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Immunology and Infection

चूहों में इंट्राथिमिक इंजेक्शन के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव, सटीक और कुशल तकनीक

Published: August 23, 2022 doi: 10.3791/64309
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2,3,4
1Department of Radiology, Hackensack University Medical Center, 2Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health, 3Department of Pediatrics, Hackensack University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों में इंट्राथिमिक इंजेक्शन के लिए स्थापित एक इंटरवेंशनल रेडियोलॉजी प्रक्रिया का वर्णन करता है ताकि खुली सर्जरी के जोखिम से बचा जा सके और अंधे परक्यूटेनियस इंजेक्शन की सटीकता में सुधार किया जा सके।

Abstract

माउस मॉडल में इंट्राथिमिक इंजेक्शन थाइमिक और प्रतिरक्षा समारोह का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है, जिसमें आनुवंशिक और अधिग्रहित टी सेल विकार शामिल हैं। इसके लिए जीवित चूहों के थाइमस में अभिकर्मकों और / या कोशिकाओं के प्रत्यक्ष जमाव के तरीकों की आवश्यकता होती है। इंट्राथिमिक इंजेक्शन के पारंपरिक तरीकों में थोरैसिक सर्जरी या न्यूनतम इनवेसिव परक्यूटेनियस ब्लाइंड इंजेक्शन शामिल हैं, जिनमें से दोनों की महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। अल्ट्रा-हाई फ्रीक्वेंसी अल्ट्रासाउंड इमेजिंग उपकरणों ने चूहों में छवि-निर्देशित पर्क्युटेनियस इंजेक्शन को संभव बना दिया है, जिससे परक्यूटेनियस इंजेक्शन दृष्टिकोण की इंजेक्शन सटीकता में काफी सुधार हुआ है और छोटे लक्ष्यों के इंजेक्शन को सक्षम किया गया है। हालांकि, छवि-निर्देशित इंजेक्शन एक एकीकृत रेल प्रणाली के उपयोग पर निर्भर करते हैं, जिससे यह एक कठोर और समय लेने वाली प्रक्रिया बन जाती है। चूहों में परक्यूटेनियस इंट्राथिमिक इंजेक्शन के लिए एक अनूठी, सुरक्षित और कुशल विधि यहां प्रस्तुत की गई है, जो इंजेक्शन के लिए रेल प्रणाली पर निर्भरता को समाप्त करती है। तकनीक माउस थाइमस को गैर-आक्रामक रूप से चित्रित करने के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रो-अल्ट्रासाउंड इकाई का उपयोग करने पर निर्भर करती है। एक फ्री-हैंड तकनीक का उपयोग करके, एक रेडियोलॉजिस्ट सोनोग्राफिक मार्गदर्शन के तहत माउस थाइमस में सीधे सुई की नोक रख सकता है। इमेजिंग से पहले चूहों को साफ और एनेस्थेटाइज किया जाता है। अल्ट्रासाउंड-निर्देशित प्रक्रियाओं में निपुण एक अनुभवी रेडियोलॉजिस्ट के लिए, बताई गई तकनीक के लिए सीखने की अवधि काफी कम है, आमतौर पर एक सत्र के भीतर। इस विधि में चूहों के लिए कम रुग्णता और मृत्यु दर है और पर्क्यूटेनियस इंजेक्शन के लिए वर्तमान यांत्रिक रूप से सहायता प्राप्त तकनीकों की तुलना में बहुत तेज है। यह अन्वेषक को जानवर पर न्यूनतम तनाव के साथ किसी भी आकार के थाइमस (वृद्ध या इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों के थाइमस जैसे बहुत छोटे अंगों सहित) के सटीक और विश्वसनीय परक्यूटेनियस इंजेक्शन को कुशलतापूर्वक करने की अनुमति देता है। यह विधि वांछित होने पर व्यक्तिगत लोब के इंजेक्शन को सक्षम बनाती है और प्रक्रिया की समय-बचत प्रकृति के कारण बड़े पैमाने पर प्रयोगों की सुविधा प्रदान करती है।

Introduction

थाइमस की टी सेल के विकास और प्रतिरक्षा में एक आवश्यक भूमिका है। टी सेल की कमी, जो अन्य कारकों के बीच थाइमिक इनवोल्यूशन, आनुवंशिक विकार, संक्रमण और कैंसर उपचार के कारण हो सकती है, उच्च मृत्यु दर और रुग्णता 1,2 की ओर ले जाती है। माउस मॉडल बुनियादी और ट्रांसलेशनल इम्यूनोलॉजी अनुसंधान दोनों में अपरिहार्य हैं और दशकों से थाइमिक जीव विज्ञान और टी सेल विकास का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, साथ ही थाइमिक डिसफंक्शन और टी सेल की कमी से पीड़ित लोगों के लिए उपचार विकसित करने के लिए 3,4,5।

थाइमिक जांच का एक केंद्रीय हिस्सा माउस मॉडल 6,7,8,9,10,11,12 में कोशिकाओं, जीन या प्रोटीन जैसे जैविक सामग्रियों का इंट्राथिमिक इंजेक्शन रहा है। पारंपरिक इंट्राथिमिक इंजेक्शन विधियां थोराकोटॉमी का उपयोग करती हैं, जिसके बाद प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन के तहत इंट्राथिमिक इंजेक्शन या मीडियास्टिनम में "ब्लाइंड" परक्यूटेनियस इंजेक्शन द्वारा। सर्जिकल दृष्टिकोण दूसरों के बीच न्यूमोथोरैक्स जोखिम को काफी बढ़ाता है। इसके अलावा, इस सर्जरी के दौरान ऊंचा तनाव इम्यूनोसप्रेशन का परिणाम होता है, इस प्रकार संभावित रूप से इम्यूनोलॉजिकल डेटा13 से समझौता होता है। अनुभवी शोधकर्ता, कुछ अभ्यास के बाद, अंधे इंजेक्शन तकनीक का प्रदर्शन कर सकते हैं, लेकिन यह दृष्टिकोण कम सटीक है और इसलिए, प्रयोगात्मक विषयों को एक बड़े थाइमस के साथ युवा चूहों तक सीमित करता है।

अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन का उपयोग पारंपरिक इंट्राथिमिक इंजेक्शन दृष्टिकोण14 के लिए एक सटीक और न्यूनतम इनवेसिव विकल्प के रूप में पेश किया गया है। हालांकि, फ्री-हैंड तकनीक के बजाय एकीकृत रेल प्रणाली का उपयोग करते समय यह प्रक्रिया बहुत समय लेने वाली है। इंजेक्शन माउंट के साथ इंजेक्शन करने के लिए ट्रांसड्यूसर स्टैंड और माउंट, एक्स, वाई और जेड पोजिशनिंग सिस्टम जैसे विभिन्न अनुलग्नकों की मदद से ट्रांसड्यूसर के सावधानीपूर्वक इमेजिंग अनुकूलन और स्थिति की आवश्यकता होती है, साथ ही माइक्रो-मैनिपुलेशन नियंत्रण और रेल सिस्टम एक्सटेंशन के कुशल संचालन की आवश्यकता होती है। एक सरल वैकल्पिक तकनीक, अल्ट्रासाउंड-निर्देशित थाइमिक इंजेक्शन, यहां एक रेडियोलॉजिस्ट द्वारा फ्री-हैंड दृष्टिकोण15 का उपयोग करके प्रस्तुत किया गया है, जो उपरोक्त वर्णित विधियों के लिए एक तेज़ और सटीक न्यूनतम इनवेसिव विकल्प दोनों है। महत्वपूर्ण रूप से, वर्तमान दृष्टिकोण इंजेक्शन माउंट और एकीकृत रेल प्रणाली की आवश्यकता के बिना किसी भी उच्च-रिज़ॉल्यूशन अल्ट्रासाउंड इमेजिंग सिस्टम के साथ किया जा सकता है। यह विशेष रूप से चूहों की बड़ी संख्या के इंजेक्शन की आवश्यकता वाले अध्ययनों के लिए उपयोगी है, दोनों थाइमिक लोब के इंजेक्शन से जुड़े प्रयोगों के लिए, या वृद्ध, विकिरणित, या इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों12 में छोटे थाइमस के सटीक इंजेक्शन के लिए।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को सेंटर फॉर डिस्कवरी एंड इनोवेशन (आईएसीयूसी प्रोटोकॉल 290) में पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए, सी 57बीएल / 6 चूहे (महिला, 4-6 सप्ताह की उम्र), सी 57बीएल / 6 चूहे (महिला, 6 महीने की उम्र), जे: एनयू महिला चूहे, एनओडी स्सिड गामा (एनएसजी) मादा चूहे, और बी 6; कैग-ल्यूक, -जीएफपी चूहों का उपयोग क्रमशः युवा माउस मॉडल, वृद्ध माउस मॉडल, एथिमिक नग्न मॉडल, इम्यूनोडेफिशिएंसी मॉडल और बायोलुमिनेसेंस सेल स्रोत के रूप में किया गया था। चूहों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। इस प्रक्रिया में आमतौर पर दो लोगों की आवश्यकता होगी (एक इंजेक्शन करते समय बाँझ रहने के लिए और दूसरा चूहों को संभालने के लिए)।

1. जानवरों की तैयारी

  1. 3% -4% आइसोफ्लुरेन गैस का उपयोग करके चूहों में संज्ञाहरण को प्रेरित करें और नाक शंकु और सटीक-कैलिब्रेटेड वेपोराइज़र के माध्यम से प्रशासित 1% -3% आइसोफ्लुरेन गैस का उपयोग करके संज्ञाहरण बनाए रखें (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. पिछले पंजे की चुटकी के प्रति अनुक्रियाशीलता द्वारा उचित एनेस्थेटिक गहराई / बेहोशी की पुष्टि करें।
  3. 1 मिनट से कम समय के लिए डिपिलेटरी क्रीम की एक पतली परत लगाकर चूहों के पूर्ववर्ती छाती क्षेत्र से फर को हटा दें। ढीले फर के साथ क्रीम को पूरी तरह से हटाने के लिए गीले पेपर तौलिया का उपयोग करें।
    नोट: बहुत अधिक क्रीम लगाने से छाती क्षेत्र की त्वचा में सूजन हो जाएगी।
  4. एक समय में एक माउस रखें, लापरवाह, छोटे पशु अल्ट्रासाउंड इमेजिंग स्टेशन के गर्म मंच पर ( सामग्री की तालिका देखें) नाक शंकु के साथ (चित्रा 1)।
  5. माउस को पीछे और अग्रभाग पर चिकित्सा चिपकने वाले टेप के साथ मंच पर सुरक्षित करें (चित्रा 1)।
  6. कॉर्नियल सुखाने से रोकने के लिए दोनों आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
  7. क्लोरहेक्सिडाइन ग्लूकोनेट एप्लिकेटर का उपयोग करके फर मुक्त ऊपरी वक्ष त्वचा को कीटाणुरहित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

2. अल्ट्रासाउंड मशीन और बाँझ क्षेत्र की तैयारी

  1. उपलब्ध उच्चतम आवृत्ति रैखिक जांच को सक्रिय करें, आमतौर पर छवि बनाए जा रहे जानवर के आकार के लिए उच्चतम स्थानिक रिज़ॉल्यूशन वाली जांच। स्टार्टअप स्क्रीन के बाद संबंधित बटन पर टैप करके जांच को सक्रिय करें।
    नोट: चूहों के साथ इस आवेदन के लिए, उपयोग की जाने वाली जांच विशेष रूप से चूहों और छोटे चूहों के साथ उपयोग के लिए डिज़ाइन की गई है ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. नीचे दिए गए चरणों के बाद इमेजिंग और इंजेक्शन के लिए अल्ट्रासाउंड सेटिंग्स को अनुकूलित करें।
    1. स्क्रीन के दाईं ओर लंबवत उन्मुख स्लाइडर्स को समायोजित करके लक्ष्य जानवर के लिए एक उपयुक्त आकार में दृश्य के क्षेत्र की गहराई को समायोजित करें (चित्रा 2)। युवा चूहों के लिए अधिकतम गहराई सेटिंग आमतौर पर लगभग 6-8 मिमी होगी।
    2. स्क्रीन के निचले भाग पर क्षैतिज पट्टी के साथ बटन को स्लाइड करके ग्रेस्केल लाभ समायोजित करें (चित्रा 2)। लक्ष्य एक ऐसी छवि से शुरू करना है जो एक विशिष्ट "ग्रे" उपस्थिति की तुलना में थोड़ा गहरा है।
    3. फोकल ज़ोन (स्क्रीन के दाईं ओर नीला तीर, चित्रा 2) को थाइमस के प्रत्याशित स्तर पर समायोजित करें। युवा चूहों के लिए, यह 4 मिमी की गहराई के आसपास होगा।
    4. यदि छवि कैप्चर वांछित है, तो स्टोर छवि और स्टोर क्लिप बटन की कार्यक्षमता का परीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि छवियों को पूरी प्रक्रिया में उचित रूप से सहेजा जा सकता है। स्क्रीन के निचले दाईं ओर सेव क्लिप बटन पर टैप करके या फ्रीज बटन टैप करके, और फिर छवि सहेजें (चित्रा 2) पर टैप करके ऐसा करें।
  3. ट्रांसड्यूसर की सतह पर अल्ट्रासाउंड जेल की एक छोटी मात्रा (~ 1 एमएल) लागू करें ( सामग्री की तालिका देखें) जबकि यह सीधा है, या तो अल्ट्रासाउंड मशीन धारक में या एक सहायक के हाथों में आराम कर रहा है।
  4. गर्म मंच के बगल में एक छोटा बाँझ क्षेत्र तैयार करें। इसके लिए इष्टतम स्थिति आमतौर पर प्लेटफॉर्म और अल्ट्रासाउंड मशीन के बीच होती है।
    1. बाँझ क्षेत्र पर इन वस्तुओं को खाली करें: एक बाँझ जांच कवर, रबर बैंड, बाँझ दस्ताने, और बाँझ अल्ट्रासाउंड जेल ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. बाँझ मैदान स्थापित करने और वस्तुओं को जगह में रखने के साथ, बाँझ दस्ताने पर रखें।
    3. अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर (साथ ही जेल पर जो शुरू में जांच पर रखा गया था) पर बाँझ जांच कवर को सावधानीपूर्वक रखें। बाँझपन बनाए रखें और केवल बाँझ कवर को स्पर्श करें, और कुछ नहीं। बाँझ रबर बैंड को बाँझ जांच कवर पर स्लाइड करें ताकि इसे जगह पर रखा जा सके।
      नोट: एयर फॉसी, आकार की परवाह किए बिना, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकता है। इसलिए, अल्ट्रासाउंड जांच और जानवर के बीच एक वायु-मुक्त इंटरफ़ेस सुनिश्चित करने के लिए ट्रांसड्यूसर और बाँझ जांच कवर के बीच अल्ट्रासाउंड जेल और जांच कवर के शीर्ष पर अल्ट्रासाउंड जेल लागू करना आवश्यक है।
    4. ट्रांसड्यूसर पर बाँझ अल्ट्रासाउंड जेल की एक मध्यम मात्रा (2-3 एमएल) रखें।
      नोट: उपयोगकर्ता अब एक एनेस्थेटाइज्ड माउस की छवि बनाने के लिए तैयार है।

3. थाइमस की इमेजिंग और पता लगाना

  1. बाँझपन बनाए रखते समय, प्रारंभिक इमेजिंग के लिए माउस की पूर्ववर्ती छाती की दीवार के कीटाणुरहित हिस्से पर लंबवत रूप से अल्ट्रासाउंड जेल-टॉप जांच रखें।
    1. अल्ट्रासाउंड छवि को देखने और इसे आगे अनुकूलित करने के लिए एक पल लें। चरण 2.2 पर वापस जाएं और चित्रा 3 के समान उपस्थिति प्राप्त करने के लिए समायोजित करें।
  2. अनुप्रस्थ विमान में माउस की पूर्ववर्ती छाती को स्कैन करें। ट्रांसड्यूसर को लंबवत रूप से पकड़कर और पेंटब्रश जैसी या "स्वीपिंग" गति में गर्दन से पेट तक ऊपर और नीचे ले जाकर ऐसा करें।
    नोट: हृदय अपनी तेजी से गति और "कक्षित" उपस्थिति के कारण छाती में सबसे पहचानने योग्य संरचना होगी। एक बार जब दिल स्थानीयकृत हो जाता है, तो इसका उपयोग थाइमस की छवि प्राप्त करने के लिए एक संदर्भ बिंदु के रूप में किया जा सकता है।
  3. दृश्य के क्षेत्र में केंद्रित हृदय के साथ, ट्रांसड्यूसर को गर्दन की ओर थोड़ा सा घुमाएं। दिल से बेहतर, थाइमस का आमतौर पर सामना किया जाता है।
  4. थाइमस को एक बाइलोब्ड, पिरामिड, हाइपोइकोइक (स्क्रीन पर दिखाई देने वाला "डार्क" या "ब्लैक") संरचना के रूप में कल्पना करें जो मध्य रेखा में केंद्रित है, महाधमनी के पूर्ववर्ती और उरोस्थि के पीछे (चित्रा 3 ए)।
  5. ऊपरी छाती के दोनों ओर दो गोल युग्मित काले (यानी, "हाइपोइकोइक") संरचनाओं का एक नोट बनाएं।
    नोट: ये द्विपक्षीय वेने कैवे हैं। महाधमनी दो वेने कैवे के बीच मध्य रेखा में एक समान सुडौल हाइपोइकोइक संरचना है। ये आसानी से उनकी पल्सटाइल गति से पहचानने योग्य हैं।

4. थाइमस का इंजेक्शन

  1. यदि आवश्यक हो, तो ट्रांसड्यूसर पर अधिक (2-3 एमएल) बाँझ अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें।
    नोट: ट्रांसड्यूसर पर अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में बाँझ जेल (माउस वक्ष के आकार की तुलना में) माउस की छाती की दीवार के चारों ओर "जेल पैड" के रूप में कार्य करेगा। यह दृश्य के क्षेत्र के भीतर हवा द्वारा बनाए गए अल्ट्रासाउंड कलाकृतियों की संख्या को कम करेगा।
  2. अल्ट्रासाउंड जांच का उपयोग करके, थाइमस के सबसे चौड़े हिस्से का पता लगाएं, जो आमतौर पर इंजेक्शन के लिए आदर्श लक्ष्य साइट है। चुने हुए स्थान में एक क्षैतिज सुई प्रक्षेपवक्र का अनुमान लगाएं।
    1. ध्यान दें कि इस साइट पर प्रमुख रक्त वाहिकाएं (एसवीसी और महाधमनी) कहां स्थित हैं। इंजेक्शन के दौरान इनसे बचें।
    2. रक्त वाहिकाएं हाइपोइकोइक, पल्सटाइल संरचनाएं होंगी, जैसा कि चरण 3.7 में वर्णित है। यदि अनिश्चित है, तो जहाजों के भीतर प्रवाह की जांच करने के लिए रंग डॉपलर मोड का उपयोग करें (चित्रा 4 ए)। स्क्रीन पर रंग बटन टैप करके रंग डॉपलर मोड सक्रिय करें।
    3. यदि प्रमुख रक्त वाहिकाओं (या हृदय) में से एक अपेक्षित सुई प्रक्षेपवक्र के साथ होने की उम्मीद है, तो एक नया लक्ष्य क्षेत्र चुनें या एक अलग दृष्टिकोण / प्रक्षेपवक्र खोजें।
  3. ट्रांसड्यूसर को एक हाथ में पकड़ें और दूसरे में 10 μL इंजेक्शन के साथ एक 30 G इंसुलिन सुई ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: इंजेक्शन प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर भिन्न होगा। वर्तमान अध्ययन में फॉस्फेट-बफर्ड खारा, ट्रिपैन ब्लू, या डी-लूसिफेरिन (0.1 μg / 10 μL) का उपयोग किया गया था।
  4. इंजेक्शन प्रक्रिया शुरू करने के लिए, ट्रांसड्यूसर को पार्श्व रूप से स्थानांतरित करें ताकि थाइमस देखने के अल्ट्रासाउंड क्षेत्र में ऑफ-सेंटर हो। सुनिश्चित करें कि दृश्य के क्षेत्र के दूसरे पक्ष में ज्यादातर अल्ट्रासाउंड जेल होते हैं और कुछ नहीं।
  5. ट्रांसड्यूसर के नीचे जेल में सुई की नोक रखें और धीरे-धीरे सुई को तब तक स्थानांतरित करें जब तक कि यह त्वचा की सतह से सटे न हो (चित्रा 4 बी)।
  6. अल्ट्रासाउंड के तहत सुई को लगातार इमेजिंग करते समय, सुई को रक्त वाहिकाओं से दूर, एक परक्यूटेनियस प्रक्षेपवक्र के साथ थाइमस ग्रंथि में डालें।
    1. प्रवेश स्थल पर थाइमिक लोब में सुई की नोक रखने के लिए "क्रॉस थाइमस" क्षैतिज प्रक्षेपवक्र का उपयोग करें। यह सुई पथ के साथ संभावित रिसाव के लिए जिम्मेदार है (चित्रा 5 ए)।
  7. एक बार जब सुई की नोक थाइमस के वांछित हिस्से के अंदर होती है, तो सोनोग्राफिक विज़ुअलाइज़ेशन का उपयोग करते हुए 30 जी सिरिंज से सामग्री (जैसे ट्रिपैन ब्लू या डी-लूसिफेरिन के 10 μL, 0.1 μg / 10 μL) को जल्दी से इंजेक्ट करें।
    1. सुई सम्मिलन और इंजेक्शन के दौरान सिरिंज को स्थिर करने के लिए, अंगूठे और तीसरी उंगली के बीच सिरिंज को पकड़ें और तर्जनी उंगली से सिरिंज प्लंजर को नियंत्रित करें।
  8. सभी सामग्री जमा होने के बाद सुई को हटा दें।

5. जानवरों की इंजेक्शन के बाद की निगरानी

  1. जानवर को एक खाली पिंजरे में स्थानांतरित करें और तब तक निरीक्षण करें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
    नोट: संज्ञाहरण से पूर्ण वसूली 2 मिनट के भीतर होने की उम्मीद है।
  2. संकट, सांस लेने में कठिनाई या रक्तस्राव के संकेतों के लिए अतिरिक्त 10 मिनट के लिए जानवर की निगरानी करें।
    नोट: पोस्ट-इंजेक्शन दर्द की उम्मीद नहीं है, और आमतौर पर पोस्ट-इंजेक्शन एनाल्जेसिया की कोई आवश्यकता नहीं होती है।
  3. एक बार पूरी तरह से ठीक हो जाने और इंजेक्शन के बाद की अवलोकन अवधि के बाद, इंजेक्शन वाले जानवर को अन्य जानवरों की कंपनी में वापस कर दें।

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Representative Results

इस तकनीक का सफल कार्यान्वयन कुछ प्रमुख चरणों पर निर्भर करता है। सबसे पहले, थाइमस ग्रंथि की विश्वसनीय पहचान सुनिश्चित की जानी चाहिए। युवा चूहों में, यह ग्रंथि के बड़े आकार (चित्रा 3 ए) के कारण सीधा है। पुराने चूहों या इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों में, यह अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है; हालांकि, यह अभी भी आधुनिक अल्ट्रासाउंड उपकरण (चित्रा 3 बी, सी) के साथ बहुत संभव है। दूसरा, सुई प्रक्षेपवक्र को सेट करना गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है ताकि इसे छाती की दीवार की परतों के माध्यम से और थाइमस में सुई की नोक की उन्नति के दौरान लगातार कल्पना की जा सके। एक सफल इंजेक्शन में सुई को पूरी तरह से कल्पना की जाएगी, जबकि इसे उन्नत किया जा रहा है। यह ऑपरेटर को आश्वस्त करता है कि सुई ने एक महत्वपूर्ण संरचना को पार नहीं किया है, जैसे कि हृदय, महाधमनी, या अवर वेने कैवे (चित्रा 4) में से एक। यह इंजेक्शन पर भी लागू होता है। इंजेक्शन के दौरान सुई टिप को हमेशा अपने लक्ष्य स्थान पर देखा जाना चाहिए ताकि इंट्राथिमिक जमाव की पुष्टि की जा सके (चित्रा 5)।

कुछ मामूली नुकसान मौजूद हैं, जिन्हें यदि पहचाना जाता है, तो अपेक्षाकृत आसानी से कम किया जा सकता है। माउस को मंच और नाक शंकु तक सुरक्षित करते समय, माउस के वक्ष को यथासंभव तटस्थ बनाने की आवश्यकता होती है (यानी, महत्वपूर्ण बाएं या दाएं रोटेशन के बिना)। यदि वक्ष का बहुत अधिक रोटेशन है, तो सुई का सही "दृष्टिकोण कोण" आसानी से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, यदि माउस को कसकर पर्याप्त रूप से सुरक्षित नहीं किया जाता है, तो यह सुई को आगे बढ़ाने की कोशिश करते समय हिल या स्लाइड कर सकता है, शरीर रचना विज्ञान को विकृत कर सकता है और विज़ुअलाइज़ेशन को मुश्किल बना सकता है। हालांकि, उचित तकनीक और तैयारी के साथ, स्थिरता, विश्वसनीयता और प्रजनन क्षमता के साथ एक सफल इंट्राथिमिक इंजेक्शन प्राप्त किया जा सकता है।

एक बार इंजेक्शन पूरा हो जाने के बाद, इंजेक्शन के इंट्राथिमिक स्थान की पुष्टि करने के कई तरीके हैं। वर्तमान अध्ययन में लूसिफेरिन का उपयोग ल्यूसिफेरस ट्रांसजेनिक चूहों में एक इंजेक्शन के रूप में किया गया था। फिर इन्हें बायोलुमिनेसेंस इमेजिंग के साथ इंजेक्शन के तुरंत बाद मूल्यांकन किया जा सकता है, जो जानवर की बलि दिए बिना इंजेक्शन के सही स्थान की पुष्टि करता है (चित्रा 6 ए)। इस तकनीक का अतिरिक्त लाभ यह है कि इंजेक्शन लुसिफेरिन-टैग की गई कोशिकाओं को कई समय बिंदुओं पर चित्रित किया जा सकता है, जिससे थाइमस में गतिविधि की दृढ़ता सुनिश्चित होती है। वैकल्पिक रूप से, ट्रिपैन ब्लू को इंजेक्शन साइट के दृश्य मार्कर के रूप में इंजेक्ट किया जा सकता है, और इंजेक्शन सटीकता की पुष्टि तब नेक्रोपसी16 (चित्रा 6 बी) के साथ विवो से की जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: थाइमस के अल्ट्रासोनोग्राफी के लिए इमेजिंग चरण पर स्थित एनेस्थेटाइज्ड माउस। एक 6 सप्ताह की महिला C57BL/6 माउस को एक निष्क्रिय छाती के साथ एनेस्थेटाइज किया गया और इमेजिंग स्टेशन में स्थानांतरित कर दिया गया। माउस एक लापरवाह स्थिति में है, जिसमें फैले हुए पैर टेप द्वारा सुरक्षित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: अल्ट्रासाउंड मशीन सेटिंग्स। अल्ट्रासाउंड मशीन नियंत्रण कक्ष (टच स्क्रीन) की छवि। इमेजिंग को अनुकूलित करने के लिए सेटिंग्स का मुख्य समायोजन गहराई (लाल तीर), फोकल ज़ोन (पीले रंग में घिरा हुआ), और लाभ (लाल तारांकन) को समायोजित करना होगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: इम्यूनोसक्षम और इम्यूनोडेफिशिएंसी युवा और वृद्ध चूहों में थाइमस की अल्ट्रासाउंड इमेजिंग। (ए) इम्यूनोसक्षम युवा माउस (सी 57बीएल / 6, महिला, 4 सप्ताह पुराना, एन = 5)। अनुप्रस्थ सोनोग्राफिक दृश्य थाइमस के दाएं और बाएं लोब (तारांकन) को दर्शाता है। (बी) इम्यूनोसक्षम वृद्ध माउस (सी 57बीएल / 6, महिला, 6 महीने का, एन = 5)। थाइमस (तारांकन) छोटा है लेकिन अपने विशिष्ट स्थान और पिरामिड आकार को बनाए रखता है। (सी) इम्यूनोडेफिशिएंट युवा माउस (एनओडी स्सिड गामा, महिला, 4 सप्ताह पुराना, एन = 5)। सामान्य युवा माउस की तुलना में थाइमस (तारांकन) के बहुत छोटे आकार पर ध्यान दें। (डी) एथिमिक नग्न माउस (महिला, 8 सप्ताह पुराना, एन = 1)। थाइमिक ऊतक की पूरी अनुपस्थिति है। ध्यान दें, छवि (तारांकन) के बीच में अंधेरे (हाइपोइकोइक) ऊर्ध्वाधर रेखा उरोस्थि से एक छायादार कलाकृति है, जिसमें कोई वास्तविक थाइमिक ऊतक नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
(ए) पूर्ववर्ती वक्ष की कलर डॉपलर छवि मीडियास्टिनल वाहिकाओं के साथ थाइमस के संबंध को दर्शाती है। निचला केंद्र महाधमनी चाप (लाल तीर) है, और दोनों तरफ गोल वाहिकाएं दाएं और बाएं बेहतर वेने कैवे (पीले तीर) हैं। इमेजिंग जांच की ओर बहने वाला रक्त लाल रंग में एन्कोड किया गया है, और ट्रांसड्यूसर से दूर बहने वाला रक्त नीले रंग में एन्कोड किया गया है। (बी) बाईं तरफा दृष्टिकोण से छाती में उन्नति से पहले सुई प्लेसमेंट। सुई टिप (पीला तीर) अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर और थाइमस के मध्य भाग के साथ टिप स्तर के अनुरूप होना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: इंजेक्शन तकनीक( ए) एक इम्यूनोसक्षम युवा माउस के दाहिने थाइमिक लोब के इंजेक्शन के लिए सुई प्लेसमेंट। सुई की नोक (पीला तीर) दाहिने लोब के मध्य भाग में है। (बी) दाहिने लोब की इंजेक्शन के बाद की छवि इंजेक्शन साइट (डैश्ड रेड लाइन) पर अंधेरे (हाइपोइकोइक) तरल पदार्थ और छोटे उज्ज्वल (इकोजेनिक) हवा के बुलबुले का संग्रह दिखाती है। पीला तीर सुई की नोक को इंगित करता है। (सी) एक इम्यूनोसक्षम युवा माउस के बाएं थाइमिक लोब के इंजेक्शन के लिए सुई प्लेसमेंट (सुई की नोक पर पीला तीर)। (डी) एक इम्यूनोसक्षम युवा माउस के दाहिने लोब के इंजेक्शन के लिए सुई प्लेसमेंट (पीला तीर)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
(ए) 8 सप्ताह के ल्यूसिफेरस ट्रांसजेनिक माउस के थाइमस में डी-लूसिफेरिन (0.1 μg/10 μL) का इंजेक्शन, इसके बाद विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम (n = 3) का उपयोग करके विवो बायोलुमिनेसेंस इमेजिंग में 1 s का इंजेक्शन। रंग कोडिंग कुल बायोल्यूमिनेसेंस रेडिएंस (फोटॉन-एस-1.सेमी-2.स्टेरेडियन-1) को दर्शाती है जैसा कि दाईं ओर रंग पट्टी द्वारा इंगित किया गया है। (बी) दो 5 सप्ताह के सी 57बीएल / 6 चूहों के थाइमस को ट्रिपैन ब्लू के साथ इंजेक्ट किया गया था, और इंजेक्शन सटीकता नेक्रोपसी (एन = 3) द्वारा प्रदर्शित की गई थी। शीर्ष पैनल: ट्रिपैन ब्लू-सना हुआ थाइमस की पृष्ठीय सतह सीटू में इंजेक्ट किया गया थाइमस। नीचे पैनल: बाएं लोब के इंजेक्शन के बाद ट्रिपैन ब्लू-सना थाइमस एक्स सीटू की उदर सतह। टकेट एट अल.1 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक अल्ट्रासाउंड-निर्देशित फ्री-हैंड इंजेक्शन एक कुशल और सड़न रोकनेवाला तरीके से थाइमस को अध्ययन सामग्री देने के लिए एक अत्यधिक सटीक तकनीक है। इंजेक्शन स्थल पर त्वचा की प्रारंभिक नसबंदी के बाद, बाँझ दस्ताने, बाँझ अल्ट्रासाउंड जांच कवर और बाँझ अल्ट्रासाउंड जेल के उपयोग के कारण प्रक्रिया के दौरान बाँझपन बनाए रखा जाता है। अंधे परक्यूटेनियस दृष्टिकोण10,17 के विपरीत या थाइमस18,19 के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन के लिए सर्जिकल चीरों पर भरोसा करना, जो चूहों में इंट्राथिमिक इंजेक्शन के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तरीके हैं, फ्री-हैंड अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन का उपयोग प्रक्रिया की जबरदस्त सटीकता के साथ उच्च स्तर की सुरक्षा और त्वरितता को जोड़ता है। रेल प्लेटफॉर्म14 का उपयोग करके अल्ट्रासाउंड-निर्देशित इंजेक्शन का संचालन सुरक्षा और सटीकता का एक समान स्तर प्रदान करता है, लेकिन यह बोझिल दृष्टिकोण आमतौर पर माउस को एनेस्थेटाइज्ड और इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर तैनात किए जाने के क्षण से प्रति इंजेक्शन कम से कम 5 मिनट लेता है, फ्री-हैंड तकनीक की तुलना में जो एक विशेषज्ञ के लिए प्रति माउस15 के लगभग 20-30 एस में इंजेक्शन पूरा करना संभव बनाता है।

अल्ट्रासाउंड-निर्देशित फ्री-हैंड इंजेक्शन तकनीक सहित इंट्राथिमिक इंजेक्शन के लिए सभी विभिन्न तरीकों में उच्च दक्षता स्तर प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण अनुभव और प्रशिक्षण आवश्यक हैं। हालांकि, अल्ट्रासाउंड-निर्देशित प्रक्रियाओं में नैदानिक अनुभव वाला एक रेडियोलॉजिस्ट 1 घंटे के अभ्यास सत्र के भीतर चूहों के इंट्राथिमिक इंजेक्शन में कुशल हो सकता है।

फ्री-हैंड इंजेक्शन विधि का लचीलापन अन्वेषक को अध्ययन की विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर या तो एक थाइमिक लोब, एक इंजेक्शन पास में दोनों थाइमिक लोब, या दो अलग-अलग इंजेक्शन में दोनों थाइमिक लोब इंजेक्ट करने की अनुमति देता है। ध्यान दें, प्लेसबो बनाम अध्ययन सामग्री के साथ व्यक्तिगत थाइमिक लोब को इंजेक्ट करने का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में प्लेसबो-इंजेक्शन लोब का उपयोग करके आवश्यक अध्ययन विषयों की संख्या को कम करने के लिए एक रणनीति के रूप में किया जा सकता है। इसके विपरीत, एकीकृत रेल प्रणाली का कठोर सेटअप प्रति इंजेक्शन अवधि में एक थाइमिक लोब में इंजेक्शन की अनुमति देता है। दूसरे लोब के इंजेक्शन के लिए सिरिंज धारक अनुलग्नक को अलग करने, इसे माउस के रिवर्स साइड पर स्थापित करने और माइक्रो-मैनिपुलेशन नियंत्रणों को सावधानीपूर्वक समायोजित करने की आवश्यकता होगी जब तक कि अगले इंजेक्शन के आगे बढ़ने से पहले सुई का प्रक्षेपवक्र सही न हो। ये मुद्दे एनेस्थीसिया जोखिम और प्रयोग को पूरा करने के लिए आवश्यक समय को काफी हद तक बढ़ाते हैं।

ब्लाइंड इंट्राथिमिक इंजेक्शन प्रक्रिया की तुलना में फ्री-हैंड अल्ट्रासाउंड इंट्राथिमिक विधि का एक अनूठा लाभ पुराने चूहों (6 महीने या उससे अधिक उम्र) के थाइमस जैसे छोटे थाइमस को सटीक रूप से इंजेक्ट करने में सापेक्ष आसानी है, जो छोटे चूहों (4-10 सप्ताह पुराने) की तुलना में आकार में बहुत छोटे हैं। यह लाभ, स्केल-अप की आसानी के साथ मिलकर, इम्यूनोलॉजिस्ट को प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला में इंट्राथिमिक इंजेक्शन-आधारित अध्ययन करने की अनुमति देता है।

निष्कर्ष में, अवलोकन व्यक्तिगत थाइमिक लोब को लक्षित करने वाले सुरक्षित, तेज और सटीक इंजेक्शन के लिए फ्री-हैंड तकनीक का समर्थन करने वाले पर्याप्त सबूत प्रदान करते हैं। इसलिए, यह न्यूनतम इनवेसिव विधि, थाइमस अनुसंधान के लिए एक अत्यधिक कुशल और सटीक विकल्प का प्रतिनिधित्व करती है, जो बड़े से लेकर बेहद छोटे तक थाइमस के साथ चूहों में बड़े पैमाने पर प्रीक्लिनिकल जांच की सुविधा प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम इस तकनीक पर अपने व्यावहारिक और व्यापक प्रारंभिक काम के लिए रेमंड एच थॉर्नटन को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस अध्ययन को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (एनसीआई 1 आर 37सीए 250661-01 ए 1), चिल्ड्रन ल्यूकेमिया रिसर्च एसोसिएशन, हैकेनसैक मेरिडियन स्कूल ऑफ मेडिसिन और एचयूएमसी फाउंडेशन / डील किड्स कैंसर से अनुदान सहायता द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquasonic 100 Ultrasound Gel Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) 01-01 Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouse The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) 025854 Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needle Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) 328431 Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse - aged The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) 000664 age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse - young The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) 000664 age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mL CareFusion (El Paso, TX, USA) 260449 chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped Applicator Cardinal Health (Dublin, OH, USA) A5000-2 Sterile, 6"
D-Luciferin Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) LUCK-1G
Isoflurane Henry Schein (Melville, NY, USA) 1182097
IVIS Lumina X5 PerkinElmer (Melville, NY, USA) n/a In vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouse The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) 007850 Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper Tape Cardinal Health (Dublin, OH, USA) 1914C
Kimtech Surgical Nitrile Gloves Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) 56892 Sterile Gloves
Nair Hair Remover Lotion Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) n/a Depilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouse The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) 005557 Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x Corning (Corning, NY, USA) 21-040-CV
Puralube Vet Ointment Med Vet International PH-PURALUBE-VET Eye ointment
Sheathes Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) 10040 Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction Chamber Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) EZ-17 85 Anesthesia induction chamber
Transducer MX550D FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) n/a Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS MP Biomedicals (Solon, OH, USA) 91691049
Vevo 3100 Imaging System FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) n/a Ultrasound imaging system
Vevo 3100 Lab Software FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) n/a Version 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia System FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) n/a Tabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging Station FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) n/a Procedural platform

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 186
चूहों में इंट्राथिमिक इंजेक्शन के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव, सटीक और कुशल तकनीक
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McGuire, M. T., Tuckett, A. Z.,… More

McGuire, M. T., Tuckett, A. Z., Myint, F., Zakrzewski, J. L. A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice. J. Vis. Exp. (186), e64309, doi:10.3791/64309 (2022).

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