Summary
يمكن أن يكون زرع الخلايا العصبية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات الناتجة عن البرمجة العصبية نهجا علاجيا محتملا لاضطرابات النمو العصبي. يصف هذا البروتوكول توليد وزرع سلائف الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية GABAergic في أدمغة الفئران حديثي الولادة ، مما يسمح بالتحقيق على المدى الطويل للخلايا العصبية المطعمة وتقييم إمكاناتها العلاجية.
Abstract
انخفاض عدد أو خلل في interneurons المثبطة هو مساهم شائع في اضطرابات النمو العصبي. لذلك ، فإن العلاج بالخلايا باستخدام الخلايا العصبية البينية لاستبدال أو تخفيف آثار الدوائر العصبية المتغيرة هو وسيلة علاجية جذابة. تحقيقا لهذه الغاية ، هناك حاجة إلى مزيد من المعرفة حول كيفية نضج الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية البينية (hdINs) ودمجها وعملها بمرور الوقت في الدوائر المضيفة. من الأهمية بمكان في اضطرابات النمو العصبي فهم أفضل لما إذا كانت هذه العمليات في الخلايا المزروعة تتأثر بدماغ مضيف متطور وناضج. يصف البروتوكول الحالي توليدا سريعا وعالي الكفاءة ل hdINs من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بناء على التعبير الوراثي لعوامل النسخ Ascl1 و Dlx2. يتم زرع هذه السلائف العصبية من جانب واحد ، بعد 7 أيام في المختبر ، إلى الحصين من الفئران حديثي الولادة 2 يوم من العمر. تنتشر الخلايا العصبية المزروعة في الحصين المماثل والمقابلي لنموذج فأر لمتلازمة الصرع البؤري لخلل التنسج القشري وتبقى على قيد الحياة لمدة تصل إلى 9 أشهر بعد الزرع. يسمح هذا النهج بالتحقيق في الهوية الخلوية والتكامل والوظائف والإمكانات العلاجية للخلايا العصبية الداخلية المزروعة على مدى فترة زمنية طويلة في تطوير أدمغة صحية ومريضة.
Introduction
يحدث إنشاء الشبكات العصبية ونضجها وصقلها خلال الفترة المحيطة بالولادة وفترة ما بعد الولادة المبكرة وتمثل نوافذ زمنية حاسمة لنمو الدماغ1. من وفرة الاتصال بعد الولادة ، يتطور الدماغ إلى ضبط دقيق للاتصالات التي تمتد حتى المراهقة2. وبالتالي ، فإن التغيرات في الجينات المعبر عنها خلال هذه الفترات ، وكذلك العوامل الخارجية أو الإهانات ، تحدد استعداد الفرد لاضطرابات النمو العصبي المتعددة. تتكشف الإعاقات في الإدراك والوظيفة الحركية بمرور الوقت ، والعلاجات الدوائية محدودة ، وتستهدف الغالبية الأعراض مع خطر الآثار الجانبية الشديدة.
ثبت أن الخلل الوظيفي في حمض جاما أمينوبتيريك (GABA) تثبيط ergic هو مساهم رئيسي في السبب الكامن وراء اضطرابات النمو العصبيالمختلفة 3 ، مثل متلازمة X الهشة ومتلازمة أنجلمان والصرع والفصام والتوحد. GABA هو جهاز الإرسال المثبط الرئيسي للجهاز العصبي المركزي وهو فعال للحفاظ على التوازن المثير / المثبط (E / I) ، وتزامن إطلاق الخلايا العصبية ، والحساب. GABAinterneurons ergic هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا العصبية ، مع زيادة التعقيد الوظيفي في مناطق الدماغ الأكثر تعقيدا4 ومع التطور 5,6. بالنظر إلى القدرة التجديدية الداخلية المحدودة للدماغ البشري والآثار المترتبة على خلل الخلايا العصبية في العديد من الاضطرابات العصبية ، قد يكون زرع الخلايا العصبية الداخلية GABAergic وسيلة علاجية واعدة لاستكشافها. على طول هذا الخط ، يبدو أن الخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية البينية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hdINs) هي المصدر الأكثر انتقالية وقابلية للتطبيق لهذا الغرض مقارنة بالسلائف العصبية الخيفية للقوارض أو المصادر الأخرى المستخدمة في أماكن أخرى7. تتوفر بروتوكولات لتوليد الخلايا العصبية GABAergic من مصادر خلايا متنوعة8،9،10،11،12،13 ، ولكن هناك حاجة إلى مزيد من المعرفة حول كيفية نضج hdINs ودمجها وعملها بمرور الوقت في الدماغ المرضي النامي. حددت العديد من الدراسات تغيرات في الجينات النشطة أثناء الزخرفة القشرية ، وإنشاء اتصال عصبي14 ، وضبط توازن E / I الفسيولوجي15. يسمح لنا زرع حديثي الولادة ل hdINs في نماذج الفئران مع الاضطرابات الجينية المقابلة بمتابعة التفاعل بين المضيف والكسب غير المشروع ، وهي المعرفة اللازمة لتحديد الاستراتيجيات العلاجية المحتملة.
يستخدم التعديل المناعي بشكل شائع وناجح في عمليات زرع الطعم الأجنبي لتجنب إثارة استجابة مناعية للمضيف والرفض16. ومع ذلك ، فإن إعطاء الأدوية المثبطة للمناعة ، مثل السيكلوسبورين A ، يسبب السمية الكلوية بعد الإدارة المزمنة ، ويتطلب عمالة كثيفة بسبب الحاجة إلى الحقن اليومية داخل الصفاق لتحقيق تركيزات جهازية مستقرة ، مما يسبب الإجهاد الحيواني17 ، وله تأثيرات خارج الهدف يمكن أن تتفاعل مع علم الأمراض18. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن تعريض الجهاز المناعي للخطر يغير الأنماط الظاهرية السلوكية19 ، مع تغيرات في المناطق التشريحية العصبية المقابلة20. ثبت أن الزرع في الأسبوع الأول من الحياة يسمح بالتكيف مع الخلايا المزروعة 21,22 ، بينما أبلغ آخرون عن البقاء الأولي متبوعا برفض الطعوم خلال الشهر الأول بعد الولادة 23,24.
يصف هذا البروتوكول الإجراءات من توليد hdIN إلى زرع الخلايا في الفئران الوليدية مما يؤدي إلى بقاء الكسب غير المشروع على المدى الطويل والسماح بالتحقيق في خصوصية الخلايا العصبية والتكامل المشبكي والوظيفة والإمكانات العلاجية للخلايا العصبية البشرية المزروعة أثناء التطور الفسيولوجي والمرضي.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل مجلس أخلاقيات أبحاث الحيوانات في مالمو / لوند ، رقم التصريح الأخلاقي 12548-19 ، وتم إجراؤها بالاتفاق مع لوائح الوكالة السويدية لرعاية الحيوان وتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63 / EU للتجارب على الحيوانات. تم استخدام C57BL6 / J والفئران الشبيهة بالبروتين 2 (Cntnap2) (KO) المرتبطة ب Contactin ، ذكورا وإناثا ، في يوم ما بعد الولادة (P) 2 للدراسة الحالية. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs). تم الحصول على الحيوانات والخلايا الجذعية من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).
1. جيل من السلائف hdIN
ملاحظة: تتم جميع الخطوات الواردة في هذا القسم في غطاء زراعة الخلية. تم الحفاظ على hESCs كخلايا خالية من التغذية على الألواح المطلية باستخدام وسط زراعة الخلايا الجذعية وتمريرها كمستعمرات.
- إجراء البرمجة الأمامية ل hESCs إلى سلائف hdIN (الشكل 1).
ملاحظة: يستند نهج البرمجة الأمامية إلى الإجراء الموصوف في Gonzalez-Ramos et al.8 و Yang et al.9.- تحويل hESCs مع ناقلات الفيروسات العدسية التي تحتوي على نظام Tet-On في وسط زراعة الخلايا الجذعية الطازجة التي تحتوي على 10 ميكرومتر من مثبطات الصخور (RI) (انظر جدول المواد). يحفظ عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
- قم بتغيير الوسط إلى وسط زراعة الخلايا الجذعية الطازجة بعد 16 ساعة من النقل وحافظ على الخلايا المحولة بنفس طريقة الخلايا الجذعية غير المحولة.
- عند التلاشي ، افصل hESCs كخلايا مفردة باستخدام محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) وقم بطلائها في ألواح مغلفة من 6 آبار بكثافة 3 × 105 خلايا / بئر في وسط زراعة الخلايا الجذعية الذي يحتوي على 10 ميكرومتر من RI يوميا في المختبر (DIV) −1.
- عند 1 DIV ، استبدل وسط الاستزراع بوسط N2 يحتوي على 2 جم / لتر من الدوكسيسيكلين (DOX ، انظر جدول المواد).
ملاحظة: يستخدم DOX للحث على التعبير الجيني المحورة ل Ascl1 و Dlx29 ، من 1 DIV إلى 7 DIV ، ثم يستمر في الجسم الحي عن طريق إضافته إلى مياه الشرب25. - في 2 DIV ، تبدأ فترة اختيار مقاومة المضادات الحيوية التي ستستمر حتى 5 DIV. أضف بوروميسين (بورو) وهيجروميسين (هيجرو) إلى الوسط الطازج (انظر جدول المواد). قم بتغيير الوسيط في 2 DIV و 4 DIV و 5 DIV.
ملاحظة: تحسين تركيزات puro و hygro قبل بروتوكول التمايز باستخدام hESCs المحول وغير المحول لضمان بقاء الخلايا التي تحمل أشرطة مقاومة المضادات الحيوية فقط. في هذا البروتوكول ، تم استخدام 0.5 ميكروغرام / مل من البورو و 750 ميكروغرام / مل من الرطوبة. - في 5 DIV ، تنتهي فترة اختيار المضادات الحيوية. التغيير إلى وسط N2 مكمل ب 2 جم / لتر من DOX و 4 ميكرومتر من السيتوزين β-D-arabinofuranoside (Ara-C ، انظر جدول المواد).
الشكل 1: توليد سلائف hdIN من hESCs عن طريق الإفراط في التعبير عن Ascl1 و Dlx2. (أ) مخططات بروتوكول التمايز المستخدم لتوليد سلائف hdIN. (ب - ه) الكيمياء المناعية لسلائف hdIN عند 7 DIV ل (B) العلامة العصبية MAP2 ، (C) العلامة التكاثرية Ki67 ، (D) التلوين النووي العام ، و (E) دمج العلامات السابقة. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
2. إعداد تعليق خلية واحدة للزراعة
ملاحظة: تتم جميع الخطوات الواردة في هذا القسم في غطاء زراعة الخلية. في 7 DIV ، يتم فصل سلائف hdIN واستخدامها للزرع.
- قم بإجراء فصل الخلايا باتباع الخطوات أدناه.
- قم بإزالة الوسط وشطف الخلايا بعناية باستخدام DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.
- أضف 400 ميكرولتر من محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) إلى كل بئر من لوحة 6 آبار.
ملاحظة: تأكد من تغطية السطح بالكامل بالمحلول. - احتضن لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة حتى تبدأ حدود الخلايا في الظهور لامعة ، مما يشير إلى التدهور الأنزيمي لبروتينات سطح الخلية والانفصال عن سطح البئر.
ملاحظة: لزيادة بقاء الخلية ، لا تنتظر طويلا عندما تكون جميع الخلايا منفصلة تماما وتطفو. - بعد ذلك ، أضف 600 ميكرولتر من وسط N2 الطازج إلى كل بئر من لوحة 6 آبار لإيقاف الإنزيم ، وميكانيكيا مع الماصة ، ساعد على فصل الخلايا للحصول على تعليق أحادي الخلية.
- انقل معلق الخلية إلى أنبوب بلاستيكي (15 مل) وجهاز طرد مركزي بسرعة 180 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إجراء إعادة تعليق الخلايا.
- تخلص من المادة الطافية باستخدام نظام تفريغ (بعناية ، دون إزعاج الحبيبات) وأعد تعليق الحبيبات في وسط الزرع الذي يحتوي على 10 ميكرومتر من RI ، و 1 ميكروغرام / مل من DNase ، و 2 ميكروغرام / ميكرولتر من DOX.
- عد إجمالي الخلايا في التعليق باستخدام غرفة العد وعداد الخلايا اليدوي واضبط الحجم على تركيز نهائي قدره 100000 خلية / ميكرولتر.
- حافظ على تعليق الخلية في أنبوب مغلق على الجليد حتى الزرع لمدة أقصاها 4 ساعات.
ملاحظة: يجب إجراء عملية الزرع في نفس يوم تحضير معلق الخلية (7 DIV).
3. زرع الخلايا داخل الحصين
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الواردة في هذا القسم خارج غطاء زراعة الخلايا في منشأة الحيوانات. تم إجراء عملية زرع الخلايا المبكرة بعد الولادة في الدماغ على P2 ، مع الأخذ في الاعتبار P0 يوم الولادة.
- استعد لتجربة الزرع باتباع الخطوات أدناه.
- الأوتوكلاف جميع المواد الجراحية أو ، إذا لم يكن ذلك ممكنا ، تعقيم مع طريقة أخرى معتمدة.
- قم بتركيب حقنة الحقن في الحامل بدون أي شعيرات زجاجية. شطف الإبرة بالماء.
ملاحظة: يجب أن تكون الإبرة 33 جم. - منحنى 90 درجة طرف إبرة الأنسولين 30 غرام.
- قم بإنشاء مرحلة تشبه Play-Doh محلية الصنع لوضع الجرو مع الرأس مسطحا (الشكل 2 أ).
- أحضر قفص الفئران مع الأم والجراء قبل تحضير أي شيء للجراحة للسماح لهم بالتأقلم مع البيئة الجديدة.
- تحضير صينية مع الثلج الرطب وقفص فارغ مع بعض الورق للأيزوفلوران.
- تخدير جرو الفأر.
- انقع قطعة من الورق مع الأيزوفلوران (انظر جدول المواد) وضعها داخل القفص الفارغ. خذ بعناية جروا واحدا وضعه في القفص مع الورق المنقوع في الأيزوفلوران.
ملاحظة: لا تترك أبدا أقل من ثلاثة جراء مع الأم. لا تتجاوز 20-30 ثانية من التخدير إيزوفلوران ، أو قد يموت الجرو. - تحقق من تأثير التخدير عن طريق التوقف عن الحركة.
- مباشرة بعد التخدير ، ضع الجرو على منديل مبلل على سطح الثلج الرطب. احتفظ بالحيوان على الجليد لمدة 3 دقائق حتى تصبح الأطراف العلوية بيضاء (الشكل 2 ب ، السهم الأزرق). هذا عادة ما يستغرق 2-3 دقائق.
- استخدم هذا الوقت لتحميل المحقنة بتعليق الخلية. أعد تعليق الخلايا بعناية باستخدام ماصة من قبل.
- ضع الجرو على الإطار المجسم. استخدم قضبان الأذن في الاتجاه المعاكس (الشكل 2 أ ، الأسهم الأرجواني).
ملاحظة: الجانب الخلفي من قضبان الأذن أقل مدببا ، وبما أن الجراء P2 ليس لديهم آذان ، استخدم الجانب المسطح لتجنب إيذاء الحيوان. - من الجانب ، تحقق مما إذا كان الرأس مستقيما. يجب أن يكون الرأس مسطحا ؛ استخدم المرحلة الشبيهة ب Play-Doh للتكيف مع ذلك.
ملاحظة: الجراء في هذا العمر لم يفتحوا أعينهم بعد ، لذلك لا يلزم القيام بأي خطوة إضافية في هذا الصدد. الجراء ليس لديهم فرو في هذا العمر ، لذلك لا يلزم حلاقة المنطقة. لا يتم إعطاء أي علاج محدد للألم لأنه ليس شقا مفتوحا للجلد ، ولا يتم إجراء خياطة. - حافظ على الجرو مغطى بالثلج (فوق المناديل الورقية) طوال مدة الجراحة.
ملاحظة: لا تضع الثلج على اتصال مباشر بجلد الجرو.
- انقع قطعة من الورق مع الأيزوفلوران (انظر جدول المواد) وضعها داخل القفص الفارغ. خذ بعناية جروا واحدا وضعه في القفص مع الورق المنقوع في الأيزوفلوران.
- أداء الحقن.
- نظف سطح الجلد باستخدام منديل رخو منقوع في الإيثانول.
- حدد لامدا واضبط الإحداثيات على الصفر على وحدة التحكم في العرض الرقمي للأداة المجسمة (الشكل 2C ، الخط الأصفر المتقطع). يمكن رؤية الغرز السهمية واللمفية بسهولة من قبل العين ، لأنها الأوعية الدموية ، كخطوط حمراء.
ملاحظة: إذا كنت تواجه صعوبات في تصور لامدا ، ضع قطعة صغيرة من الثلج على الجلد وانتظر بضع دقائق حتى يبرد. بعد ذلك ، قم بإزالة قطعة الثلج ، وسيسمح لك التبييض الدقيق للبشرة بالتصور. - انقل إبرة الحقن إلى الإحداثيات المطلوبة. في البروتوكول الموصوف ، كانت المنطقة المستهدفة هي الحصين ، وكانت الإحداثيات على النحو التالي: الأمامي الخلفي (AP) +0.85 والمتوسط الجانبي (ML) +1.35.
- استخدم إبرة الأنسولين المنحنية بزاوية 90 درجة لاختراق الجمجمة وإحداث ثقب صغير.
- قم بإسقاط إبرة الحقن حتى تعبر الجمجمة ، وقم بتصفير الإحداثيات الظهرية البطنية (DV). اخفض الإبرة حتى ينسق DV المطلوب. في البروتوكول الموصوف ، كانت الإحداثيات DV −1.1.
- حقن وفقا للفترات الزمنية المحددة مسبقا.
ملاحظة: في البروتوكول الموصوف ، كانت التوقيتات الدقيقة كما يلي: (i) بعد النزول إلى إحداثيات DV ، انتظر 3 دقائق ، (ii) حقن 1 ميكرولتر من الحجم لمدة 5 دقائق ، و (iii) بعد حقن كل الحجم ، انتظر 3 دقائق. - اسحب الإبرة ببطء.
- إنهاء الإجراء.
ملاحظة: لا يمكن أن تستمر الجراحة أكثر من 15 دقيقة لضمان بقاء الجرو وتجنب أي ضرر ناتج عن التخدير بسبب انخفاض حرارة الجسم.- قم بتسخين الجرو باليدين حتى يبدأ في التحرك قبل إعادته إلى الأم.
- إعطاء DOX بتركيز 1 ملغ / مل في محلول السكروز 0.5 ٪ كمياه الشرب لمدة يومين على الأقل قبل و 3 أسابيع بعد الزرع (PT) لمواصلة تمايز الخلايا في الجسم الحي.
الشكل 2: الزرع التجسيمي في صغار الفئران حديثي الولادة في P2. (أ) مرحلة تشبه Play-Doh لتثبيت جسم الجرو في موضعه وقضبان الأذن المقلوبة (الأسهم الأرجواني). (ب) مخلب أمامي أبيض (سهم أزرق) يدل على انخفاض تدفق الدم في تلك المنطقة بحيث يعاني الجرو من التخدير عن طريق انخفاض حرارة الجسم. (ج) نظرة عامة على الإعداد مع الجرو المغطى بالفعل بالثلج فوق المناديل الورقية الرخوة. (ج#) تكبير مغلق لرأس الجرو ، مع إدخال إبرة الحقن بالفعل في الدماغ (خط أصفر متقطع يشير إلى خيوط لامدا ولامبويد). هذا الرقم مقتبس من غونزاليس راموس وآخرون. 27. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
باتباع البروتوكول المقدم هنا والموضح في الشكل 1A ، لم تكن سلائف hdIN تكاثرية بعد عند 7 DIV كما هو محدد بواسطة (i) التفاعل المناعي السلبي لعلامة دورة الخلية Ki67 و (ii) التعبير عن العلامات العصبية مثل البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 (MAP2) (الشكل 1B-E). تم إجراء هذا التوصيف على الخلايا المتبقية المعاد طلاؤها لمدة 24 ساعة بعد خضوعها لجميع خطوات الإجراء. بالإضافة إلى ذلك ، أشار تحليل التعبير الجيني المنشور سابقا إلى أن الانتقال السريع من الحالة متعددة القدرات إلى النمط الظاهري العصبي يحدث حوالي 4 DIV و 7 DIV8. بشكل عام ، أكدت هذه النتائج وجود خلايا ما بعد الانقسام وغياب خطر تكوين ورم ماسخ.
بعد ذلك ، تم اختبار بقاء سلائف hdIN بعد الزرع المبكر بعد الولادة في الحصين للفئران من النوع البري (WT) بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية ضد علامة السيتوبلازم البشرية STEM121. تم زرع سلائف hdIN في الحصين الظهري الأيمن للفئران المناعية الساذجة في P2 ، والتي تم التضحية بها بعد ذلك في P14 و PT لمدة شهرين. تم العثور على خلايا مطعمة عبر الحصين الظهري بأكمله ، وكذلك منتشرة من خلال الجسم الثفني والحصين المقابل ، في كلتا النقطتين الزمنيتين. علاوة على ذلك ، في كلتا النقطتين الزمنيتين ، عبرت hdINs المطعمة عن Ascl1 ، أحد عوامل النسخ التعريفي (الشكل التكميلي 1) ، ولم تكن تكاثرية ، كما يتضح من عدم وجود تعبير Ki67 (الشكل التكميلي 2).
الأهم من ذلك ، لم يتم العثور على أي رد فعل مناعي أو التهاب موضعي ضد الخلايا المزروعة إما في P14 أو 2 أشهر PT ، كما تم تقييمه من خلال عدم وجود الخلايا الدبقية الصغيرة التفاعلية التي تم تحديدها باستخدام Iba1 و CD68 و galectin-3 (Gal3) (الشكل 3) ، ومدى التسمم النجمي الذي يحدده البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) والسيتوكينات الالتهابية مثل interleukine-1 (IL-1) ، وغياب الخلايا الليمفاوية التائية السامة (CD8) (الشكل 4).
الشكل 3: HDINs في P14 و 2 أشهر PT في الحصين من الفئران WT حديثي الولادة دون إثارة الرفض المناعي من الأنسجة المضيفة. التألق المناعي لعلامات Iba1 و CD68 و Gal3 في أنسجة المخ من (A-D) قرب منطقة قلب نقص تروية في نموذج فأر السكتة الدماغية التخثير الكهربائي (التحكم الإيجابي ، Ctrl +) ، (E-H) التحكم السلبي (Ctrl-) في شهرين و (M-P) P14 ، و (I-L) الحيوانات التي خضعت لزرع الخلايا في شهرين و (Q-T ) ص 14. تشير الأسهم البيضاء إلى بعض الأمثلة على الأوعية الدموية المرئية في جميع القنوات بسبب التألق الذاتي. الاختصارات: Ctx = القشرة ؛ الورك = الحصين. DG = التلفيف المسنن ؛ CA1 = كورنو أمونيس 1. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: hdINs في 2 أشهر PT في الحصين من الفئران WT حديثي الولادة دون إثارة الرفض المناعي من الأنسجة المضيفة. التألق المناعي لعلامات IL1 و GFAP و CD8 في أنسجة المخ من (A-D) قرب منطقة أساسية إقفارية في نموذج فأر السكتة الدماغية بالتخثير الكهربائي (التحكم الإيجابي ، Ctrl +) ، (E-H) التحكم السلبي (Ctrl-) في شهرين ، و (I-L) الحيوانات التي خضعت لزرع الخلايا في شهرين. الاختصارات: Ctx = القشرة ؛ الورك = الحصين. DG = التلفيف المسنن. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
وبالمثل ، تم زرع سلائف hdIN أيضا في الحصين لفئران Cntnap2 KO ، وهو نموذج لاضطراب طيف التوحد ومتلازمة الصرع البؤري خلل التنسج القشري. في الفئران Cntnap2 KO ، في الواقع ، نجت hdINs لمدة تصل إلى 9 أشهر PT وتم توطينها في موقع الحقن ، على الرغم من أنها كانت منتشرة أيضا عبر الحصين المماثل وحتى الحصين المقابل كما لوحظ في الفئران WT (الشكل 5). علاوة على ذلك ، كانت معظم HDINs المطعمة متفاعلة مناعية لعلامات الخلايا العصبية ، كما هو متوقع من النتائج السابقة في المختبر 8,26 وفي القوارض البالغة في الجسم الحي25.
الشكل 5: HDINs المطعمة في الحصين لفئران Cntnap2 KO في 9 أشهر بتوقيت المحيط الهادئ. (أ) الكيمياء المناعية ضد العلامة البشرية السيتوبلازمية STEM121 في الفئران المزروعة بالخلايا (يسار) والفئران الوهمية (اليمنى). (A1 و A2) صور مكبرة للخلايا الإيجابية STEM121. (ب) التألق المناعي ل STEM121 (أرجواني) وعلامات الخلايا العصبية البينية بارفالبومين (PV) والسوماتوستاتين (SST). تشير الأسهم البيضاء إلى خلايا موجبة مزدوجة ل STEM121 وعلامة الخلايا العصبية المعنية. (ج) عرض متعامد لتفاعل مناعي hdIN مطعمة ل STEM121 و PV. شريط المقياس: 200 ميكرومتر (A و B) ، 100 ميكرومتر (a1 و a2) ، 20 ميكرومتر (تكبير مربع صغير في a1 و a2 ، و C). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي 1: HDINs المطعمة في 2 أشهر PT في الحصين من الفئران WT حديثي الولادة التعبير Ascl1. التألق المناعي ضد Ascl1 والعلامة البشرية السيتوبلازمية STEM121 في (A) CA3 و (B) DG في الفئران WT المزروعة بالخلايا. (أ) صورة مكبرة لخلية إيجابية STEM121. تشير الأسهم البيضاء إلى خلايا موجبة مزدوجة ل STEM121 و Ascl1. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: HDINs المطعمة بعد الانقسام في شهرين PT في الحصين من الفئران WT حديثي الولادة. التألق المناعي ضد العلامة التكاثرية Ki67 والعلامة البشرية السيتوبلازمية STEM121 في (A) الفئران الساذجة و (B) الفئران WT المزروعة بالخلايا. (ب) صورة مكبرة لخلية إيجابية STEM121. يشير السهم الأصفر إلى خلية موجبة ل Ki67 وسالبة ل STEM121. يشير السهم الأبيض إلى الخلايا الموجبة ل STEM121 والسالبة ل Ki67. تشير العلامة النجمية البيضاء إلى البطين الجانبي. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
يصف البروتوكول الحالي منهجية قوية وسريعة وبسيطة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع لتوليد سلائف hdIN في المختبر واستخدامها كعلاج خلوي تدخلي مبكر في النماذج قبل السريرية لاضطرابات النمو العصبي .
على الرغم من أن بعض الأنماط الظاهرية المميزة لاضطرابات النمو العصبي تنشأ خلال فترة المراهقة أو البلوغ ، إلا أن التغيرات الفيزيولوجية المرضية موجودة بالفعل أثناء التطور المبكر. لهذا السبب ، سيكون التدخل المبكر مبررا للغاية لتحقيق آثار مفيدة من خلال العمل في فترات نمو الدماغ الحرجة قبل ظهور الأعراض أو المظاهر السريرية. في المستقبل ، سيوفر الفحص الجيني وتطوير المؤشرات الحيوية العلاج الوقائي أو ما قبل الأعراض ، مما يمثل تغييرا في قواعد اللعبة لهؤلاء المرضى. لذلك ، تم زرع سلائف hdIN في وقت مبكر بعد الولادة في نموذج الفأر Cntnap2 KO عندما تكون التغيرات الصرعية في الشبكة العصبية مستمرة28 وفي نقطة زمنية تم فيها وصف التغيرات الخلوية في هذا النموذج الحيواني29. ومع ذلك ، من المهم النظر في المزالق المحتملة لاستقراء العمر وتوقيت عمليات معينة في الفأر مقابل الدماغ البشري.
مع التركيز على الإجراء نفسه ، يعتمد بروتوكول التمايز المقدم هنا على استخدام عوامل النسخ ، والتي تسمح ببرمجة سريعة وعالية الكفاءة للخلايا الجذعية مقارنة بالبروتوكولات الأخرى في أماكن أخرى بناء على جزيئات صغيرة10,30. يمكن أن يكون العيب المحتمل لهذا النهج هو شرط ناقلات الفيروسات العدسية ، والتي تنطوي على خطر حدوث طفرات إدخالية. خطوتان حاسمتان في البروتوكول هما إضافة المضادات الحيوية والعامل المضاد للانقسام إلى الوسط لاختيار الخلايا التي تعبر عن عوامل النسخ والقضاء على الخلايا التكاثرية ، وتجنب خطر تكوين ورم مسخي ، على التوالي. على الرغم من اختبار سلائف hdIN فقط في هذه الدراسة ، فمن المتوقع أن يكون الإجراء ممكنا مع مصادر الخلايا الأخرى وبروتوكولات البرمجة / التمايز. ومع ذلك ، يجب التحقق من صحة الأنواع الفرعية و / أو النماذج العصبية الأخرى.
تم تحديد عمر سلائف hdIN للزرع ، 7 DIV ، بناء على (i) عدم وجود خلايا تكاثرية ، تم تقييمها بواسطة النشاط المناعي ضد Ki67 ، (ii) جنبا إلى جنب مع الملاحظة المبلغ عنها سابقا للانخفاضات في التعبير عن جينات متعددة القدرات مثل POU5F1 وظهور العلامة العصبية MAP2 وعلامة الخلايا العصبية GAD1 في تلك النقطة الزمنية8 . ومع ذلك ، فإن العمل الأصلي الذي يصف هذا البروتوكول أجرى عمليات زرع في 14 DIV بعد انسحاب DOX9. هذا يثير تساؤلات حول ما إذا كان DOX في مياه الشرب للأم يمكن أن يصل إلى الخلايا المطعمة في أدمغة الجراء المرضعة عن طريق الحليب ، أو إذا كان 7 DIV من تحريض DOX كافيا لتحديد مصير GABAergic. على الرغم من أن Yang et al. حدد 14 يوما من DOX على أنها كافية لتوليد خلايا عصبية مستقرة في المختبر9 ، اكتشف Gonzalez-Ramos et al.8 التعبير الجيني GAD1 بالفعل عند 7 DIV ، مما يشير إلى أن التنشيط النهائي ل GAD67 بواسطة Ascl1 و Dlx2 قد حدث بالفعل في هذه المرحلة الزمنية. ومن ثم ، فقد بدأ النقش عند 7 DIV وقد يكون أقل اعتمادا على علاج DOX. علاوة على ذلك ، تشير الأدلة في القوارض والبشر إلى وجود DOX في حليب الثدي 31,32 ، وتظهر النتائج المقدمة هنا أن HDINs المطعمة كانت متفاعلة مع المناعة لAscl1 في أسبوعين وشهرين PT وعلامات interneuron لاحقا في 9 أشهر PT. ضمن السكان المطعمين ، إلى جانب الخلايا العصبية الإيجابية PV و SST ، تم العثور أيضا على علامات أخرى لمجموعات فرعية من interneurons بكميات أقل ، مثل الكالريتينين (CR) وكالبيندين (CB).
يتمثل أحد الجوانب الصعبة لهذا الإجراء في تنسيق التوقيتات لكل من التمايز وعمر الجراء. عادة ، يستغرق حمل الماوس 21 يوما بعد إعداد قفص التزاوج ، وإن كان هذا يمكن أن يختلف في بعض الأحيان. لا يحدث هذا السيناريو عند إجراء عمليات زرع الخلايا في القوارض البالغة عندما يمكن تخطيط كل شيء وترتيبه بعناية. ومع ذلك ، يمكن التخفيف من ذلك بسهولة عن طريق إعداد اثنين إلى ثلاثة أقفاص تزاوج مع فاصل زمني لمدة يومين أو دفعتين إلى ثلاث دفعات تمايز مع فاصل زمني لمدة يومين من بعضها البعض.
على الرغم من أن الفئران المستخدمة في هذه الدراسة لم تكن تعاني من نقص المناعة ولا كبت المناعة ، إلا أن الخلايا المزروعة نجت لمدة تصل إلى 9 أشهر في الجسم الحي ، ولم تلاحظ علامات رد الفعل المناعي ضد الخلايا الزينوجينية أو الالتهاب الموضعي في P14 أو 2 أشهر PT. يتم تشغيل الرفض المناعي للخلايا الزينوجينية المطعمة ضد MHC / الببتيدات ، والوسطاء الخلويون الرئيسيون لرفض الكسب غير المشروع هم الخلايا الليمفاوية التائية والخلايا الدبقية الصغيرة33 ، 34. لذلك ، تم استكشاف النشاط المناعي لعلامات الخلايا التائية ، وكذلك الخلايا الدبقية الصغيرة التفاعلية. لم يتم الكشف عن أي علامات على الرفض المناعي للخلايا المطعمة في الأنسجة المضيفة إما عن طريق مستويات الخلايا الدبقية الصغيرة التفاعلية أو عن طريق وجود الخلايا الليمفاوية التائية في الفئران WT في P14 أو 2 أشهر. علاوة على ذلك ، لم يلاحظ أي التهاب موضعي بناء على المستويات المقدرة من التسمم النجمي والسيتوكينات الالتهابية. يمكن أن تعتمد هذه النتيجة جزئيا على تحمل المناعة لحديثي الولادة 35،36،37 ، والتي لاحظتها هويات الخلايا الأخرى والمواقع والنماذج الحيوانية35،38. حدد Englund et al. الاختلافات الإقليمية في نتائج الخلايا المطعمة من حيث الهجرة والنضج ، بما في ذلك مراقبة الخلايا المطعمة في المادة البيضاء المجاورة35.
أخيرا ، لوحظ تشتت أكبر للخلايا المطعمة داخل الحصين مقارنة بالدراسات الأخرى المزروعة في القوارض البالغة ، حيث ظلت hdINs كنواة مطعمة25. اختلف هذا التشتت أيضا عن النتائج التي لاحظها Yang et al.9 سابقا ، والتي يمكن تفسيرها في هذه الحالة بعمر الخلايا في وقت الزرع.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا المشروع من قبل مجلس البحوث السويدي (رقم المنحة: 2016-02605 ، MA) ، ومؤسسة الدماغ السويدية F02021-0369 (MA) ، ومؤسسة Crafoord (MA) ، وبرنامج الاتحاد الأوروبي Horizon 2020 (H2020-MSCA-ITN-2016) في إطار مشروع شبكة ماري سكودوفسكا كوري للتدريب المبتكر Training4CRM رقم 722779 (M.K.). نحن ممتنون للغاية للمساعدة من أندريس ميغيز ، من مختبر جوزيب ماريا كانالز (مختبر الخلايا الجذعية والطب التجديدي ، جامعة برشلونة) ، لتدريس زرع الخلايا المجسمة في الفئران حديثي الولادة P2 ، وماكنزي هوارد ، قائد المجموعة في جامعة تكساس في أوستن ، للحصول على المشورة والإحداثيات الأولية لزرع الخلايا في الحصين للفئران حديثي الولادة P2. نشكر سوزان جيريس على المساعدة في رعاية الحيوانات ولينغ تساو للمساعدة في معالجة الأنسجة ، وكذلك الطلاب الذين ساهموا بطريقة أو بأخرى في الدراسة وتحديدا ديانا حتاميان. أخيرا ، تم إنشاء بعض الرسومات المستخدمة لتوضيح هذه الورقة باستخدام BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G needle | B Braun | 4656300 | |
| 33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
| Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
| Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
| Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
| Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
| Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
| Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
| Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
| Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
| Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
| Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
| Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
| Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
| Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
| Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
| B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
| Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
| Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
| C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
| Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
| Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
| Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
| Cy3 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
| DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
| Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
| DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
| DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
| Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
| FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
| H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
| HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium - Transplantation medium |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
| Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
| Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
| Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
| Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
| Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
| Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
| Microscope Software | Olympus | CellSens | |
| Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
| Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement - Stem cell culture medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Pertex | HistoLab | 811 | |
| Pipet Filler | |||
| Play-Doh | |||
| Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
| Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
| Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
| Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
| Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
| Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
| Tweezer | VWR | ||
| Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |
References
- Kostović, I., Jovanov-Milošević, N. The development of cerebral connections during the first 20-45 weeks' gestation. Seminars in Fetal and Neonatal. 11 (6), 415-422 (2006).
- Innocenti, G. M., Price, D. J. Exuberance in the development of cortical networks. Nature Reviews Neuroscience. 6 (12), 955-965 (2005).
- Tang, X., Jaenisch, R., Sur, M. The role of GABAergic signalling in neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neuroscience. 22 (5), 290-307 (2021).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: Comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Radonjić, N. V., et al. Diversity of cortical interneurons in primates: The role of the dorsal proliferative niche. Cell Reports. 9 (6), 2139-2151 (2014).
- Turner, D. A., Shetty, A. K. Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy. Neurosurgery. 52 (3), 632-644 (2003).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Yang, N., et al. Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming. Nature Methods. 14 (6), 621-628 (2017).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Yuan, F., et al. Induction of human somatostatin and parvalbumin neurons by expressing a single transcription factor LIM homeobox 6. eLife. 7, 37382 (2018).
- Fandel, T. M., et al. Transplanted human stem cell-derived interneuron precursors mitigate mouse bladder dysfunction and central neuropathic pain after spinal cord injury. Cell Stem Cell. 19 (4), 544-557 (2016).
- Noakes, Z., et al. Human pluripotent stem cell-derived striatal interneurons: Differentiation and maturation in vitro and in the rat brain. Stem Cell Reports. 12 (2), 191-200 (2019).
- Parikshak, N. N., Gandal, M. J., Geschwind, D. H. Systems biology and gene networks in neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. Nature Reviews Genetics. 16 (8), 441-458 (2015).
- Marín, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Sloan, D. J., Wood, M. J., Charlton, H. M. The immune response to intracerebral neural grafts. Trends in Neurosciences. 14 (8), 341-346 (1991).
- Diehl, R., et al. Immunosuppression for in vivo research: State-of-the-art protocols and experimental approaches. Cellular & Molecular Immunology. 14 (2), 146-179 (2017).
- Osman, M. M., et al. Cyclosporine-A as a neuroprotective agent against stroke: Its translation from laboratory research to clinical application. Neuropeptides. 45 (6), 359-368 (2011).
- Quinnies, K. M., Cox, K. H., Rissman, E. F. Immune deficiency influences juvenile social behavior and maternal behavior. Behavioral Neuroscience. 129 (3), 331-338 (2015).
- Fernandes, D. J., et al. Mouse models of immune dysfunction: their neuroanatomical differences reflect their anxiety-behavioural phenotype. Molecular Psychiatry. 27 (7), 3047-3055 (2022).
- Lund, R. D., Rao, K., Hankin, M. H., Kunz, H. W., Gill, T. J. Transplantation of retina and visual cortex to rat brains of different ages. Maturation, connection patterns, and immunological consequences. Annals of the New York Academy of Sciences. 495, 227-241 (1987).
- Olsson, M., Bentlage, C., Wictorin, K., Campbell, K., Björklund, A. Extensive migration and target innervation by striatal precursors after grafting into the neonatal striatum. Neuroscience. 79 (1), 57-78 (1997).
- Mattis, V. B., et al. Neonatal immune-tolerance in mice does not prevent xenograft rejection. Experimental Neurology. 254, 90-98 (2014).
- Nato, G., et al. Immune-tolerance to human iPS-derived neural progenitors xenografted into the immature cerebellum is overridden by species-specific differences in differentiation timing. Scientific Reports. 11, 651 (2021).
- Allison, T., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell-derived interneurons via single-cell analysis. Stem Cell Reports. 16 (10), 2548-2564 (2021).
- Waloschková, E., et al. Human stem cell-derived GABAergic interneurons establish efferent synapses onto host neurons in rat epileptic hippocampus and inhibit spontaneous recurrent seizures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13243 (2021).
- Gonzalez Ramos, A. Enhancing neuronal inhibition by cell and gene therapy as a novel treatment for epilepsy. , Lund University, Faculty of Medicine. PhD thesis (2022).
- Paterno, R., et al. Hippocampal gamma and sharp-wave ripple oscillations are altered in a Cntnap2 mouse model of autism spectrum disorder. Cell Reports. 37 (6), 109970 (2021).
- Penagarikano, O., et al. Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell. 147 (1), 235-246 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Angeletti, B., et al. An in vivo doxycycline-controlled expression system for functional studies of the retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 755-760 (2003).
- Doxycycline. Drugs and Lactation Database (LactMed). , National Library of Medicine. Bethesda, MD. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK500561 (2021).
- Barker, R. A., Widner, H. Immune problems in central nervous system cell therapy. NeuroRX. 1 (4), 472-481 (2004).
- Hoornaert, C. J., et al. Concise review: Innate and adaptive immune recognition of allogeneic and xenogeneic cell transplants in the central nervous system. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1434-1441 (2017).
- Englund, U., Fricker-Gates, R. A., Lundberg, C., Bjorklund, A., Wictorin, K. Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: Extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections. Experimental Neurology. 173 (1), 1-21 (2002).
- Fainstein, N., Ben-Hur, T. Brain region-dependent rejection of neural precursor cell transplants. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 136 (2018).
- Denham, M., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, 11 (2012).
- Miguez, A., et al. In vivo progressive degeneration of Huntington's disease patient-derived neurons reveals human-specific pathological phenotypes. bioRxiv. , (2022).
