Presentamos un protocolo detallado para el cultivo de embriones de ratón y la obtención de imágenes que permite obtener imágenes 3D + tiempo de células progenitoras cardíacas. Este kit de herramientas de video aborda las habilidades clave requeridas para obtener imágenes en vivo exitosas que de otro modo serían difíciles de adquirir de publicaciones de solo texto.
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Artículo de método
Imágenes en vivo de progenitores cardíacos tempranos en el embrión de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
Los primeros pasos del desarrollo del corazón implican cambios drásticos en el comportamiento y la diferenciación celular. Mientras que el análisis de embriones fijos permite estudiar en detalle etapas específicas del desarrollo en una instantánea fija, las imágenes en vivo capturan eventos morfogenéticos dinámicos, como la migración celular, los cambios de forma y la diferenciación, al obtener imágenes del embrión a medida que se desarrolla. Esto complementa el análisis fijo y amplía la comprensión de cómo se desarrollan los órganos durante la embriogénesis. A pesar de sus ventajas, las imágenes en vivo rara vez se utilizan en modelos de ratón debido a sus desafíos técnicos. Los embriones tempranos de ratón son sensibles cuando se cultivan ex vivo y requieren un manejo eficiente. Para facilitar un uso más amplio de imágenes en vivo en la investigación del desarrollo de ratones, este documento presenta un protocolo detallado para la microscopía viva de dos fotones que permite la adquisición a largo plazo en embriones de ratón. Además del protocolo, se proporcionan consejos sobre el manejo de embriones y la optimización del cultivo. Esto ayudará a comprender los eventos clave en la organogénesis temprana del ratón, mejorando la comprensión de la biología del progenitor cardiovascular.
Introducción
El corazón se forma temprano durante la embriogénesis para comenzar a bombear nutrientes a todo el embrión, mientras continúa desarrollándose1. En embriones de ratón, un día y medio después del inicio de la gastrulación, un órgano cardíaco rudimentario se ensambla en el polo anterior 2,3. En la etapa de Raya Temprana (ES), los progenitores cardíacos en el epiblasto ingresan a través de la raya primitiva a la capa mesodérmica naciente 4,5,6 y comienzan a migrar al polo anterior, donde se diferencian para formar el tubo cardíaco primitivo. A lo largo de este proceso, los progenitores cardíacos tempranos experimentan reordenamientos celulares, transformaciones de forma y diferenciación, además de la migración7 (Figura 1).
Los primeros progenitores cardíacos han atraído a los investigadores durante casi un siglo debido a su notable capacidad para diferenciar y construir un órgano funcional simultáneamente. En las últimas dos décadas, el análisis clonal y los modelos de knockout condicional han demostrado que el desarrollo temprano del corazón implica distintas fuentes celulares en un proceso altamente dinámico 8,9,10. Sin embargo, la estructura 3D del tubo cardíaco primitivo y la naturaleza dinámica de su morfogénesis hacen que sea difícil de estudiar (Figura 1), y estamos lejos de comprender toda su complejidad11.
Para estudiar estos procesos celulares dinámicos, los métodos de imagen en vivo ofrecen ahora un detalle sin precedentes 7,12,13,14. En el modelo de ratón, los enfoques en vivo han sido clave para interrogar temas de desarrollo que son difíciles de abordar mediante análisis estático 7,13,15. Si bien el cultivo ex vivo a largo plazo y las configuraciones robustas de microscopios avanzan rápidamente16,17, pocos investigadores tienen la experiencia para obtener imágenes exitosas de embriones vivos. Aunque las publicaciones en papel proporcionan suficientes detalles técnicos para reproducir experimentos de imágenes en vivo, algunas habilidades y trucos son difíciles de comprender sin ejemplos visuales o asistencia entre pares. Para acelerar este proceso de aprendizaje y difundir el uso de imágenes en vivo entre los laboratorios, ensamblamos un protocolo de video (Figura 2) que reúne las habilidades necesarias para realizar imágenes en vivo en embriones de ratón gastrulados.
Figura 1: Diferenciación temprana de las células progenitoras cardíacas en el embrión de ratón desde el inicio de la gastrulación hasta la etapa anterior a la formación primitiva del tubo cardíaco. Las células progenitoras cardíacas ingresan al mesodermo poco después del inicio de la gastrulación, migrando al lado opuesto del embrión. La etapa morfológica y embrionaria del día (E) se escribe en la parte superior de los diagramas. Las flechas discontinuas representan la trayectoria de migración de los progenitores primitivos del tubo cardíaco durante la gastrulación. Esta figura fue adaptada de11. Abreviaturas: ES = Early Streak; MS = Racha media; EHF = Pliegue temprano de la cabeza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo de trabajo para imágenes en vivo de progenitores cardíacos tempranos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal del CNIC, por la Comunidad de Madrid (Referencia PROEX 220/15) y conformados con la Directiva 2010/63UE de la UE y la Recomendación 2007/526/CE relativa a la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos, aplicados en la legislación española bajo el Real Decreto 1201/2005.
Este protocolo incluye el uso de dos machos de la línea de ratón transgénico fluorescente que reportan actividad NOTCH Tg(CBF:H2BVenus,+)18. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los materiales, animales y equipos utilizados en este protocolo.
1. Personalización de herramientas y soportes
- Corte trozos de alambre de tungsteno de 1 cm de largo y afilarlos a 0.02-0.05 mm de diámetro utilizando cualquiera de los métodos simples disponibles, por ejemplo, sumergiendo la punta del alambre en una solución saturada de nitrito de sodio19.
- Prepare capilares de vidrio con codo.
- Coloque el punto medio de un capilar de vidrio estándar de 1.0 mm sobre un encendedor Bunsen durante 3-6 s, tirando lentamente desde ambos extremos hasta que el capilar se vuelva delgado y flexible. En ese punto, rompe el capilar por la mitad y caliéntalo brevemente para producir una curva de 90 ° a 2 cm de la punta.
- Vio una pieza de polimetacrilato de metilo que mide aproximadamente 7 mm de largo, 4 mm de ancho y 2 mm de espesor (Figura 3D).
NOTA: Las láminas de polimetacrilato de metilo pueden obtenerse de equipos de laboratorio reciclados o pedirse nuevas. - Sujete la pieza de metacrilato con un tornillo de banco. A continuación, perfore agujeros de tamaño personalizado transversalmente a través de toda la pieza (Figura 3D).
NOTA: Normalmente, los embriones de ratón E6.5 a E7.5 requieren el uso de taladros de 0.2-0.5 mm de diámetro.- Gire el taladro lentamente mientras aplica una presión baja pero constante. Si un taladro se rompe dentro del soporte, deseche la pieza, ya que el metal no se puede sacar.
- Utilice una lima fina para suavizar los bordes del soporte y ajustar su tamaño. Además, cree una pendiente suave en los bordes del soporte para facilitar el posicionamiento del embrión (Figura 3D).
- Coloque el soporte terminado en un plato con agua destilada para enjuagarlo.
- Revise el soporte debajo del estereomicroscopio para ver si los orificios contienen polvo de perforación. Si hay polvo, use agujas de tungsteno para eliminarlo.
- Para esterilizar el soporte, colóquelo en un tubo cónico lleno de agua destilada y sonicarlo durante 20 minutos con una potencia mínima de salida de 20 W.
2. Preparación de los medios
- Para inactivar térmicamente el sistema del complemento, dejar dos alícuotas de 500 μL de suero de20 ratas comerciales o caseros a 56 °C durante 30 min.
NOTA: Para un protocolo detallado sobre cómo preparar suero para ratas, ver21. - En una campana de cultivo celular, preparar dos alícuotas del medio para cultivar los embriones en el microscopio. Para cada uno, mezcle 490 μL de DMEM para imágenes de células vivas, 500 μL de suero de rata inactivado y 10 μL de penicilina-estreptomicina para obtener una concentración final de 50 μg/ml de penicilina y 50 μg/ml de estreptomicina22.
NOTA: El volumen del medio de cultivo depende del tiempo y número de embriones a cultivar. Como regla general, el crecimiento óptimo requiere un mínimo de 200 μL por embrión por día en embriones E7.0. - Con una jeringa de 2 ml, filtrar el medio a través de un filtro de membrana de 0,22 μm de tamaño de poro en un tubo nuevo y colocarlo abierto en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 7% deCO2 durante 1 h antes del cultivo embrionario23.
- Preparar el medio de disección añadiendo a un frasco de 500 mL de DMEM suplementado con L-glutamina lo siguiente: 50 mL de suero fetal bovino, 10 mL de 25 mM de HEPES-NaOH (pH 7.2), y 10 mL de penicilina y estreptomicina (50 mg/mL).
- A continuación, sepárelo en alícuotas de 50 ml, coloque tres alícuotas en un baño a 37 °C y guarde el resto a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
3. Disección embrionaria
- Eutanasia a una ratona preñada E6.75-E7.5.
- Extraiga el útero y colóquelo en una toallita de papel seco y limpio. Luego, corte el útero, insertando la punta de tijeras finas desde el lado mesometrial y deslizando la cuchilla para exponer las deciduas y transferirlas al medio de disección. Para obtener un protocolo detallado, consulte24.
- Diseccionar los embriones, manteniendo intacto el cono ectoplacentario (Figura 3A,B). Para obtener un método de disección detallado, consulte25.
- Luego, despegue la membrana de Reichert, dejando parte de ella en la región extraembrionaria (Figura 3B).
NOTA: Los fórceps finos son esenciales para este paso. Los usuarios inexpertos pueden diseccionar embriones en platos recubiertos con gel de agarosa al 2% para evitar doblar las puntas de los fórceps contra la superficie del plato (Figura 3C). - Para mantener la disección medio caliente, reemplácela cada 10 minutos. Además, diseccionar las deciduas en grupos de 3-4 mientras se mantiene el resto en medio de disección colocado en un baño a 37 °C. Colocar inmediatamente los embriones disecados en medio de cultivo.
- Seleccione los embriones con las características de fluorescencia deseadas utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia y colóquelos en el tubo que contiene el medio de cultivo en la incubadora de cultivo celular.
- Si los embriones están en las etapas E6.5 a E7.0, cierre la tapa y deje que los embriones se recuperen durante 2 h antes de la toma de imágenes.
NOTA: Los embriones E6.5 a E7.0 son sensibles. También se pueden colocar directamente bajo el microscopio, pero el precultivo permite seleccionar los que mejor se recuperan de la disección, lo que aumenta las posibilidades de éxito.
4. Preparación del microscopio
- Encienda todos los componentes del microscopio, incluidos los láseres, la computadora y el software. Encienda los controladores de temperatura y configúrelos a 37 °C con 3 h de antelación para garantizar el equilibrio.
- Si utiliza un objetivo de detección de inmersión, límpielo con una toallita desechable sin residuos. Sumerja la punta del objetivo en agua de doble destilación con un plato de 60 mm y déjelo hasta que comience la adquisición.
- Encienda el controlador deCO2 y configúrelo en 7%.
- Coloque una gota de grasa de silicona de alto vacío en un plato de 35 mm con fondo de vidrio (14 mm de diámetro), coloque el soporte encima de la gota y presione suavemente para inmovilizarlo.
- Bajo un microscopio estereoscópico, agregue un medio de cultivo para llenar la porción del plato con fondo de vidrio. Mientras lo hace, apunte la corriente a los orificios del soporte para evitar la formación de burbujas de aire en ellos.
- Si quedan las burbujas, utilice el capilar de vidrio preparado en el paso 1.2, conectado a un tubo de silicona con una boquilla, para succionar las burbujas suavemente.
NOTA: El extremo codo del capilar facilitará el acceso a través de los orificios.
5. Montaje de embriones
- Transfiera 2-3 embriones que se dejaron recuperar en la incubadora al plato con el soporte. Deje el resto en la incubadora como respaldo.
- Coloque los embriones en los orificios usando un par de pinzas y una aguja de tungsteno cónica. Use la aguja para enganchar el embrión por el cono ectoplacentario e insértelo en un orificio que coincida con el tamaño. Para inmovilizar el embrión, gire el cono 90-120° para que la membrana del Reichter se adhiera a las paredes del orificio (Figura 3C). Para una descripción alternativa, véase26.
- Mueva con cuidado el plato que contiene los embriones y el soporte a la placa del microscopio (Figura 3F, G).
NOTA: Si no se mueve de manera constante, el embrión puede salir del soporte. - Baje el objetivo hasta que se forme un menisco líquido en la interfaz del objetivo medio.
- Localice el embrión usando luz transmitida bajo el microscopio binocular y coloque el embrión enfocado.
- Monte la cámara de incubación y séllela alrededor del objetivo con cinta adhesiva (Figura 3F).
- Usando una captura en vivo en el software de control del microscopio, ajuste los niveles de salida y ganancia del láser.
NOTA: Para la adquisición de dos fotones de proteína fluorescente verde (GFP) y reporteros Tdtomato, se utilizó una potencia láser de salida del 30% a 980 nm y una ganancia del 70% en detectores no escaneados en este protocolo (Figura 3G). - Para evitar la evaporación, cubra el medio con aceite de parafina goteándolo lentamente sobre el objetivo.
NOTA: Este es el último punto donde se pueden montar embriones adicionales en el soporte. Una vez cubierto con aceite de parafina, uno tendría que limpiar el soporte y reemplazar el medio para hacerlo. Para métodos de montaje alternativos, véase27.
6. Adquisición de imágenes
- Configurar la grabación de lapso de tiempo. Establezca un intervalo de tiempo de 5-10 minutos con un espacio z de 3-5 μm entre pilas. Deje un espacio en blanco en la parte superior de la pila z para anticipar el crecimiento del embrión, un mínimo de 50 μm, agregando 30 μm por cada hora que la adquisición no será supervisada.
- Si está disponible, habilite la opción Auto-Save para permitir la supervisión de la adquisición desde una computadora personal para permitir el ajuste del tamaño de la pila z, si es necesario, para que se ajuste al área de interés dentro del foco.
Figura 3: Herramientas de imágenes en vivo y configuración . (A) Disección de embriones de ratón con un plato recubierto de agarosa bajo el microscopio estereoscópico. (B) Diagrama de los pasos para diseccionar embriones de ratón para imágenes vivas. (C) Posicionamiento del embrión en el soporte. (D) Diseño y características del portaembriones. (F) Cámara de incubadora alrededor del objetivo de inmersión. (G) Diagrama de configuración final para la adquisición de lapso de tiempo. Barra de escala = 500 μm (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Resultados
Utilizamos el protocolo para visualizar la activación de la señalización NOTCH en progenitores cardíacos tempranos a punto de diferenciarse a las células endoteliales durante la morfogénesis primitiva del tubo cardíaco. Para eso, cruzamos ratones C57BL / 6-N de tipo salvaje con ratones Tg (CBF: H2BVenus, +)18 para obtener embriones que informan actividad NOTCH a través de la proteína fluorescente amarilla Venus. En E7.5, la fluorescencia de Venus está presente en todo el ectodermo neural, con algu...
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Discusión
Los primeros progenitores del corazón se organizan en un tubo cardíaco primitivo que comienza a latir mientras aún se está formando. Comprender cómo se lleva a cabo este proceso es clave para identificar el amplio espectro de defectos cardíacos congénitos a eventos morfogenéticos específicos. Para eso, las imágenes en vivo ofrecen la oportunidad de estudiar el desarrollo embrionario normal y defectuoso con una mayor resolución temporal. Esto es especialmente útil para estudiar las células progenitoras cardíacas tempranas...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen al Dr. Kenzo Ivanovitch por su trabajo previo sobre este método y al grupo del Dr. Shigenori Nonaka (Institutos Nacionales de Ciencias Naturales, Japón) por proporcionar la experiencia inicial en el montaje de embriones. Este estudio ha contado con el apoyo de la subvención PGC2018-096486-B-I00 del Ministerio de Ciencia e Innovación y la subvención H2020-MSCA-ITN-2016-722427 del programa Horizonte 2020 de la UE a MT y la subvención 1380918 del Programa Operativo FEDER Andalucía 2014-2020 a JND. MS ha contado con el apoyo de una beca de doctorado de la Fundación La Caixa (LCF/BQ/DE18/11670014) y una beca itinerante de la Compañía de Biólogos (DEVTF181145). El CNIC cuenta con el apoyo del Ministerio de Ciencia y de la Fundación ProCNIC.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| #55 Pinzas | Dumont | 11295-51 | |
| Plato de 35 mm con fondo de cubreobjetos de vidrio de 14 mm Diámetro | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Mesa de tornillo de banco de 35 mm | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| tubos de 50 mL | BD Falcon | 352070 | |
| Agua | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | con L-Glutamina, sin Glucosa, sin Na Pyruvato |
| Suero Fetal Bovino | Invitrogen | 10438-026 | |
| Ratones transgénicos reporteros fluorescentes (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrito DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM para la adquisición de imágenes de células vivas |
| Grasa de silicona de alto vacío | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Soporte para cables | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Microscopio vertical | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee láser pulsado rojo lejano sintonizado a 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectores equipados con los conjuntos de filtros cian-amarillo (BP450-500/BP520-560), verde-rojo (BP500-520/BP570-610) y amarillo-rojo (BP520-560/BP645-710) | Zeiss | ||
| Obj: 20x inmersión en agua 1.0 NA, larga distancia de trabajo | Zeiss | ||
| Pipetas P1000 y P200 Aceite de parafina | |||
| Nidacon | VNI0049 | ||
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15070-063 | (la concentración final debe ser 50 μ g/mL de penicilina y 50 μ g/mL de estreptomicina) |
| Placas de Petri 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Puntas | |||
| Metacrilato de polimetilo | Reutilizado de viejos equipos de laboratorio | ||
| Rata Suero de cultivo de embrión, ratas macho SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Juego de finos de 160 mm | RS PRO | 541-6933 | |
| Capilares de vidrio estándar de 1,0 mm | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Estéril 0,22 μ m filtro de jeringa | Corning | 431218 | |
| Jeringa estéril de 5 ml | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Agujas de | |||
| Homogeneizador ultrasónico (sonicador) | Bandelin | BASO_17021 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
