体外 细胞活性评价纳米乳疫苗佐剂麦冬皂苷D

摘要

该方案详细介绍了评估纳米乳剂麦冬皂苷D佐剂是否能够促进有效细胞免疫反应的方法。

摘要

佐剂作为疫苗的主要成分，可直接诱导或增强与抗原相关的强烈、广泛、先天性及适应性免疫反应。麦冬皂苷D（OP-D）是从植物中提取的一种纯化成分 Ophiopogon japonicus，已被发现可作为疫苗佐剂使用。通过采用低能耗乳化法制备纳米乳剂麦冬皂苷D（NOD），可有效克服OP-D溶解度低和毒性高的问题。本文中，一系列 体外 细胞活性评估方案的考察. 采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测L929细胞的细胞毒性作用。随后，通过ELISA和ELISpot方法检测免疫小鼠脾细胞经刺激和培养后分泌的细胞因子水平及相应免疫细胞数量。此外，利用激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察来源于C57BL/6小鼠、经GM-CSF联合IL-4孵育成熟后的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）对抗原的摄取能力。重要的是，将空白小鼠的腹腔巨噬细胞（PMs）与佐剂共培养24小时后，通过ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）细胞因子水平，以确认巨噬细胞的活化状态。期望本实验方案可为其他研究人员提供直接且有效的实验手段，用于评估新型疫苗佐剂的细胞免疫应答效果。

引言

疫苗是预防和治疗传染性疾病及非传染性疾病的重要手段。在疫苗配方中适当添加佐剂和递送载体，有助于增强抗原的免疫原性并产生持久的免疫应答¹。除经典的佐剂铝盐（铝盐）外，目前已有六种佐剂被用于上市疫苗：MF59^2,3、AS04³、AS03³、AS01³、CpG1018⁴ 和 Matrix-M⁵。通常情况下，当人体遭遇病毒感染时，第一道和第二道防线（皮肤、黏膜和巨噬细胞）会率先清除病毒，最终激活第三道防线，即免疫器官和免疫细胞。自20世纪20年代初以来，铝及其盐类一直是人类疫苗中应用最广泛的佐剂，可引发有效的先天性免疫应答⁶。然而，有研究提出，经典佐剂通过激活抗原呈递细胞（APCs），刺激免疫细胞产生特定类型的细胞因子和趋化因子，这是佐剂发挥作用的机制之一，也可能是佐剂对特异性免疫应答仅产生短暂效应的原因之一⁷。目前获批用于人类的佐剂种类有限，这成为开发能够诱导有效免疫应答疫苗的制约因素⁸。

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方案

所有细胞实验均在配备基本操作室、缓冲室、无菌培养室以及鉴定与分析室的细胞工程实验室中进行。工作环境和条件无微生物污染及其他有害因素。动物实验遵循《实验动物护理和使用指南》进行，并经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。

1. 高压灭菌与材料准备

1. 通过高压灭菌（121 °C，20 分钟）进行湿热灭菌，准备试剂和耗材，如磷酸盐缓冲液（PBS）、剪刀、镊子和研磨网。
2. 所需试剂和设备详见材料表。空白纳米乳液（BNE）的配方请见表 1。

2. L929 细胞毒性实验

1. 打开水浴锅并将温度调节至 37 °C。从液氮中取出一支冻存的 L929 细胞管，在 37 °C 水浴中快速解冻。
2. 解冻后立即将细胞用移液器转移至一支 15 mL 无菌离心管中，加入 2 mL DMEM 培养基，并充分混匀。
3. 以 129 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。随后加入 2 mL DMEM 重悬细胞，再次以 129 × g 离心 5 分钟。
4. 弃去上清液，加入 6 mL 含 10% FBS 的完全 DMEM 培养基重悬细胞，转移至 T25 培养瓶中....

结果

OP-D和NOD佐剂的细胞活性评价已完成 体外 根据方案。L929成纤维细胞是用于筛选的有用模型 体外 NOD 毒性测试图1). 对脾脏中炎症性细胞因子水平的定量分析有助于研究人员更深入地理解免疫应答过程（图2）。在临床试验中评估抗原特异性T细胞免疫以及筛选疫苗候选物时，ELISpot检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是金标准（图3）。树突状细胞对抗原的摄取增加可引发更强的适应性免疫反应（图4。巨噬细胞在向T细胞呈递抗原方面发挥重要作用，同时可诱导其他抗原呈递细胞表达共刺激分子，从而启动适应性免疫应答（图5）。上述实验结果由 Tong 等发表，不同的抗体反应 体内 以及针对小鼠的保护效率可在原文中找到¹⁴.

讨论

亚单位疫苗具有良好的安全性，但免疫原性较差。提高其免疫原性的主要策略是将抗原与佐剂进行物理吸附或偶联，并将其整合到药物递送系统中，以促进树突状细胞（DCs）对抗原的摄取和呈递。天然植物皂苷（如奎拉雅皂苷及其衍生物）具有高毒性，不适合用于人用疫苗的开发¹⁷。因此，研究疫苗或佐剂对细胞的毒性作用是评价新型疫苗的必要第一步。

本研究中所采用的方案依据 ISO 10993-5:2009 进行¹⁸，这使得样品制备具有一定的灵活性。标准的毒性检测细胞系L929成纤维细胞与牙龈成纤维细胞在细胞毒性水平上相似。然而，L929成纤维细胞已成为一种有效的筛选模型 体外 由于其优异的可重复性，纳米材料的毒性测试¹⁹MTT和CCK-8常用于细胞活力和细胞毒性检测。MTT与CCK-8检测结果相互矛盾，且无显著相关性，但CCK-8检测所得细胞活力与MTT检测结果相比具有显著差异。²⁰之前研究中MTT结果.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x)	GIBCO, USA	25200056
96孔滤膜板	Millipore. Billerica, MA	CLS3922
AlPO₄	General Chemical Company, USA	null
自动细胞计数仪	Countstar, 中国	IC1000
BALB/c 小鼠和 C57BL/6 小鼠	北京华阜生物科技股份有限公司	null
辛酸/癸酸甘油三酯 (GTCC)	北京丰利医药有限公司，中国北京	null
CCK-8 试剂盒	Dojindo, 日本	CK04
细胞计数板	Costar, Corning, USA	CO010101
细胞筛	biosharp, 中国	BS-70-CS
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, 德国	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
DMEM 基础(1x) 培养基	GIBCO, USA	C11885500BT
DSZ5000X 倒置显微镜	Nikon, 日本	DSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35)	Mumbai, 印度	null
ELISpot 经典试剂盒	AID, 德国	ELR06
胎牛血清	GIBCO, USA	10099141C
多功能微孔板读数仪	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
GFP	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P42212
Glutamax	Invitrogen, USA	35050061
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子	GM-CSF, R&D Systems, USA	315-03
HEPES	Invitrogen, USA	15630106
HF 90/240 培养箱	Heal Force, 瑞士	null
IL-4	PeproTech, USA	042149
L929 细胞系	FENGHUISHENGWU, 中国	NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss, 德国	LSM 980
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, 法国	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, 法国	36372K
小鼠 IFN-γ ELISA 试剂盒	Dakewe, 中国	1210002
小鼠 IFN-γ 预包被 ELISPOT 试剂盒	Dakewe, 中国	DKW22-2000-096
小鼠 IL-17A ELISA 试剂盒	Dakewe, 中国	1211702
小鼠 IL-17A ELISpotPLUS 试剂盒	ebiosciences, USA	3521-4HPW-2
小鼠 IL-1β ELISA 试剂盒	Dakewe, 中国	1210122
小鼠 IL-6 ELISA 试剂盒	Dakewe, 中国	1210602
小鼠 TNF-α ELISA 试剂盒	Dakewe, 中国	1217202
非必需氨基酸(100x)	Invitrogen, USA	11140050
麦冬皂苷-D	成都普瑞科技有限公司	945619-74-9
青霉素-链霉素溶液	Invitrogen, USA	15070063
鬼笔环肽	Solarbio, 中国	CA1620
磷酸盐缓冲液	ZSGB-BIO, 中国	ZLI-9062
红细胞裂解液	Solarbio, 中国	R1010
RPMI 1640 培养基	Hyclone (Life Technology), USA	SH30809.01
丙酮酸钠(100 mM)	Invitrogen, USA	11360070
角鲨烯	Sigma, USA	S3626
β- 巯基乙醇	Invitrogen, USA	21985023