore e del promotore genico durante eventi biologici come la progressione del cancro. Poiché questo protocollo è facile da usare e ha un basso requisito di input cellulare, ATAC-seq è stato ampiamente adottato per definire regioni aperte della cromatina in vari tipi di cellule, comprese le cellule tumorali. Per una corretta acquisizione dei dati, è necessario considerare diversi parametri durante la preparazione delle librerie ATAC-seq. Tra questi, la scelta del tampone di lisi cellulare, la titolazione dell'enzima Tn5 e il volume iniziale delle cellule sono cruciali per la preparazione della libreria ATAC-seq nelle cellule tumorali. L'ottimizzazione è essenziale per generare dati di alta qualità. Qui, forniamo una descrizione dettagliata dei metodi di ottimizzazione ATAC-seq per i tipi di cellule epiteliali.
Introduzione
L'accessibilità della cromatina è un requisito chiave per la regolazione dell'espressione genica su scala genomica1. I cambiamenti nell'accessibilità della cromatina sono frequentemente associati a diversi stati patologici, incluso il cancro 2,3,4. Nel corso degli anni, sono state sviluppate numerose tecniche per consentire ai ricercatori di sondare il paesaggio della cromatina mappando le regioni di accessibilità della cromatina. Alcuni di essi includono DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldeh....
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Protocollo
1. Preparativi prima di iniziare l'esperimento
- Preparare la scorta tampone di lisi.
NOTA: il buffer di isolamento nucleare ottimale può essere diverso per ogni tipo di cella. Si consiglia di testare sia il tampone ipotonico utilizzato nell'articolo originale8 che un tampone CSK12,13 per ciascun tipo di cellula utilizzando la colorazione blu tripano.- Per preparare il tampone ipotonico (tampone Greenleaf), mescolare 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 e 0,1% NP-40.
- Per preparare il tampone CSK, miscelare 10 mM PIPES pH 6....
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Risultati
Per ottenere dati ATAC-seq di successo e di alta qualità, è importante ottimizzare le condizioni sperimentali. La preparazione della libreria ATAC-seq può essere suddivisa nelle cinque fasi principali (Figura 1), vale a dire lisi cellulare, tagmentazione (frammentazione e inserimento dell'adattatore da parte di Tn5), purificazione del DNA genomico, amplificazione PCR e analisi dei dati. Come processo iniziale, il tampone di lisi cellulare (isolamento nucleare) deve essere prima ottimizzato p.......
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Discussione
ATAC-seq è stato ampiamente utilizzato per mappare regioni di cromatina aperte e attive. La progressione delle cellule tumorali è spesso guidata da alterazioni genetiche e riprogrammazione epigenetica, con conseguente alterazione dell'accessibilità della cromatina e dell'espressione genica. Un esempio di questa riprogrammazione è visto durante la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e il suo processo inverso, la transizione mesenchimale-epiteliale (MET), che sono noti per essere processi chiave di riprogrammazione c.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non ci sono interessi finanziari rilevanti o materiali relativi alla ricerca descritta in questo documento.
Ringraziamenti
Riconosciamo con gratitudine la struttura UND Genomics Core per l'eccezionale assistenza tecnica.
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health [P20GM104360 to M.T., P20 GM104360 to A.D.] e dai fondi start-up forniti dalla University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [to M.T.].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µ L XL TipOne punte | USA Scientific | 1120-3810 | Filtrato e a bassa ritenzione |
| 100 &; L XL TipOne Punte RPT | USA Scientific | 1182-1830 | Filtrate e a bassa ritenzione |
| 100 &; L XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtrato e a bassa ritenzione. Provette |
| da centrifuga coniche da 15 mL | Corning | 352096 | |
| 20 &; L TipOne Punte RPT | USA Scientific | 1183-1810 | Filtrate e a bassa ritenzione |
| 200 &; L TipOne Punte RPT | USA Scientific | 1180-8810 | filtrate e a bassa ritenzione |
| Fisherbrand | 06-443-19 | ||
| Agarosio | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Grado di analisi genetica |
| Tutte le linee cellulari utilizzate in questo studio sono ottenute da ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| Perline AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Kit di purificazione |
| perline CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anidro, ≥ 99% (titolazione) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Etanolo 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anidro; Fisher Scientific - Prodotti per la sterilizzazione Decon Labs |
| Siero fetale bovino - Testato TET R | & D Systems | S10350 | Triplo 0.1 µ m filtrato |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4,5 g/L D-glucosio; [+] L-glutammina; [-] Piruvato di sodio |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7,4 |
| Gibco Tripsina-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0,25%), rosso fenolo |
| Glicerolo | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glicina MilliporeSigma | G8898 | ||
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorimetro | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Kit di purificazione del | DNA | Qiagen | 28004 |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥ 98% (acidimetrico), pellet (anidro) |
| NEBNext ad alta fedeltà 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera Kit di preparazione del campione di DNA | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD e Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | per la biologia molecolare |
| PCR Sistema di rilevamento | BioRad | 1855484 | Sistema in tempo reale CFX384. C1000 Touch Termociclatore |
| TUBI | MilliporeSigma | P1851 | Certificato BioPerformance, adatto per colture cellulari |
| Kit di analisi Qubit dsDNA HS | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Kit di quantificazione degli acidi nucleici |
| Quibit Provette per saggi | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Acetato di sodio | Homemade-pH | 5.2 | |
| Saccarosio | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1,25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Termociclatore | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0,2 mL PCR 8 provette Strisce | USA Scientific | 1402-4700 | TempPlate in polipropilene naturale senza flessione |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Tacca singola. Polipropilene naturale |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | accoppiato |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, liquido viscoso |
| Acqua | MilliporeSigma | W3500 | filtrato sterile, BioReagent, adatto per colture cellulari |
Riferimenti
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).<....
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Ristampe e permessi
