Presentamos un protocolo detallado para el cultivo de embriones de ratón y la obtención de imágenes que permite obtener imágenes 3D + tiempo de células progenitoras cardíacas. Este kit de herramientas de video aborda las habilidades clave requeridas para obtener imágenes en vivo exitosas que de otro modo serían difíciles de adquirir de publicaciones de solo texto.
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Artículo de método
Imágenes en vivo de progenitores cardíacos tempranos en el embrión de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
Los primeros pasos del desarrollo del corazón implican cambios drásticos en el comportamiento y la diferenciación celular. Mientras que el análisis de embriones fijos permite estudiar en detalle etapas específicas del desarrollo en una instantánea fija, las imágenes en vivo capturan eventos morfogenéticos dinámicos, como la migración celular, los cambios de forma y la diferenciación, al obtener imágenes del embrión a medida que se desarrolla. Esto complementa el análisis fijo y amplía la comprensión de cómo se desarrollan los órganos durante la embriogénesis. A pesar de sus ventajas, las imágenes en vivo rara vez se utilizan en modelos de ratón debido a sus desafíos técnicos. Los embriones tempranos de ratón son sensibles cuando se cultivan ex vivo y requieren un manejo eficiente. Para facilitar un uso más amplio de imágenes en vivo en la investigación del desarrollo de ratones, este documento presenta un protocolo detallado para la microscopía viva de dos fotones que permite la adquisición a largo plazo en embriones de ratón. Además del protocolo, se proporcionan consejos sobre el manejo de embriones y la optimización del cultivo. Esto ayudará a comprender los eventos clave en la organogénesis temprana del ratón, mejorando la comprensión de la biología del progenitor cardiovascular.
Introducción
El corazón se forma temprano durante la embriogénesis para comenzar a bombear nutrientes a todo el embrión, mientras continúa desarrollándose1. En embriones de ratón, un día y medio después del inicio de la gastrulación, un órgano cardíaco rudimentario se ensambla en el polo anterior 2,3. En la etapa de Raya Temprana (ES), los progenitores cardíacos en el epiblasto ingresan a través de la raya primitiva a la capa mesodérmica naciente 4,5,6 y comienzan a migrar al polo anterior, donde se diferencian para formar el tubo....
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal del CNIC, por la Comunidad de Madrid (Referencia PROEX 220/15) y conformados con la Directiva 2010/63UE de la UE y la Recomendación 2007/526/CE relativa a la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos, aplicados en la legislación española bajo el Real Decreto 1201/2005.
Este protocolo incluye el uso de dos machos de la línea de ratón transgénico fluorescente que reportan actividad NOTCH Tg(CBF:H2BVenus,+)18. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalle....
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Resultados
Utilizamos el protocolo para visualizar la activación de la señalización NOTCH en progenitores cardíacos tempranos a punto de diferenciarse a las células endoteliales durante la morfogénesis primitiva del tubo cardíaco. Para eso, cruzamos ratones C57BL / 6-N de tipo salvaje con ratones Tg (CBF: H2BVenus, +)18 para obtener embriones que informan actividad NOTCH a través de la proteína fluorescente amarilla Venus. En E7.5, la fluorescencia de Venus está presente en todo el ectodermo neural, con algu.......
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Discusión
Los primeros progenitores del corazón se organizan en un tubo cardíaco primitivo que comienza a latir mientras aún se está formando. Comprender cómo se lleva a cabo este proceso es clave para identificar el amplio espectro de defectos cardíacos congénitos a eventos morfogenéticos específicos. Para eso, las imágenes en vivo ofrecen la oportunidad de estudiar el desarrollo embrionario normal y defectuoso con una mayor resolución temporal. Esto es especialmente útil para estudiar las células progenitoras cardíacas tempranas.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen al Dr. Kenzo Ivanovitch por su trabajo previo sobre este método y al grupo del Dr. Shigenori Nonaka (Institutos Nacionales de Ciencias Naturales, Japón) por proporcionar la experiencia inicial en el montaje de embriones. Este estudio ha contado con el apoyo de la subvención PGC2018-096486-B-I00 del Ministerio de Ciencia e Innovación y la subvención H2020-MSCA-ITN-2016-722427 del programa Horizonte 2020 de la UE a MT y la subvención 1380918 del Programa Operativo FEDER Andalucía 2014-2020 a JND. MS ha contado con el apoyo de una beca de doctorado de la Fundación La Caixa (LCF/BQ/DE18/11670014) y una beca itinerante de la Compañía de Biólogos (DEVT....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| #55 Pinzas | Dumont | 11295-51 | |
| Plato de 35 mm con fondo de cubreobjetos de vidrio de 14 mm Diámetro | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Mesa de tornillo de banco de 35 mm | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| tubos de 50 mL | BD Falcon | 352070 | |
| Agua | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | con L-Glutamina, sin Glucosa, sin Na Pyruvato |
| Suero Fetal Bovino | Invitrogen | 10438-026 | |
| Ratones transgénicos reporteros fluorescentes (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrito DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM para la adquisición de imágenes de células vivas |
| Grasa de silicona de alto vacío | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Soporte para cables | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Microscopio vertical | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee láser pulsado rojo lejano sintonizado a 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectores equipados con los conjuntos de filtros cian-amarillo (BP450-500/BP520-560), verde-rojo (BP500-520/BP570-610) y amarillo-rojo (BP520-560/BP645-710) | Zeiss | ||
| Obj: 20x inmersión en agua 1.0 NA, larga distancia de trabajo | Zeiss | ||
| Pipetas P1000 y P200 Aceite de parafina | |||
| Nidacon | VNI0049 | ||
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15070-063 | (la concentración final debe ser 50 μ g/mL de penicilina y 50 μ g/mL de estreptomicina) |
| Placas de Petri 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Puntas | |||
| Metacrilato de polimetilo | Reutilizado de viejos equipos de laboratorio | ||
| Rata Suero de cultivo de embrión, ratas macho SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Juego de finos de 160 mm | RS PRO | 541-6933 | |
| Capilares de vidrio estándar de 1,0 mm | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Estéril 0,22 μ m filtro de jeringa | Corning | 431218 | |
| Jeringa estéril de 5 ml | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Agujas de | |||
| Homogeneizador ultrasónico (sonicador) | Bandelin | BASO_17021 |
Referencias
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113(2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medi....
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Reimpresiones y permisos
