Summary
免疫荧光染色期间的酪胺信号扩增能够在 HSV-1 感染后 ZBP1 诱导的坏死性凋亡期间灵敏地检测磷酸化的 RIPK3 和 MLKL。
Abstract
激酶受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）及其底物混合谱系激酶结构域样（MLKL）是坏死性凋亡的关键调节因子，坏死性凋亡是一种具有重要抗病毒功能的细胞死亡的炎症形式。RIPK3的自磷酸化诱导坏死性凋亡MLKL的孔形成刽子蛋白的磷酸化和活化。细胞膜上磷酸化MLKL的运输和寡聚化导致细胞裂解，这是坏死性凋亡细胞死亡的特征。核酸传感器ZBP1在感染RNA和DNA病毒后通过与左旋Z型双链RNA（Z-RNA）结合来激活。ZBP1活化通过诱导受感染宿主细胞的调节细胞死亡（包括坏死性凋亡）来限制病毒感染。免疫荧光显微镜允许在每个细胞的基础上可视化ZBP1介导的坏死性凋亡下游的不同信号传导步骤。然而，使用目前市售的针对人RIPK3和MLKL的磷酸化特异性抗体的标准荧光显微镜的灵敏度排除了这些标志物的可重复成像。在这里，我们描述了感染单纯疱疹病毒1（HSV-1）的人HT-29细胞中丝氨酸（S）磷酸化RIPK3（S227）和MLKL（S358）的优化染色程序。在免疫荧光染色方案中加入酪胺信号放大（TSA）步骤可以特异性检测S227磷酸化的RIPK3。此外，TSA大大提高了S358磷酸化MLKL检测的灵敏度。总之，该方法能够在诱导ZBP1诱导的坏死性凋亡期间可视化这两个关键信号事件。
Introduction
受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 3 （RIPK3） 和混合谱系激酶结构域样 （MLKL） 是坏死性凋亡细胞死亡的中枢调节因子1，2。坏死性凋亡是一种溶解性和炎症性调节性细胞死亡形式，涉及抗病毒免疫和自身炎症。病毒感染细胞的坏死性凋亡会立即关闭病毒复制。坏死性凋亡诱导后的细胞裂解也会释放与损伤相关的分子模式，从而刺激抗病毒免疫3，4。坏死性凋亡是由 RIP 同型相互作用基序 （RHIM） 介导的与三种上游活化分子之一的相互作用后激活 RIPK3 引发的：RIPK1（TNF 受体 1 [TNFR1] 接合时）、含 TIR 结构域的适配器诱导干扰素β（TRIF;在 Toll 样受体 3 和 4 接合时）或抗病毒核酸传感器 Z-DNA 结合蛋白 1 （ZBP1）1，2.坏死性凋亡信号传导通过一系列磷酸化事件进行，从RIPK3的自磷酸化开始。人RIPK3在其激酶结构域内的丝氨酸（S）227处的自磷酸化是通过与MLKL相互作用来使坏死性凋亡的先决条件，并且通常用作人RIPK3活化和坏死性凋亡细胞死亡的生化标志物1，5。一旦激活，RIPK3在苏氨酸（T）357和S3581处磷酸化MLKL的活化环。这会导致MLKL构象发生变化，导致N末端四螺旋束结构域暴露。然后MLKL寡聚并运输到细胞膜，在那里它通过在脂质双层中插入暴露的四个螺旋束形成孔，最终导致细胞死亡2，6。
ZBP1 是一种抗病毒核酸传感器，可识别左旋 Z 型核酸，包括 Z 构象 （Z-RNA） 中的双链 RNA。Z-RNA结合通过位于ZBP1的N末端的两个Zα结构域发生。在RNA和DNA病毒感染过程中积累的Z-RNA被认为直接参与ZBP17，8。活化的ZBP1通过其中枢RIM募集RIPK3并诱导调节细胞死亡，包括坏死性凋亡9，10。病毒已经采用了许多逃逸机制来抵消ZBP1诱导的宿主细胞坏死性凋亡11。例如，单纯疱疹病毒 1 （HSV-1） 核糖核苷酸还原酶亚基 1，称为 ICP6 并由 UL39 编码，在其 N 末端含有 RHIM，干扰人细胞中 ZBP1 介导的 RIPK3 活化12，13，14，15。ZBP1不仅限制病毒复制，而且小鼠研究表明，ZBP1激活引起炎症性疾病并刺激癌症免疫16，17，18，19，20，21。因此，检测ZBP1诱导的人类细胞坏死性凋亡期间发生的信号事件的协议对于评估ZBP1在这些过程中的作用很有价值。
酪胺信号放大（TSA），也称为催化报告沉积（CARD），已被开发用于提高基于抗体的免疫测定中的检测限和信噪比。在TSA期间，任何一抗都可用于检测目标抗原。辣根过氧化物酶（HRP）与二抗偶联，在过氧化氢存在下催化生物素化酪胺自由基的局部积聚。这些活化的生物素-酪胺自由基然后与近端酪氨酸残基反应形成共价键。潜在的酪胺-生物素底物包括抗原本身、一抗和二抗以及邻近的蛋白质。因此，虽然TSA显着提高了测定的灵敏度，但其一些空间分辨率会丢失。在最后一步中，使用荧光标记的链霉亲和素检测生物素分子。HRP反应在目标抗原上或附近沉积了许多酪酰胺-生物素分子。这大大增加了链霉亲和素-荧光染料结合位点的数量，从而大大增强了测定的灵敏度（图1）。或者，酪胺可以直接与荧光染料偶联，无需链霉亲和素偶联的荧光团。蛋白质免疫组织化学和DNA/RNA 原位 杂交是最早采用TSA提高信号强度的方法之一22，23。最近，TSA已与细胞内流式细胞术24 和质谱术25相结合。
在这里，我们提出了一种方案，用于检测丝氨酸227磷酸化人RIPK3（p-RIPK3 [S227]）和磷酸化人MLKL（p-MLKL [S358]）在HSV-1感染激活ZBP1时使用免疫荧光显微镜。我们使用坏死性凋亡敏感的HT-29人结直肠腺癌细胞系，该细胞系被转导以稳定表达人ZBP1。这些细胞感染了表达突变ICP6蛋白（HSV-1 ICP6mutRHIM）的HSV-1菌株，其中病毒RHIM（VQCG）内的四个核心氨基酸被丙氨酸（AAAA）取代，从而使ICP6无法阻断ZBP1介导的坏死性凋亡13，14，15。为了克服目前市售的针对p-RIPK3和p-MLKL的抗体在免疫染色26中的低信噪比问题，我们执行了酪胺信号放大（TSA）步骤（图1），该步骤可对人p-RIPK3（S227）进行稳健检测，并将人p-MLKL（S358）的检测灵敏度提高一个数量级。
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Protocol
1. 生物素化酪胺的制备
- 从生物素-酪酰胺开始制备生物素化酪胺。要制备 10 mM 储备溶液，请将 3.6 mg 生物素-酪胺溶解在 1 mL DMSO 中。将溶解的产品等分储存在-20°C以保持质量。
2. 维持培养中的HT-29细胞
注意：表达ZBP1的HT-29是通过用编码人ZBP1的lentivector27 转导产生的。
- 将表达ZBP1的HT-29细胞保持在McCoy的5A培养基中，补充有L-谷氨酰胺，丙酮酸钠和10%胎牛血清（从现在开始称为全培养基），并在培养箱中保持37°C和5%二氧化碳。理想情况下，使用低传代数（小于10）的细胞。在实验开始前，让细胞在解冻周期后至少恢复5天。
- 为了从培养瓶中分离细胞，除去培养基并用5mL PBS（预热至37°C）洗涤细胞。接下来，向细胞中加入适量的胰蛋白酶/EDTA（分别为0.05%胰蛋白酶和0.032%EDTA，预热至37°C）（T75烧瓶为2mL，T175烧瓶为3mL）。
- 用胰蛋白酶/ EDTA在37°C的培养箱中用5%二氧化碳孵育细胞长达10分钟。然后，点击烧瓶并使用具有4x-20x物镜放大倍率的显微镜目视检查细胞是否从烧瓶中分离。
- 如果细胞没有完全分离，则在37°C下再孵育5分钟。 当细胞分离时，通过向烧瓶中加入6mL全培养基来停止酶促反应。
- 将细胞悬液收集在 15 mL 管中。使用台盼蓝染色剂计数细胞以评估活力;建议使用 1：5 稀释度。仅当细胞的活力超过90%时，才继续进行实验。
3.开始实验，接种和刺激细胞
- 在1 cm²表面积孔板中全培养基中接种90，000个表达ZBP1的HT-29细胞，以进行高端显微镜检查。每孔使用200 μL的结束体积。
- 将细胞在37°C下用5%二氧化碳孵育过夜。考虑到需要接种一些额外的孔来进行染色对照，这在步骤5.6中有更详细的解释。
- 当细胞达到70%-80%汇合时，向细胞添加坏死性凋亡诱导刺激。在这里，细胞感染HSV-1 ICP6mutRHIM （感染多重性[MOI]为5，定义为斑块形成单位（pfu）除以细胞数量;使用Vero细胞上的斑块测定定量PFU）6小时，8小时或10小时。
- 作为坏死性凋亡诱导的阳性对照，用含有 30 ng/mL TNF、20 μM 泛半胱天冬酶抑制剂 zVAD-fmk 和 5 μM SMAC 模拟物 BV6 的坏死性凋亡诱导混合物刺激细胞 4 小时。
- 作为 p-RIPK3 （S227） 染色的阴性对照，包括 GSK'840 （1 μM） 以抑制 RIPK3 激酶活性并防止 S227 的自磷酸化。理想情况下，在未经治疗的条件下和坏死性凋亡刺激后添加抑制剂。抑制剂可以与病毒感染同时添加。
- 在全培养基中制备刺激，预热至37°C。 所有刺激均使用每孔 200 μL 的终止体积。
4. 固定细胞
- 取出培养基并用 200 μL 1x PBS 洗涤细胞。然后，向细胞中加入 150 μL 4% PFA（已在室温下平衡），并在室温下孵育 30 分钟。
注意：如果您使用的是易于分离的细胞，则可以按如下方式优化细胞的固定。从孔中取出 100 μL 培养基，使 100 μL 的体积留在板上。向细胞中加入 100 μL 4% PFA。将细胞在室温下孵育5分钟。然后，从孔中取出培养基/固定剂，并用 150 μL 4% PFA 替换。将细胞在室温下再孵育20分钟，以确保细胞完全固定。 - 固定后，去除 4% PFA，并用 200 μL 1x PBS 洗涤细胞 3 次。样品可以在4°C下储存在过量（>200μL）的1x PBS中过夜，直到进一步处理。
5. 透化和初次染色
- 取出 PBS 并加入 100 μL 透化缓冲液（PBS 中的 0.5% Triton X-100）。在室温下孵育30分钟。
- 取出透化缓冲液，随后用 100 μL 洗涤缓冲液（PBS 中的 0.1% Triton X-100）洗涤孔。将成像室与洗涤缓冲液在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育5分钟（每分钟20-30次摇摆运动）。
- 为防止一抗的非特异性结合，加入 100 μL 封闭培养基并在室温下孵育 2 小时。或者，该封闭步骤可以通过在室温下用3%BSA，0.1%Triton-X-100在PBS中封闭1小时来代替。
- 用 100 μL 洗涤缓冲液（PBS 中的 0.1% Triton X-100）洗涤孔 3 次。将洗涤步骤在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育5分钟。
- 除去洗涤缓冲液后，将一抗加入成像室并在4°C孵育过夜。 使用 100 μL 的末端体积覆盖孔。在 4°C 孵育过夜期间，请勿将成像室放在倾斜的实验室摇床上。
注意：抗p-MLKL（S358;稀释度：1：200）和抗p-RIPK3（S227;稀释度：1：200）将兔子作为宿主物种，因此不应合并在一个孔中。为了监测病毒感染，将针对所选病毒蛋白的一抗与p-MLKL（S358）或p-RIPK3（S227）联合使用。在这里，细胞感染HSV-1感染，然后进行ICP0染色（稀释：1：50，宿主物种：小鼠）。 - 此时要考虑必要的染色对照。始终包括无一抗条件，以可视化TSA扩增步骤的潜在背景，以设置掩蔽阈值（参见步骤9）。
注意：对于共染色方案（例如，将p-MLKL [S358]或p-RIPK3 [S227]与针对病毒蛋白的抗体组合），也使用单一染色剂。使用单一染色剂对于校正其他成像通道中的潜在渗漏信号非常重要。
6. 酪胺信号放大
- 取出一抗混合物，并用 100 μL 洗涤缓冲液（PBS 中的 0.1% Triton X-100）洗涤孔 3 次。将洗涤步骤在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育5分钟。
- 取出洗涤缓冲液，加入 100 μL HRP 标记的二抗，识别需要扩增的一抗种类。为了扩增 p-RIPK3 （S227） 或 p-MLKL （S358） 信号，加入 100 μL 抗兔 HRP，并在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育 30 分钟。
注意：只有p-MLKL（S358）或p-RIPK3（S227）会被放大。病毒蛋白的染色将使用标准的间接染色方法进行可视化。 - 之后，用 100 μL 洗涤缓冲液（PBS 中的 0.1% Triton X-100）洗涤孔 3 倍。将洗涤步骤在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育5分钟。
- 在接下来的步骤中，将生物素化的酪酰胺添加到显微平板中。使用与二抗偶联的HRP基团，酶促反应将触发靠近主要靶标的酪胺自由基的形成（此处为p-MLKL [S358]或p-RIPK3 [S227]）。
- 为了激活HRP的酶活性，将氧化底物与生物素化的酪胺一起添加。为此，用0.03 M H 2 O2补充TSA缓冲液（0.1 M硼酸[pH 8.5]）;具体来说，取 5 mL TSA 缓冲液并加入 5 μL 30% H 2 O2。
- 现在，将生物素-酪酰胺稀释在补充的 H2O2 补充的 TSA 缓冲液中，范围为 1：1，000 至 1：20，000。
注意：生物素-酪胺的稀释因子需要每批优化。 - 从孔中取出洗涤缓冲液，并向孔中加入稀释的生物素 - 酪胺至结束体积为100μL。 在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育10分钟。
- 接下来，用 100 μL 洗涤缓冲液（PBS 中的 0.1% Triton X-100）洗涤孔 3 倍。将洗涤步骤在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育5分钟。
7. 荧光基团
注意：由于一抗的信号被转化为生物素基团，因此使用与荧光团偶联的链霉亲和素（荧光团568，稀释度：1：500）可视化p-MLKL（S358）和p-RIPK3（S227）。此外，用DAPI（5μg/ mL）对细胞核进行染色。如果染色方案中包含病毒蛋白，请包括针对一抗宿主物种的合适荧光标记二抗。在代表性结果中，使用了小鼠抗ICP0。作为二抗，包括与荧光团633（稀释度：1：1，000）偶联的山羊抗小鼠。
- 在含有上述抗体和染色剂的洗涤缓冲液（PBS中的0.1%Triton X-100）中进行染色混合物。取出洗涤缓冲液，加入 100 μL 染色混合物，并在室温下在倾斜实验室摇床上孵育 1 小时。从此步骤开始，保持成像室免受光线照射。
- 接下来，用洗涤缓冲液（PBS中的0.1%Triton X-100）洗涤孔2倍。将洗涤步骤在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育5分钟。
- 最后，用 1x PBS 冲洗孔 2 次。将样品储存在过量（> 200 μL）的 1x PBS 中，直到成像。或者，将样品浸没在封片剂中以保存染色。成像室现在可以在共聚焦显微镜上可视化。
8. 使用共聚焦显微镜成像
- 成像前至少10分钟打开共聚焦显微镜和激光。
- 使用浸没物镜提高灵敏度。优选地，使用40x或63x物镜放大倍率。成像前，使用适当的棉球用镜头清洁剂清洁浸没物镜。脏物镜（例如，由于灰尘）会导致图像质量降低。
- 在成像室的底部放过量的油。此外，在所选物镜上添加一滴油。
- 将成像室放在显微镜上。使用 DAPI 染色或使用明场成像查找焦点区域。如有必要，在成像室周围移动以确保浸油正确扩散。
- 在显微镜上设置必要的成像轨迹。根据显微镜的不同，以下步骤可能会有所不同（表1）。
注意：设置成像磁道时，对磁道进行编程，以便最后测量核染色。405 nm 激光可能导致光漂白，从而导致所有通道中特定信号的丢失。 - 要分析完整像元是否存在 p-RIPK3 （S227） 或 p-MLKL （S358），请测量跨越像元高度的 z 堆栈。在这里，z-stacks由每0.16μm的40个切片组成，范围为6.22μm。
| 跟踪 | 激光 | 分束器 | 滤波器 |
| pRIPK3 （S227） /pMLKL （S358） | 561 | MBS -405 + | BP 570-620 + LP645 |
| MBS 488/561/633 + SBS SP615 | |||
| 病毒基因： ICP0 | 633 | MBS -405 + | BP 420-480 + LP605 |
| MBS 488/561/633 + SBS LP570 | |||
| 细胞核：DAPI | 405 | MBS -405 + | BP 420-480 + BP 495-550 |
| MBS 488/561/633 |
表 1：用于细胞可视化的成像轨迹。
9. 数据分析和量化
- 将显微图像上传到软件。使用扩展焦点在 2D 图像中可视化 z 堆栈的所有信息。
- 接下来，对分析协议进行编程以提取以下信息：每张图像的细胞数，显示p-RIPK3（S227）+或p-MLKL（S358）+染色的体素总和。体素表示三维体积，定义为像素的三维等效物。
- 要量化每个图像的细胞数量，请分割细胞核。为了减少分割结果中的噪声，请为分割添加尺寸限制（>100 μm³）。分割细胞核的数量表示图像中的细胞数。
- 要量化 p-RIPK3 （S227）+ 或 p-MLKL （S358）+ 体素的数量，请对基于阈值的分割进行编程。设置阈值，以便在无一抗（NP）图像中不拾取任何信号。
- 使用来自未处理的模拟条件的图像进一步调整阈值。为确保灵敏地检测坏死性凋亡刺激引起的信号增加，请通过设置更高的阈值来限制模拟条件下 p-RIPK3 （S227）+ 或 p-MLKL （S358）+ 体素的拾取。始终检查来自模拟条件和坏死性凋亡诱导病毒感染的几张图像中的程序分析方案。
- 对所有图像集运行分析。将体素量化和细胞核分割导出到.txt文件中，以便在电子表格软件中进一步处理。
- 制作数据透视表，显示图像名称、细胞核量化和检测到的体素总和。
- 接下来，将正体素的总和除以图像中的细胞计数。这将导致每个像元的正体素的相对值。要可视化倍数增加，请将每个细胞的 p-RIPK3 （S227）+ 或 p-MLKL （S358）+ 体素的相对值除以未处理条件（模拟）的中位数。
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Representative Results
人体细胞中MLKL磷酸化，尤其是RIPK3磷酸化的免疫荧光检测在技术上具有挑战性26。我们在这里提出了一种改进的ZBP1激活后人p-RIPK3（S227）和p-MLKL（S358）染色方案。该协议包括一个TSA步骤，以提高荧光信号的检测限和灵敏度。为了验证该方法，对TSA介导的免疫荧光与p-RIPK3（S227）和p-MLKL（S358）的标准间接荧光染色进行了并排比较。
用ICP6 RHIM突变型HSV-1菌株（HSV-1 ICP6mutRHIM）感染表达人ZBP1的HT-29细胞9小时，以诱导ZBP1介导的坏死性凋亡和RIPK3磷酸化。HSV-1 ICP6mutRHIM 菌株在 ICP6 RHIM 内携带 VQCG 至 AAAA 突变，无法阻断 ZBP114，15 下游的坏死性凋亡信号。如先前报道的26所示，标准间接免疫荧光的灵敏度不足以用当前市售的抗体可视化RIPK3 S227磷酸化，即使共聚焦显微镜的激光功率增加到30%（图2A）。相比之下，包含TSA步骤能够可靠地检测感染HSV-1 ICP6mutRHIM的细胞胞质中的p-RIPK3（S227）。当激光功率设置为2%时，p-RIPK3（S227）信号达到饱和（图2A）。三维z-stack图像的定量（参见步骤9）显示，在模拟处理的细胞上，HSV-1 ICP6mutRHIM感染的p-RIPK3（S227）阳性的体素数量增加了约20倍（图2B）。从TSA介导的染色方案中省略一抗p-RIPK3（S227）抗体作为无原发性（NP）对照不会产生可检测的信号。为了可视化HSV-1 ICP6mutRHIM感染的细胞，将样品与针对直接早期病毒蛋白ICP0的一抗共染色（图2A）。模拟处理的细胞中存在低但可检测到的p-RIPK3（S227）信号，这可能代表该位点5中人RIPK3的组成型自磷酸化（见讨论）。与之前的报告28 一致，ICP6 的 RHIM 无法完全阻断 RIPK3 S227 磷酸化，因为我们检测到感染野生型 HSV-1 （HSV-1WT;图 2A，B）。为了进一步验证p-RIPK3（S227）信号的特异性，在感染前用RIPK3激酶抑制剂GSK'840处理细胞。GSK'840与RIPK3的激酶结构域结合，阻止其活性，从而抑制其自磷酸化29。GSK'840在ZBP1激活时阻止了S227处的RIPK3磷酸化（图2A，B），证实了TSA介导的p-RIPK3（S227）检测方法的特异性。
为了跟踪MLKL磷酸化（坏死性凋亡的终末期标志物），表达ZBP1的HT-29细胞感染HSV-1 ICP6mutRHIM8小时和10小时。使用TSA对细胞进行针对S358磷酸化MLKL（p-MLKL [S358]）的抗体染色。模拟处理的细胞显示出p-MLKL（S358）的低且有点点状的胞质染色，而在细胞质，细胞核中检测到强烈的p-MLKL染色。以及感染HSV-1 ICP6mutRHIM的细胞中的质膜（图3A）。此外，在簇中观察到p-MLKL（S358）信号。这与细胞膜上活化的磷酸化MLKL低聚物的造孔功能及其最近报道的甲型流感感染1，2，6，30的核易位一致。作为阳性p-MLKL（S358）染色对照，我们用TNF，SMAC模拟BV6和泛半胱天冬酶抑制剂zVAD-fmk的组合刺激表达ZBP1的HT-29细胞以诱导TNFR1介导的坏死性凋亡（图3A）。从TSA介导的染色方案中省略一抗p-MLKL（S358）抗体作为无一级对照不会产生可检测的信号。
接下来，我们对有和没有TSA的p-MLKL（S358）免疫荧光染色进行了并排比较。表达ZBP1的HT-29细胞用HSV-1 ICP6mutRHIM感染9 h。虽然使用标准间接免疫荧光检测感染细胞中的特定p-MLKL（S358）信号需要40%的激光功率，但TSA处理的样品已经达到了6%激光功率的饱和信号，而不会增加模拟处理样品的背景染色（图3B）。此外，三维z-stack图像的定量显示，与标准间接免疫荧光相比，使用TSA时p-MLKL（S358）阳性的体素数量增加了10倍以上。这表明TSA提高了p-MLKL的检测阈值和灵敏度（S358; 图 3C）。
最后，为了验证TSA介导的免疫荧光方案对其他ZBP1依赖性坏死性凋亡病毒刺激，我们用甲型流感病毒（IAV）PR8菌株感染表达ZBP1的HT-29细胞9小时。事实上，TSA允许对p-RIPK3（S227）和p-MLKL（S358）进行稳健的检测，表明这些细胞正在经历坏死性凋亡（图4A-D）。
图 1：TSA 协议的示意图。 细胞在孔板中接种和刺激，与高端显微镜兼容。之后，将样品固定在4%PFA中，透化并封闭以防止一抗的特异性结合。为了可视化磷酸化的RIPK3（p-RIPK3 [S227]）和MLKL（p-MLKL [S358]），识别这些关键磷酸化位点的特异性抗体在成像室中孵育过夜。接下来，加入与马萝卜过氧化物酶（HRP）偶联的二抗。该HRP基团能够在H2O2存在下激活生物素化酪胺。随后，活性生物素-酪胺与酪氨酸残基共价偶联，靠近HRP标记的二抗。这些包括感兴趣的蛋白质上的酪氨酸 - 在这种情况下是p-RIPK3或p-MLKL，如图所示 - 以及相邻蛋白质以及一抗和二抗本身的酪氨酸（未显示）。该酪胺信号放大步骤大大提高了染色方案的灵敏度。在最后一步中，加入与荧光基团偶联的链霉亲和素以可视化生物素化分子。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：HSV-1 ICP6mutRHIM 在 S227 处诱导人 RIPK3 的 ZBP1 依赖性磷酸化。 （A）表达ZBP1的人HT-29细胞的代表性共聚焦图像，将TSA染色与p-RIPK3（S227）的标准间接（无TSA）免疫荧光染色方案进行比较。将模拟和病毒感染的样品（HSV-1WT或HSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5]）孵育9小时。作为阴性对照，包括RIPK3激酶抑制剂GSK'840（1μM）。包括感染HSV-1 ICP6mutRHIM（MOI = 5）的细胞的无一期（NP）染色对照9小时，其中省略了主要的抗p-RIPK3（S227）和ICP0抗体。检测特定p-RIPK3（S227）信号所需的激光功率显示在图像上。ICP0用于染色病毒感染的细胞，DAPI用于染色细胞核。比例尺为10μm。 （B）使用TSA染色方案对p-RIPK3（S227）+体素进行相对定量。每个点代表一个图像，红色条代表中位数。体素计数值相对于模拟条件下图像的体素计数中位数呈现。统计是使用单因素方差分析完成的，并使用Tukey校正进行多重比较。> 0.05 （净值）， ≤ 0.05 （*）， ≤ 0.01 （**）.请点击此处查看此图的大图。
图 3：HSV-1 ICP6mutRHIM 在 S358 处诱导人 MLKL 的 ZBP1 依赖性磷酸化。 （A）表达ZBP1的人HT-29细胞的代表性共聚焦图像。将细胞模拟处理或感染HSV-1 ICP6mutRHIM（MOI = 5）8小时和10小时。ICP0用于染色病毒感染的细胞，DAPI用于染色细胞核。显示了用HSV-1 ICP6mutRHIM（MOI = 5）感染10小时的细胞的无原发性（NP）染色对照，其中省略了主要的抗p-MLKL（S358）。作为阳性对照，用30ng / mL TNF，5μM BV6和20μM ZVAD-fmk刺激细胞4小时，通过TNFR1诱导坏死性凋亡。比例尺为10μm。 （B）表达ZBP1的人HT-29细胞的代表性共聚焦图像，将TSA染色与p-MLKL（S358）的标准间接（无TSA）免疫荧光染色方案进行比较。将细胞模拟处理或感染HSV-1 ICP6mutRHIM（MOI = 5）9小时。包括感染HSV-1 ICP6mutRHIM（MOI = 5）的细胞9小时的NP染色对照，其中省略了主要的抗p-MLKL（S358）和ICP0抗体。检测特定p-MLKL（S358）信号所需的激光功率显示在图像上。（C）使用标准（无TSA）和TSA染色方案对p-MLKL（S358）+体素进行相对定量。每个点代表一个图像，红色条代表中位数。体素计数值相对于模拟条件下图像的体素计数中位数显示。统计是使用单因素方差分析完成的，并使用Tukey校正进行多重比较。 P > 0.05 （NS），P ≤ 0.0001 （****）。请点击此处查看此图的大图。
图4：甲型流感病毒诱导人RIPK3和MLKL的ZBP1依赖性磷酸化。 （A，C）表达HT-29的人ZBP1细胞的代表性共聚焦图像。将细胞模拟处理或感染甲型流感病毒（IAV），PR8株（MOI = 4）9小时，并染色p-RIPK3（S227;A）或p-MLKL（S358;C） 使用 TSA 协议。比例尺为10μm。 （B，D）p-RIPK3（S227）+ （B）或p-MLKL（S358;D） 体素。（B，D）中的每个点代表一个图像，红色条代表中位数。体素计数值相对于模拟条件下图像的体素计数中位数显示。统计是使用曼-惠特尼检验完成的。P≤ 0.05 （*）， P ≤ 0.01 （**）。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该免疫荧光染色方案描述了使用酪胺信号扩增（TSA）来提高难以检测的人类坏死性凋亡信号通路信号事件的灵敏度，包括RIPK3和MLKL26的磷酸化。TSA步骤的加入显著提高了p-RIPK3（S227）和p-MLKL（S358）的检测阈值，并提高了p-MLKL（S358）应变的灵敏度。TSA显示模拟处理的样品中已经存在p-RIPK3（S227）信号。在人细胞中，RIPK3在S227处的自磷酸化是通过与MLKL稳定相互作用来激活坏死性凋亡的先决条件。这个过程已经发生在基础水平，并导致在坏死性凋亡诱导之前形成稳定的无活性p-RIPK3（S227）/MLKL二聚体2，5，31。同样，本研究中使用的抗p-RIPK3抗体也通过蛋白质印迹26检测未处理细胞中的p-RIPK3（S227）。
在T357和S358处的激活环内，RIPK3对MLKL的磷酸化导致无活性的p-RIPK3（S227）/MLKL复合物解离并诱导构象变化，其中MLKL暴露其N末端四螺旋束结构域。活化的p-MLKL然后寡聚并运输到细胞膜，在那里它将其四个螺旋束插入脂质双层中，导致细胞裂解1，2，6。使用这种TSA免疫荧光方案，我们检测到在ZBP1诱导的坏死性凋亡期间S358 MLKL磷酸化强烈增加。p-MLKL（S358）聚集在细胞质内和质膜上，并且在ZBP1激活时也在细胞核内发现。事实上，据报道，ZBP1 在 IAV 感染的背景下刺激 MLKL 介导的核膜扰动8，30。然而，应该注意的是，TSA不仅在目标抗原和一抗/二抗上沉积生物素-酪胺，而且还在邻近的蛋白质上沉积生物素-酪胺。因此，TSA不适合推断有关检测到的蛋白质的精确亚细胞定位的信息，我们不建议将TSA用于共定位研究。
反复的冻融循环会影响生物素化酪胺的稳定性。为防止信号灵敏度下降，我们建议将酪胺等分，并在每次实验中使用新鲜的等分试样。应谨慎对待生物素-酪胺储备液的批次间差异。如果生物素-酪胺的最终浓度过高，TSA扩增的非特异性背景将掩盖特定信号。为了控制这一点，我们建议滴定每批新的生物素-酪胺，并包括无一期染色对照，其中省略了一抗。
在所提出的协议中，TSA仅限于一个目标。磷酸化RIPK3和MLKL的检测未在同一染色中合并，因为两种一抗在同一物种中产生。该方案可以适用于使用多重免疫荧光TSA32，33检测同一样品中的多个TSA扩增信号（例如，p-RIPK3 [S227]和p-MLKL [S358]）。最后，用于免疫荧光显微镜的TSA介导扩增可用于识别其他信号通路的生物标志物，这些信号通路的信噪比较差。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢VIB生物成像核心的培训，支持和进入仪器园区。J.N.得到了法兰德斯研究基金会（FWO）的博士奖学金支持。J.M.小组的研究得到了奥德修斯II资助（G0H8618N），EOS INFLADIS（40007512），法兰德斯研究基金会（FWO）的初级研究资助（G031022N），CRIG青年研究者概念验证资助和根特大学的支持。P.V.组的研究得到了EOS MODEL-IDI（30826052），EOS INFLADIS（40007512），FWO高级研究资助（G.0C76.18N，G.0B71.18N，G.0B96.20N，G.0A9322N），Methusalem（BOF16 / MET_V / 007），iBOF20 / IBF / 039 ATLANTIS，抗癌基金会（F / 2016 / 865，F / 2020 / 1505），CRIG和GIGG联盟以及VIB的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | - | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
- Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
- Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
- Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
- Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
- Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
- Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
- Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
- Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
- Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
- Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
- Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
- Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
- Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
- Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
- Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
- de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
- Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
- Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
- Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
- Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
- Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
- Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
- Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
- Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
- De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
- Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
- Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
- Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
- Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).
