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Immunology and Infection

मानव कोशिकाओं में एचएसवी -1 संक्रमण के बाद आरआईपीके 3 और एमएलकेएल के जेडबीपी 1-निर्भर फॉस्फोराइलेशन के इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के लिए टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन

Published: October 20, 2022 doi: 10.3791/64332
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

Summary

इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के दौरान टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन एचएसवी -1 संक्रमण के बाद जेडबीपी 1-प्रेरित नेक्रोप्टोसिस के दौरान फॉस्फोराइलेटेड आरआईपीके 3 और एमएलकेएल का संवेदनशील पता लगाने में सक्षम बनाता है।

Abstract

थ्रेओनिन प्रोटीन काइनेज 3 (आरआईपीके 3) और इसके सब्सट्रेट मिश्रित वंश किनेज डोमेन-जैसे (एमएलकेएल) नेक्रोप्टोसिस के महत्वपूर्ण नियामक हैं, जो महत्वपूर्ण एंटीवायरल कार्यों के साथ कोशिका मृत्यु का एक भड़काऊ रूप है। RIPK3 का ऑटोफॉस्फोराइलेशन नेक्रोप्टोसिस एमएलकेएल के छिद्र बनाने वाले निष्पादनकर्ता प्रोटीन के फॉस्फोराइलेशन और सक्रियण को प्रेरित करता है। कोशिका झिल्ली पर फॉस्फोराइलेटेड एमएलकेएल की तस्करी और ऑलिगोमेराइजेशन के परिणामस्वरूप सेल लाइसिस होता है, जो नेक्रोप्टोटिक सेल मृत्यु की विशेषता है। न्यूक्लिक एसिड सेंसर जेडबीपी 1 आरएनए और डीएनए वायरस के संक्रमण के बाद बाएं हाथ के जेड-फॉर्म डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (जेड-आरएनए) से जुड़कर सक्रिय होता है। जेडबीपी 1 सक्रियण संक्रमित मेजबान कोशिकाओं के नेक्रोप्टोसिस सहित विनियमित कोशिका मृत्यु को प्रेरित करके वायरस संक्रमण को प्रतिबंधित करता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रति-सेल आधार पर जेडबीपी 1-मध्यस्थता नेक्रोप्टोसिस के डाउनस्ट्रीम विभिन्न सिग्नलिंग चरणों के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है। हालांकि, मानक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की संवेदनशीलता, मानव RIPK3 और MLKL के खिलाफ वर्तमान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके, इन मार्करों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इमेजिंग को रोकती है। यहां, हम हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस 1 (एचएसवी -1) से संक्रमित मानव एचटी -29 कोशिकाओं में सेरीन (एस) फॉस्फोराइलेटेड आरआईपीके 3 (एस 227) और एमएलकेएल (एस 358) के लिए एक अनुकूलित धुंधला प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग प्रोटोकॉल में टायरामाइड सिग्नल एम्प्लीफिकेशन (टीएसए) चरण को शामिल करने से एस 227 फॉस्फोराइलेटेड आरआईपीके 3 का विशिष्ट पता लगाने की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, टीएसए एस 358 फॉस्फोराइलेटेड एमएलकेएल का पता लगाने की संवेदनशीलता को बहुत बढ़ाता है। साथ में, यह विधि जेडबीपी 1-प्रेरित नेक्रोप्टोसिस के प्रेरण के दौरान इन दो महत्वपूर्ण सिग्नलिंग घटनाओं के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाती है।

Introduction

थ्रेओनिन प्रोटीन काइनेज 3 (आरआईपीके 3) और मिश्रित वंश किनेज डोमेन-जैसे (एमएलकेएल) नेक्रोप्टोटिक सेल डेथ 1,2 के केंद्रीय नियामक हैं। नेक्रोप्टोसिस एंटीवायरल प्रतिरक्षा और ऑटोइन्फ्लेमेशन में शामिल विनियमित कोशिका मृत्यु का एक लिटिक और भड़काऊ रूप है। वायरस से संक्रमित कोशिकाओं का नेक्रोप्टोसिस तुरंत वायरस प्रतिकृति को बंद कर देता है। नेक्रोप्टोसिस प्रेरण के बाद सेल लाइसिस भी क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न जारी करता है, जो एंटीवायरल प्रतिरक्षा 3,4 को उत्तेजित करता है। नेक्रोप्टोसिस की शुरुआत आरआईपी होमोटाइपिक इंटरैक्शन मोटिफ (आरएचआईएम) के सक्रियण से होती है: आरआईपीके 1 (टीएनएफ रिसेप्टर 1 [टीएनएफआर 1] जुड़ाव पर), टीआईआर-डोमेन-युक्त एडाप्टर-उत्प्रेरण इंटरफेरॉन-β (टीआरआईएफ; टोल-जैसे रिसेप्टर 3 और 4 जुड़ाव पर), या एंटीवायरल न्यूक्लिक एसिड सेंसर जेड-डीएनए बाइंडिंग प्रोटीन 1 (जेडबीपी 1)1,2 . नेक्रोप्टोसिस सिग्नलिंग आरआईपीके 3 के ऑटोफॉस्फोराइलेशन से शुरू होने वाली फॉस्फोराइलेशन घटनाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से आगे बढ़ता है। अपने किनेज डोमेन के अंदर सेरीन (एस) 227 पर मानव RIPK3 का ऑटोफॉस्फोराइलेशन एमएलकेएल के साथ बातचीत को सक्षम करके नेक्रोप्टोसिस के लिए एक शर्त है और आमतौर पर मानव RIPK3 सक्रियण और नेक्रोप्टोटिक सेल मृत्यु 1,5 के लिए जैव रासायनिक मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है। एक बार सक्रिय होने के बाद, RIPK3 थ्रेओनिन (T)357 और S358 1 पर MLKL के सक्रियण लूप को फॉस्फोराइलेट करताहै। यह एमएलकेएल रचना में बदलाव का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप एन-टर्मिनल चार हेलिक्स बंडल डोमेन का जोखिम होता है। एमएलकेएल तब ओलिगोमेराइज्ड होता है और कोशिका झिल्ली में यातायात करता है जहां यह लिपिड बाइलेयर में उजागर चार हेलिक्स बंडलों के सम्मिलन के माध्यम से एक छिद्र बनाता है, जिससे अंततः कोशिका मृत्यु 2,6 हो जाती है।

जेडबीपी 1 एक एंटीवायरल न्यूक्लिक एसिड सेंसर है जो जेड-अनुरूपता (जेड-आरएनए) में डबल-फंसे आरएनए सहित बाएं हाथ के जेड-फॉर्म न्यूक्लिक एसिड को पहचानता है। जेड-आरएनए बाइंडिंग जेडबीपी 1 के एन-टर्मिनस पर स्थित दो जेड-डोमेन के माध्यम से होता है। आरएनए और डीएनए वायरस संक्रमण के दौरान जमा होने वाले जेड-आरएनए को सीधे जेडबीपी 1 7,8 से जोड़ने के लिए माना जाता है। सक्रिय जेडबीपी 1 अपने केंद्रीय आरएचआईएम के माध्यम से RIPK3 की भर्ती करता है और नेक्रोप्टोसिस 9,10 सहित विनियमित कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है। वायरस ने जेडबीपी 1-प्रेरित मेजबान सेल नेक्रोप्टोसिस 11 का मुकाबला करने के लिए कई पलायन तंत्र अपनाए हैं। उदाहरण के लिए, हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस 1 (एचएसवी -1) राइबोन्यूक्लियोटाइड रिडक्टेस सबयूनिट 1, जिसे आईसीपी 6 के रूप में जाना जाता है और यूएल 39 द्वारा एन्कोड किया गया है, अपने एन-टर्मिनस पर आरएचआईएम को परेशान करता है जो मानव कोशिकाओं में जेडबीपी 1-मध्यस्थता आरआईपीके 3 सक्रियण में हस्तक्षेप करता है। जेडबीपी 1 न केवल वायरल प्रतिकृति को प्रतिबंधित करता है, बल्कि माउस अध्ययनों से पता चला है कि जेडबीपी 1 सक्रियण सूजन संबंधी बीमारियों का कारण बनता है और कैंसर प्रतिरक्षा 16,17,18,19,20,21 को उत्तेजित करता है। प्रोटोकॉल जो मानव कोशिकाओं में जेडबीपी 1-प्रेरित नेक्रोप्टोसिस के दौरान होने वाली सिग्नलिंग घटनाओं का पता लगाते हैं, इसलिए, इन प्रक्रियाओं में जेडबीपी 1 की भूमिका का आकलन करने के लिए मूल्यवान हैं।

टायरामाइड सिग्नल एम्प्लीफिकेशन (टीएसए), जिसे उत्प्रेरित रिपोर्टर जमाव (सीएआरडी) भी कहा जाता है, को एंटीबॉडी-आधारित इम्यूनोएसे में पहचान और सिग्नल-टू-शोर अनुपात की सीमा में सुधार करने के लिए विकसित किया गया है। टीएसए के दौरान, किसी भी प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग रुचि के एंटीजन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी), एक द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ मिलकर, हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उपस्थिति में बायोटिनाइलेटेड टायरामाइड कणों के स्थानीय निर्माण को उत्प्रेरित करता है। ये सक्रिय बायोटिन-टायरामाइड कण तब सहसंयोजक बंधन बनाने के लिए समीपस्थ टायरोसिन अवशेषों के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। संभावित टायरामाइड-बायोटिन सब्सट्रेट्स में एंटीजन, प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी और पड़ोसी प्रोटीन शामिल हैं। इस प्रकार, जबकि टीएसए परख की संवेदनशीलता में काफी सुधार करता है, इसके कुछ स्थानिक संकल्प खो जाते हैं। अंतिम चरण में, बायोटिन अणुओं को फ्लोरोसेंटली लेबल स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग करके पता लगाया जाता है। एचआरपी प्रतिक्रिया ब्याज के एंटीजन पर या उसके पास कई टायरामाइड-बायोटिन अणुओं को जमा करती है। यह स्ट्रेप्टाविडिन-फ्लोरोक्रोम बाइंडिंग साइटों की संख्या को बहुत बढ़ाता है, जिससे परख की संवेदनशीलता में काफी वृद्धि होती है (चित्रा 1)। वैकल्पिक रूप से, टायरामाइड को सीधे फ्लोरोक्रोम के साथ जोड़ा जा सकता है, जिससे स्ट्रेप्टाविडिन-युग्मित फ्लोरोफोरे की आवश्यकता समाप्त हो जाती है। सीटू संकरण में प्रोटीन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और डीएनए / आरएनए पहले तरीकों में से थे, जिससे टीएसए को सिग्नल तीव्रता22,23 में सुधार के लिए नियोजित किया गया था। हाल ही में, टीएसए को इंट्रासेल्युलर फ्लो साइटोमेट्री24 और मास स्पेक्ट्रोमेट्री25 के साथ जोड़ा गया है।

यहां, हम इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एचएसवी -1 संक्रमण द्वारा जेडबीपी 1 के सक्रियण पर सेरीन 227 फॉस्फोराइलेटेड मानव RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) और फॉस्फोराइलेटेड मानव MLKL (p-MLKL [S358]) का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम एक नेक्रोप्टोसिस-संवेदनशील एचटी -29 मानव कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन का उपयोग करते हैं जिसे मानव जेडबीपी 1 को स्थिर रूप से व्यक्त करने के लिए ट्रांसड्यूस किया गया था। इन कोशिकाओं को एक उत्परिवर्ती आईसीपी 6 प्रोटीन (एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम) को व्यक्त करने वाले एचएसवी -1 तनाव से संक्रमित किया गया था, जिसमें वायरल आरएचआईएम (वीक्यूसीजी) के भीतर चार कोर अमीनो एसिड को एलानिन (एएएए) द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था, जिससे आईसीपी 6 जेडबीपी 1-मध्यस्थता नेक्रोप्टोसिस 13,14,15 को अवरुद्ध करने में असमर्थ हो गया था। इम्यूनोस्टेनिंग26 में पी-आरआईपीके 3 और पी-एमएलकेएल के खिलाफ निर्देशित वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात की समस्या को दूर करने के लिए, हम एक टायरामाइड सिग्नल एम्प्लीफिकेशन (टीएसए) चरण (चित्रा 1) करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप मानव पी-आरआईपीके 3 (एस 227) का मजबूत पता लगाया जाता है और परिमाण के क्रम से मानव पी-एमएलकेएल (एस 358) की पहचान संवेदनशीलता में सुधार होता है।

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Protocol

1. बायोटिनाइलेटेड टायरामाइड की तैयारी

  1. बायोटिन-टायरामाइड से शुरू होने वाले बायोटिनिलेटेड टायरामाइड तैयार करें। 10 एमएम स्टॉक समाधान बनाने के लिए, डीएमएसओ के 1 एमएल में 3.6 मिलीग्राम बायोटिन-टायरामाइड घोलें। गुणवत्ता को संरक्षित करने के लिए घुलित उत्पाद को -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट में स्टोर करें।

2. संस्कृति में एचटी -29 कोशिकाओं को बनाए रखना

नोट: ZBP1-व्यक्त एचटी -29 मानव ZBP1 को एन्कोडिंग करने वाले लेंटिवेक्टर27 के साथ पारगमन द्वारा उत्पन्न किया गया था।

  1. मैककॉय के 5 ए माध्यम में जेडबीपी 1-व्यक्त एचटी -29 कोशिकाओं को एल-ग्लूटामाइन, सोडियम-पाइरूवेट और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (अब से पूर्ण माध्यम के रूप में संदर्भित) के साथ पूरक रखें और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में बनाए रखें। आदर्श रूप से, कम मार्ग संख्या (10 से कम) की कोशिकाओं का उपयोग करें। प्रयोग की शुरुआत से पहले पिघलने के चक्र के बाद कोशिकाओं को कम से कम 5 दिनों के लिए ठीक होने के लिए छोड़ दें।
  2. कल्चर फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करने के लिए, माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को 5 एमएल पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट) के साथ धोएं। इसके बाद, कोशिकाओं में ट्रिप्सिन / ईडीटीए (क्रमशः 0.05% ट्रिप्सिन और 0.032% ईडीटीए) की उचित मात्रा जोड़ें ( टी 75 फ्लास्क के लिए 2 एमएल, टी 175 फ्लास्क के लिए 3 एमएल)।
  3. 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में 10 मिनट तक ट्रिप्सिन / ईडीटीए के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। बाद में, फ्लास्क टैप करें और नेत्रहीन रूप से जांचें कि क्या कोशिकाएं 4x-20x उद्देश्य आवर्धन के साथ माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लास्क से अलग हो गई हैं।
  4. यदि कोशिकाएं पूरी तरह से अलग नहीं हैं, तो 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। जब कोशिकाएं अलग हो जाती हैं, तो फ्लास्क में 6 एमएल पूर्ण माध्यम जोड़कर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को रोकें।
  5. सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए ट्रिपैन नीले दाग का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें; 1: 5 कमजोर पड़ने की सिफारिश की जाती है। केवल प्रयोग के साथ आगे बढ़ें यदि कोशिकाओं की व्यवहार्यता 90% से अधिक हो।

3. प्रयोग शुरू करना, बीजारोपण, और कोशिकाओं की उत्तेजना

  1. बीज 90,000 जेडबीपी 1-व्यक्त एचटी -29 कोशिकाओं को पूर्ण माध्यम में 1 सेमी² सतह क्षेत्र अच्छी तरह से प्लेट में व्यक्त करता है जो उच्च अंत माइक्रोस्कोपी की अनुमति देता है। प्रति अच्छी तरह से 200 μL की अंतिम मात्रा का उपयोग करें।
  2. कोशिकाओं को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। ध्यान रखें कि धुंधला नियंत्रण के लिए कुछ अतिरिक्त कुओं को बीज देने की आवश्यकता होती है, जिसे चरण 5.6 में अधिक विस्तार से समझाया गया है।
  3. जब कोशिकाएं 70% -80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो कोशिकाओं में एक नेक्रोप्टोसिस-उत्प्रेरण उत्तेजना जोड़ें। यहां, कोशिकाओं को एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम (5 के संक्रमण की बहुलता [एमओआई], कोशिकाओं की संख्या से विभाजित पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) के रूप में परिभाषित किया गया था; पीएफयू को वेरो कोशिकाओं पर एक पट्टिका परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था) 6 घंटे, 8 घंटे या 10 घंटे के लिए।
  4. नेक्रोप्टोसिस प्रेरण के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 30 एनजी / एमएल टीएनएफ युक्त नेक्रोप्टोसिस-उत्प्रेरण कॉकटेल के साथ 4 घंटे के लिए कोशिकाओं को उत्तेजित करें, पैन-कैस्पेज़ अवरोधक जेडवीएडी-एफएमके के 20 μM, और एसएमएसी मिमेटिक बीवी 6 के 5 μM।
  5. पी-आरआईपीके 3 (एस 227) धुंधला होने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, आरआईपीके 3 किनेज गतिविधि को रोकने और एस 227 के ऑटोफॉस्फोराइलेशन को रोकने के लिए जीएसके '840 (1 एसएम) शामिल करें। आदर्श रूप से, एक अनुपचारित स्थिति में और नेक्रोप्टोसिस उत्तेजना के बाद अवरोधक जोड़ें। अवरोधक को वायरल संक्रमण के साथ एक साथ जोड़ा जा सकता है।
  6. उत्तेजनाओं को पूर्ण माध्यम में तैयार करें, 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। सभी उत्तेजनाओं के लिए प्रति अच्छी तरह से 200 μL की अंतिम मात्रा का उपयोग करें।

4. कोशिकाओं को ठीक करना

  1. माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को 1x PBS के 200 μL के साथ धो लें। फिर, कोशिकाओं में 4% पीएफए (पहले से ही कमरे के तापमान पर समतुल्य) का 150 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि आप उन कक्षों का उपयोग कर रहे हैं जो आसानी से अलग हो जाते हैं, तो कक्षों के निर्धारण को निम्नानुसार अनुकूलित किया जा सकता है। कुएं से 100 μL माध्यम निकालें, ताकि प्लेट पर 100 μL की मात्रा बनी रहे। कोशिकाओं में 4% पीएफए का 100 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, कुओं से मध्यम/फिक्सेटिव को हटा दें और 4% पीएफए के 150 μL के साथ प्रतिस्थापित करें। कोशिकाओं के पूर्ण निर्धारण को सुनिश्चित करने के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को एक और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. निर्धारण के बाद, 4% पीएफए को हटा दें और कोशिकाओं को 1x PBS के 200 μL के साथ 3x धो लें। नमूने को आगे की प्रक्रिया तक रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x PBS के अतिरिक्त (>200 μL) में संग्रहीत किया जा सकता है।

5. परमेबिलाइजेशन और प्राथमिक धुंधलापन

  1. पीबीएस को हटा दें और परमेबिलाइजेशन बफर के 100 μL जोड़ें (पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स -100)। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  2. परमेबिलाइजेशन बफर को हटा दें और बाद में, 100 μL वॉश बफर (पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100) के साथ कुओं को धोएं। इमेजिंग कक्ष को एक झुकाव प्रयोगशाला शेकर (प्रति मिनट 20-30 रॉकिंग गतियां) पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए वॉश बफर के साथ इनक्यूबेट करें।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए, अवरुद्ध माध्यम के 100 μL जोड़ें और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक रूप से, इस ब्लॉकिंग चरण को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 3% बीएसए, 0.1% ट्राइटन-एक्स -100 के साथ अवरुद्ध करके प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  4. कुओं को 100 μL वॉश बफर (PBS में 0.1% Triton X-100) के साथ 3x धोएं। एक झुकने वाली प्रयोगशाला शेकर पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए धोने के चरणों को इनक्यूबेट करें।
  5. वॉश बफर को हटाने के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी को इमेजिंग कक्ष में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। कुएं को कवर करने के लिए 100 μL की अंतिम मात्रा का उपयोग करें। रात भर इनक्यूबेशन 4 डिग्री सेल्सियस पर, इमेजिंग कक्ष को झुकाव प्रयोगशाला शेकर पर न रखें।
    नोट: एंटी पी-एमएलकेएल (एस 358; कमजोर पड़ना: 1: 200) और एंटी-पी-आरआईपीके 3 (एस 227; कमजोर पड़ना: 1: 200) खरगोश को एक मेजबान प्रजाति के रूप में साझा करते हैं और इसलिए, इसे एक कुएं में संयुक्त नहीं किया जाना चाहिए। वायरल संक्रमण की निगरानी के लिए, पी-एमएलकेएल (एस 358) या पी-आरआईपीके 3 (एस 227) के साथ पसंद के वायरल प्रोटीन के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी को मिलाएं। यहां, कोशिकाओं को एचएसवी -1 संक्रमण से संक्रमित किया गया था, जिसके बाद आईसीपी 0 धुंधला (कमजोर पड़ना: 1: 50, मेजबान प्रजाति: माउस)।
  6. इस बिंदु पर आवश्यक धुंधला नियंत्रण को ध्यान में रखें। मास्किंग सीमा निर्धारित करने के लिए टीएसए प्रवर्धन चरण की संभावित पृष्ठभूमि की कल्पना करने के लिए हमेशा कोई प्राथमिक एंटीबॉडी स्थिति शामिल न करें (चरण 9 देखें)।
    नोट: सह-धुंधला प्रोटोकॉल के मामले में (उदाहरण के लिए, पी-एमएलकेएल [एस 358] या पी-आरआईपीके 3 [एस 227] को वायरल प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जोड़ना) एकल दाग का भी उपयोग करें। अन्य इमेजिंग चैनलों में संभावित रक्तस्राव-माध्यम सिग्नल के लिए एकल दाग का उपयोग महत्वपूर्ण है।

6. टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए)

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण को हटा दें और वॉश बफर के 100 μL (पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100) के साथ कुएं को 3 गुना धोएं। एक झुकने वाली प्रयोगशाला शेकर पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए धोने के चरणों को इनक्यूबेट करें।
  2. वॉश बफर को हटा दें और प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों को पहचानने के लिए एचआरपी-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी के 100 μL जोड़ें जिन्हें प्रवर्धित करने की आवश्यकता है। पी-आरआईपीके 3 (एस 227) या पी-एमएलकेएल (एस 358) सिग्नल को बढ़ाने के लिए, एंटी-खरगोश-एचआरपी के 100 μL जोड़ें और एक झुकाव प्रयोगशाला शेकर पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: केवल p-MLKL (S358) या p-RIPK3 (S227) प्रवर्धित किया जाएगा। एक वायरल प्रोटीन के धुंधलापन को एक मानक अप्रत्यक्ष धुंधला विधि का उपयोग करके कल्पना की जाएगी।
  3. बाद में, कुओं को 100 μL वॉश बफर (पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100) के साथ 3x धो लें। एक झुकने वाली प्रयोगशाला शेकर पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए धोने के चरणों को इनक्यूबेट करें।
  4. अगले चरणों में, सूक्ष्म प्लेट में बायोटिनाइलेटेड टायरामाइड जोड़ें। द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ युग्मित एचआरपी-समूह का उपयोग करके, एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया प्राथमिक लक्ष्य के करीब निकटता में टायरामाइड कणों के गठन को ट्रिगर करेगी (यहां, पी-एमएलकेएल [एस 358] या पी-आरआईपीके 3 [एस 227])।
  5. एचआरपी की एंजाइमेटिक गतिविधि को सक्रिय करने के लिए, बायोटिनिलेटेड टायरामाइड के साथ एक ऑक्सीकरण सब्सट्रेट जोड़ें। इसे प्राप्त करने के लिए, टीएसए बफर (0.1 एम बोरिक एसिड [पीएच 8.5]) को 0.03 एम एच 2ओ 2के साथ पूरक करें; विशेष रूप से, टीएसए बफर के 5 एमएल लें और 30% एच 2ओ 2के 5 μL जोड़ें।
  6. अब, एच 2ओ 2-पूरकटीएसए बफर में बायोटिन-टायरामाइड को 1: 1,000 से 1: 20,000 तक पतला करें।
    नोट: बायोटिन-टायरामाइड के कमजोर पड़ने वाले कारक को प्रति बैच अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
  7. कुओं से वॉश बफर को हटा दें और 100 μL की अंतिम मात्रा में कुओं में पतला बायोटिन-टायरामाइड जोड़ें।
  8. इसके बाद, कुओं को 100 μL वॉश बफर (PBS में 0.1% Triton X-100) के साथ 3x धोएं। एक झुकने वाली प्रयोगशाला शेकर पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए धोने के चरणों को इनक्यूबेट करें।

7. फ्लोरोफोरेस

नोट: चूंकि प्राथमिक एंटीबॉडी के संकेत को बायोटिन-समूह में परिवर्तित किया जाता है, इसलिए पी-एमएलकेएल (एस 358) और पी-आरआईपीके 3 (एस 227) को फ्लोरोफोरे (फ्लोरोफोरे 568, कमजोर पड़ने: 1: 500) के साथ युग्मित स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग करके देखा जाता है। इसके अतिरिक्त, नाभिक DAPI (5 μg / mL) से सना हुआ है। यदि एक वायरल प्रोटीन धुंधला प्रोटोकॉल में शामिल है, तो अपने प्राथमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों के खिलाफ एक उपयुक्त फ्लोरोसेंटली लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी शामिल करें। प्रतिनिधि परिणामों में, एक माउस विरोधी ICP0 का उपयोग किया गया था। एक द्वितीयक एंटीबॉडी बकरी एंटी-माउस के रूप में फ्लोरोफोरे 633 (कमजोर पड़ने: 1: 1,000) के साथ युग्मित किया गया था।

  1. ऊपर उल्लिखित एंटीबॉडी और दाग युक्त वॉश बफर (पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100) में धुंधला मिश्रण बनाएं। वॉश बफर को हटा दें, 100 μL धुंधला मिश्रण जोड़ें, और एक झुकाव प्रयोगशाला शेकर पर 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इमेजिंग कक्ष को इस चरण से प्रकाश से परिरक्षित रखें।
  2. इसके बाद, वॉश बफर (पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100) के साथ कुओं को 2 एक्स धोएं। एक झुकने वाली प्रयोगशाला शेकर पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए धोने के चरणों को इनक्यूबेट करें।
  3. अंत में, कुओं को 1x PBS के साथ 2x कुल्ला करें। इमेजिंग तक नमूने को 1x PBS के अतिरिक्त (> 200 μL) में संग्रहीत करें। वैकल्पिक रूप से, धुंधलापन को संरक्षित करने के लिए नमूनों को बढ़ते माध्यम में डुबोएं। इमेजिंग कक्ष अब एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर कल्पना करने के लिए तैयार है।

8. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करइमेजिंग

  1. इमेजिंग से कम से कम 10 मिनट पहले कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और लेजर चालू करें।
  2. संवेदनशीलता के लिए विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें। अधिमानतः, 40x या 63x उद्देश्य आवर्धन का उपयोग करें। इमेजिंग से पहले, उपयुक्त कपास की गेंदों का उपयोग करके लेंस क्लीनर के साथ विसर्जन उद्देश्यों को साफ करें। गंदे उद्देश्यों (जैसे, धूल के कारण) के परिणामस्वरूप कम गुणवत्ता वाली छवियां हो सकती हैं।
  3. इमेजिंग कक्ष के तल पर अतिरिक्त मात्रा में तेल डालें। इसके अतिरिक्त, पसंद के उद्देश्य पर तेल की एक बूंद जोड़ें।
  4. माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग कक्ष रखें। DAPI धुंधला होने या ब्राइटफील्ड इमेजिंग का उपयोग करके फ़ोकस फ़ील्ड खोजें। यदि आवश्यक हो, तो विसर्जन तेल के उचित प्रसार को सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग कक्ष के चारों ओर घूमें।
  5. माइक्रोस्कोप पर आवश्यक इमेजिंग ट्रैक सेट करें। माइक्रोस्कोप के आधार पर, निम्नलिखित चरण भिन्न हो सकते हैं (तालिका 1)।
    नोट: इमेजिंग ट्रैक सेट करते समय, पटरियों को प्रोग्राम करें ताकि परमाणु धुंधलापन अंतिम रूप से मापा जाए। 405 एनएम लेजर फोटोब्लीचिंग में योगदान कर सकता है और इस प्रकार, सभी चैनलों में विशिष्ट सिग्नल का नुकसान हो सकता है।
  6. पी-आरआईपीके 3 (एस 227) या पी-एमएलकेएल (एस 358) की उपस्थिति के लिए एक पूर्ण सेल का विश्लेषण करने के लिए, जेड-स्टैक को मापें जो सेल की ऊंचाई को फैलाते हैं। यहां, जेड-स्टैक्स हर 0.16 μm पर 40 स्लाइस से बने थे, जिसके परिणामस्वरूप 6.22 μm की सीमा थी।

ट्रैक लेजर बीम स्प्लिटर छानना
pRIPK3 (S227) / pMLKL (S358) 561 एमबीएस -405 + BP 570-620 + LP645
एमबीएस 488/561/633 + एसबीएस एसपी 615
वायरल जीन: आईसीपी 0 633 एमबीएस -405 + BP 420-480 + LP605
एमबीएस 488/561/633 + एसबीएस एलपी 570
न्यूक्लियस: DAPI 405 एमबीएस -405 + BP 420-480 + BP 495-550
एमबीएस 488/561/633

तालिका 1: सेल विज़ुअलाइज़ेशन के लिए इमेजिंग ट्रैक।

9. डेटा विश्लेषण और परिमाणीकरण

  1. सॉफ्टवेयर पर सूक्ष्म छवियों को अपलोड करें। 2 डी छवि में जेड-स्टैक की सभी जानकारी की कल्पना करने के लिए विस्तारित फ़ोकस का उपयोग करें।
  2. इसके बाद, निम्नलिखित जानकारी निकालने के लिए विश्लेषण प्रोटोकॉल प्रोग्राम करें: प्रति छवि कोशिकाओं की संख्या, पी-आरआईपीके 3 (एस 227)+ या पी-एमएलकेएल (एस 358) + धुंधला दिखाने वाले वोक्सेल का योग। एक वोक्सेल एक त्रि-आयामी आयतन का प्रतिनिधित्व करता है, जिसे पिक्सेल के त्रि-आयामी समकक्ष के रूप में परिभाषित किया गया है।
  3. प्रति छवि कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, नाभिक को विभाजित करें। विभाजन परिणामों में शोर को कम करने के लिए, विभाजन में एक आकार सीमा जोड़ें (>100 μm33)। खंडित नाभिक की संख्या छवि में कोशिकाओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करती है।
  4. पी-आरआईपीके 3 (एस 227)+ या पी-एमएलकेएल (एस 358) + वोक्सल्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए, एक दहलीज-आधारित विभाजन प्रोग्राम करें। दहलीज सेट करें ताकि नो प्राइमरी एंटीबॉडी (एनपी) छवियों में कोई संकेत न उठाया जाए।
  5. अनुपचारित नकली स्थिति से छवियों का उपयोग करके दहलीज को आगे अनुकूलित करें। नेक्रोप्टोसिस उत्तेजना के कारण सिग्नल वृद्धि का संवेदनशील पता लगाने के लिए, पी-आरआईपीके 3 (एस 227)+ या पी-एमएलकेएल (एस 358) + वोक्सल्स के पिक-अप को उच्च सीमा निर्धारित करके नकली स्थितियों में सीमित करें। हमेशा मॉक कंडीशन और नेक्रोप्टोसिस-प्रेरित वायरल संक्रमण से कई छवियों में प्रोग्राम किए गए विश्लेषण प्रोटोकॉल की जांच करें।
  6. सभी छवि सेट पर विश्लेषण चलाएँ। स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में आगे की प्रक्रिया के लिए एक .txt फ़ाइल में वोक्सेल परिमाणीकरण और नाभिक विभाजन निर्यात करें।
  7. छवि नाम, नाभिक परिमाणीकरण, और पता लगाए गए वोक्सेल के योग को दिखाने वाले डेटा की एक धुरी तालिका बनाएं।
  8. इसके बाद, छवि में कोशिकाओं की गिनती से सकारात्मक वोक्सेल के योग को विभाजित करें। इसके परिणामस्वरूप प्रति सेल सकारात्मक वोक्सेल का सापेक्ष मूल्य होता है। गुना वृद्धि की कल्पना करने के लिए, पी-आरआईपीके 3 (एस 227)+ या पी-एमएलकेएल (एस 358)+ वोक्सेल प्रति सेल के सापेक्ष मूल्य को अनुपचारित स्थिति (मॉक) के औसत से विभाजित करें।

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Representative Results

मानव कोशिकाओं में एमएलकेएल फॉस्फोराइलेशन और विशेष रूप से आरआईपीके 3 फॉस्फोराइलेशन का इम्यूनोफ्लोरोसेंट पतालगाना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। हम यहां जेडबीपी 1 के सक्रियण पर मानव पी-आरआईपीके 3 (एस 227) और पी-एमएलकेएल (एस 358) के लिए एक बेहतर धुंधला प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल में फ्लोरोसेंट संकेतों की पहचान सीमा और संवेदनशीलता में सुधार के लिए एक टीएसए कदम शामिल है। विधि को मान्य करने के लिए, पी-आरआईपीके 3 (एस 227) और पी-एमएलकेएल (एस 358) दोनों के मानक अप्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट स्टेनिंग के साथ टीएसए-मध्यस्थता इम्यूनोफ्लोरेसेंस की एक साइड-बाय-साइड तुलना की गई थी।

मानव जेडबीपी 1 को व्यक्त करने वाली एचटी -29 कोशिकाओं को आईसीपी 6 आरएचआईएम उत्परिवर्ती एचएसवी -1 स्ट्रेन (एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम) के साथ 9 घंटे के लिए संक्रमित किया गया था ताकि जेडबीपी 1-मध्यस्थता नेक्रोप्टोसिस और आरआईपीके 3 फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित किया जा सके। एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम स्ट्रेन आईसीपी 6 आरएचआईएम के भीतर एक वीक्यूसीजी से एएएए उत्परिवर्तन को वहन करता है और जेडबीपी 114,15 के डाउनस्ट्रीम नेक्रोप्टोसिस सिग्नलिंग को अवरुद्ध करने में असमर्थ है। जैसा कि पहले बताया गया था26, मानक अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस वर्तमान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के साथ RIPK3 S227 फॉस्फोराइलेशन की कल्पना करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं था, तब भी जब कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की लेजर शक्ति 30% तक बढ़ गई थी (चित्रा 2 ए)। इसके विपरीत, टीएसए चरण को शामिल करने से एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम से संक्रमित कोशिकाओं के साइटोसोल में पी-आरआईपीके 3 (एस 227) का मजबूत पता लगाने में सक्षम बनाया गया। पी-आरआईपीके 3 (एस 227) सिग्नल संतृप्ति तक पहुंच गया जब लेजर शक्ति 2% (चित्रा 2 ए) पर सेट की गई थी। त्रि-आयामी जेड-स्टैक छवियों की मात्रा (चरण 9 देखें) ने एचएसवी -1 आईसीपी 6म्यूट्रिम में पी-आरआईपीके 3 (एस 227) के लिए सकारात्मक वोक्सेल की संख्या में लगभग 20 गुना वृद्धि दिखाई (चित्रा 2 बी)। टीएसए-मध्यस्थता स्टेनिंग प्रोटोकॉल से प्राथमिक एंटी-पी-आरआईपीके 3 (एस 227) एंटीबॉडी को कोई प्राथमिक (एनपी) नियंत्रण के रूप में छोड़ने से पता लगाने योग्य संकेत नहीं मिला। एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम-संक्रमित कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, नमूनों को तत्काल प्रारंभिक वायरल प्रोटीन आईसीपी 0 (चित्रा 2 ए) के खिलाफ निर्देशित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सह-दाग दिया गया था। मॉक-उपचारित कोशिकाओं में एक कम लेकिन पता लगाने योग्य पी-आरआईपीके 3 (एस 227) संकेत मौजूद था, जो इस साइट5 पर मानव RIPK3 के संवैधानिक ऑटोफॉस्फोराइलेशन का प्रतिनिधित्व कर सकता है (चर्चा देखें)। पिछली रिपोर्ट28 के अनुरूप, आईसीपी 6 का आरएचआईएम आरआईपीके 3 एस 227 फॉस्फोराइलेशन को पूरी तरह से अवरुद्ध करने में असमर्थ है, क्योंकि हमने जंगली प्रकार के एचएसवी -1 (एचएसवी -1डब्ल्यूटी) से संक्रमित कोशिकाओं के पी-आरआईपीके 3 (एस 227) धुंधला होने का पता लगाया है; चित्रा 2 ए, बी)। पी-आरआईपीके 3 (एस 227) सिग्नल की विशिष्टता को और मान्य करने के लिए, कोशिकाओं को संक्रमण से पहले RIPK3 किनेज अवरोधक GSK'840 के साथ इलाज किया गया था। जीएसके '840 आरआईपीके 3 के काइनेज डोमेन को बांधता है, इसकी गतिविधि को रोकता है और इस तरह इसके ऑटोफॉस्फोराइलेशन29 को रोकता है। जीएसके '840 ने जेडबीपी 1 सक्रियण (चित्रा 2 ए, बी) पर एस 227 पर आरआईपीके 3 फॉस्फोराइलेशन को रोका, जो टीएसए-मध्यस्थता पी-आरआईपीके 3 (एस 227) पहचान विधि की विशिष्टता की पुष्टि करता है।

एमएलकेएल फॉस्फोराइलेशन का पालन करने के लिए, नेक्रोप्टोसिस के लिए एक अंतिम चरण मार्कर, जेडबीपी 1-व्यक्त एचटी -29 कोशिकाओं को 8 घंटे और 10 घंटे के लिए एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम से संक्रमित किया गया था। कोशिकाओं को टीएसए का उपयोग करके एस 358 फॉस्फोराइलेटेड एमएलकेएल (पी-एमएलकेएल [एस 358]) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। नकली उपचारित कोशिकाओं ने पी-एमएलकेएल (एस 358) के कम और कुछ हद तक छिद्रित साइटोसोलिक धुंधलापन दिखाया, जबकि साइटोसोल, नाभिक में मजबूत पी-एमएलकेएल धुंधलापन पाया गया। और कोशिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली पर जो एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम (चित्रा 3 ए) से संक्रमित थे। इसके अलावा, पी-एमएलकेएल (एस 358) सिग्नल क्लस्टर में देखा गया था। यह कोशिका झिल्ली पर सक्रिय फॉस्फोराइलेटेड एमएलकेएल ऑलिगोमर्स के छिद्र बनाने वाले कार्यों और इन्फ्लूएंजा ए संक्रमण 1,2,6,30 पर हाल ही में रिपोर्ट किए गए परमाणु स्थानांतरण के अनुरूप है। एक सकारात्मक पी-एमएलकेएल (एस 358) धुंधला नियंत्रण के रूप में, हमने टीएनएफआर 1-मध्यस्थता नेक्रोप्टोसिस (चित्रा 3 ए) को प्रेरित करने के लिए टीएनएफ, एसएमएसी मिमेटिक बीवी 6 और पैन-कैसपेज़ अवरोधक जेडवीएडी-एफएमके के संयोजन के साथ जेडबीपी 1-व्यक्त एचटी -29 कोशिकाओं को उत्तेजित किया। टीएसए-मध्यस्थता स्टेनिंग प्रोटोकॉल से प्राथमिक एंटी-पी-एमएलकेएल (एस 358) एंटीबॉडी को छोड़ने से कोई प्राथमिक नियंत्रण नहीं मिला, जिससे पता लगाने योग्य संकेत नहीं मिला।

इसके बाद, हमने टीएसए के साथ और बिना पी-एमएलकेएल (एस 358) इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग की साइड-बाय-साइड तुलना की। जेडबीपी 1-व्यक्त एचटी -29 कोशिकाओं को एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम के साथ 9 घंटे के लिए संक्रमित किया गया था। जबकि मानक अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके संक्रमित कोशिकाओं में एक विशिष्ट पी-एमएलकेएल (एस 358) सिग्नल का पता लगाने के लिए 40% की लेजर शक्ति की आवश्यकता थी, टीएसए-उपचारित नमूने पहले से ही मॉक-उपचारित नमूनों में पृष्ठभूमि धुंधला होने को बढ़ाए बिना 6% की लेजर शक्ति पर संतृप्त संकेतों तक पहुंच गए थे (चित्रा 3 बी)। इसके अलावा, तीन-आयामी जेड-स्टैक छवियों की मात्रा का परिमाणीकरण मानक अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस की तुलना में टीएसए का उपयोग करते समय पी-एमएलकेएल (एस 358) के लिए सकारात्मक वोक्सेल की संख्या में 10 गुना से अधिक की वृद्धि दर्शाता है। इससे पता चलता है कि टीएसए पी-एमएलकेएल (एस 358) के लिए पहचान सीमा और संवेदनशीलता दोनों में सुधार करता है; चित्रा 3 सी)।

अंत में, अन्य जेडबीपी 1-निर्भर नेक्रोप्टोसिस वायरल उत्तेजनाओं के लिए टीएसए-मध्यस्थता इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल को मान्य करने के लिए, हमने 9 घंटे के लिए इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) पीआर 8 तनाव के साथ जेडबीपी 1-व्यक्त एचटी -29 कोशिकाओं को संक्रमितकिया। दरअसल, टीएसए ने पी-आरआईपीके 3 (एस 227) और पी-एमएलकेएल (एस 358) की मजबूत पहचान की अनुमति दी, जो नेक्रोप्टोसिस (चित्रा 4 ए-डी) से गुजरने वाली इन कोशिकाओं का संकेत है।

Figure 1
चित्रा 1: टीएसए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से प्लेट में बीज और उत्तेजित किया जाता है, जो उच्च अंत माइक्रोस्कोपी के साथ संगत होता है। बाद में, नमूनों को 4% पीएफए में तय किया जाता है, प्राथमिक एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए परमेबिलाइज्ड और अवरुद्ध किया जाता है। फॉस्फोराइलेटेड RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) और MLKL (p-MLKL [S358]) की कल्पना करने के लिए, इन प्रमुख फॉस्फोराइलेशन साइटों को पहचानने वाले विशिष्ट एंटीबॉडी को इमेजिंग कक्ष पर रात भर इनक्यूबेट किया जाता है। इसके बाद, एक द्वितीयक एंटीबॉडी, एक घोड़े की मूली पेरोक्सीडेज (एचआरपी) के साथ युग्मित होता है। यह एचआरपी समूह एच2 ओ 2की उपस्थिति में बायोटिनाइलेटेड टायरामाइड के सक्रियण को सक्षम बनाताहै। इसके बाद, सक्रिय बायोटिन-टायरामाइड सहसंयोजक रूप से एचआरपी-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी के करीब टाइरोसिन अवशेषों से जुड़ता है। इनमें रुचि के प्रोटीन पर टायरोसिन शामिल हैं- इस मामले में पी-आरआईपीके 3 या पी-एमएलकेएल, जैसा कि आंकड़े में संकेत दिया गया है- और पड़ोसी प्रोटीन और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी पर (नहीं दिखाया गया)। यह टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन चरण धुंधला प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता को बहुत बढ़ाता है। एक अंतिम चरण में, बायोटिनिलेटेड अणुओं की कल्पना करने के लिए एक फ्लोरोसेंट समूह के साथ युग्मित स्ट्रेप्टाविडिन जोड़ा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: HSV-1 ICP6mutRHIM S227 पर मानव RIPK3 के ZBP1-निर्भर फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित करता है। (A) मानव ZBP1-व्यक्त करने वाले HT-29 कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां, P-RIPK3 (S227) के लिए मानक अप्रत्यक्ष (कोई TSA) इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग प्रोटोकॉल के साथ TSA धुंधला होने की तुलना करती हैं। मॉक-और वायरस-संक्रमित नमूने (एचएसवी -1डब्ल्यूटी या एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम [एमओआई = 5]) को 9 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, RIPK3 किनेज अवरोधक GSK'840 (1 μM) को शामिल किया गया था। 9 घंटे के लिए एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम (एमओआई = 5) से संक्रमित कोशिकाओं का कोई प्राथमिक (एनपी) धुंधला नियंत्रण शामिल है जिसमें प्राथमिक एंटी-पी-आरआईपीके 3 (एस 227) और आईसीपी 0 एंटीबॉडी दोनों को छोड़ दिया गया था। विशिष्ट पी-आरआईपीके 3 (एस 227) सिग्नल का पता लगाने के लिए आवश्यक लेजर शक्ति छवियों पर इंगित की गई है। आईसीपी 0 का उपयोग वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को दागने के लिए किया गया था, और डीएपीआई का उपयोग नाभिक को दागने के लिए किया गया था। (बी) टीएसए स्टेनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके पी-आरआईपीके 3 (एस 227) + वोक्सेल की सापेक्ष मात्रा का परिमाणीकरण। प्रत्येक बिंदु एक छवि का प्रतिनिधित्व करता है, और लाल पट्टी माध्य का प्रतिनिधित्व करती है। वोक्सेल गणना मान नकली स्थिति में छवियों की वोक्सेल गिनती के औसत के सापेक्ष प्रस्तुत किए जाते हैं। टुकी सुधार का उपयोग करके कई तुलनाओं के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके आंकड़े किए गए थे। p > 0.05 (n.s.), p≤ 0.05 (*), p≤ 0.01 (**). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: HSV-1 ICP6MUTRHIM S358 पर मानव MLKL के ZBP1-निर्भर फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित करता है। कोशिकाओं को या तो 8 घंटे और 10 घंटे के लिए एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम (एमओआई = 5) से संक्रमित किया गया था। आईसीपी 0 का उपयोग वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को दागने के लिए किया गया था, और डीएपीआई का उपयोग नाभिक को दागने के लिए किया गया था। एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम (एमओआई = 5) के साथ 10 घंटे के लिए संक्रमित कोशिकाओं का कोई प्राथमिक (एनपी) धुंधला नियंत्रण नहीं दिखाया गया है जिसमें प्राथमिक एंटी-पी-एमएलकेएल (एस 358) को छोड़ दिया गया था। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, कोशिकाओं को 30 एनजी / एमएल टीएनएफ, 5 एसएम बीवी 6, और 20 एसएम जेडवीएडी-एफएमके के साथ 4 घंटे के लिए उत्तेजित किया गया था, जो टीएनएफआर 1 के माध्यम से नेक्रोप्टोसिस को प्रेरित करता है। (बी) मानव जेडबीपी 1-व्यक्त एचटी -29 कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां, पी-एमएलकेएल (एस 358) के लिए एक मानक अप्रत्यक्ष (कोई टीएसए) इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग प्रोटोकॉल के साथ टीएसए धुंधला होने की तुलना करती हैं। कोशिकाओं को या तो नकली इलाज किया गया था या 9 घंटे के लिए एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम (एमओआई = 5) से संक्रमित किया गया था। 9 घंटे के लिए एचएसवी -1 आईसीपी 6एमयूटीआरएचआईएम (एमओआई = 5) से संक्रमित कोशिकाओं का एनपी धुंधला नियंत्रण जिसमें प्राथमिक एंटी-पी-एमएलकेएल (एस 358) और आईसीपी 0 एंटीबॉडी को छोड़ दिया गया था। विशिष्ट पी-एमएलकेएल (एस 358) सिग्नल का पता लगाने के लिए आवश्यक लेजर शक्ति छवियों पर इंगित की गई है। (ग) मानक (कोई टीएसए नहीं) और टीएसए स्टेनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके पी-एमएलकेएल (एस 358) + वोक्सेल का सापेक्ष परिमाणीकरण। प्रत्येक बिंदु एक छवि का प्रतिनिधित्व करता है, और लाल पट्टी माध्य का प्रतिनिधित्व करती है। वोक्सेल गणना मान नकली स्थिति में छवियों की वोक्सेल गिनती के औसत के सापेक्ष प्रस्तुत किए जाते हैं। टुकी सुधार का उपयोग करके कई तुलनाओं के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके आंकड़े किए गए थे। p > 0.05 (n.s.), p ≤ 0.0001 (**** कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: इन्फ्लुएंजा ए वायरस मानव RIPK3 और MLKL के ZBP1-निर्भर फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित करता है। कोशिकाओं को या तो नकली इलाज किया गया था या इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी), पीआर 8 स्ट्रेन (एमओआई = 4) से 9 घंटे के लिए संक्रमित किया गया था और पी-आरआईपीके 3 (एस 227) के लिए दाग दिया गया था। ए) या पी-एमएलकेएल (एस 358; सी) टीएसए प्रोटोकॉल का उपयोग करना। स्केल बार 10 μm हैं। (B, D) p-RIPK3 (S227)+ (B) या p-MLKL (S358) का सापेक्ष परिमाणीकरण; डी) वोक्सेल। (बी, डी) में प्रत्येक बिंदु एक छवि का प्रतिनिधित्व करता है, और लाल पट्टी माध्य का प्रतिनिधित्व करती है। वोक्सेल गणना मान नकली स्थिति में छवियों की वोक्सेल गिनती के औसत के सापेक्ष प्रस्तुत किए जाते हैं। मैन-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग करके आंकड़े किए गए थे। p≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग प्रोटोकॉल मानव नेक्रोप्टोटिक सिग्नलिंग मार्ग की सिग्नलिंग घटनाओं के लिए संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए टायरामाइड सिग्नल एम्पलीफिकेशन (टीएसए) के उपयोग का वर्णन करता है, जिसका पता लगाना मुश्किल है, जिसमें आरआईपीके 3 और एमएलकेएल26 का फॉस्फोराइलेशन शामिल है। टीएसए चरण को शामिल करने से पी-आरआईपीके 3 (एस 227) और पी-एमएलकेएल (एस 358) की पहचान सीमा में काफी सुधार होता है और पी-एमएलकेएल (एस 358) तनाव की संवेदनशीलता बढ़ जाती है। टीएसए ने नकली-उपचारित नमूनों में पहले से मौजूद पी-आरआईपीके 3 (एस 227) सिग्नल का खुलासा किया। मानव कोशिकाओं में, एस 227 पर आरआईपीके 3 का ऑटोफॉस्फोराइलेशन एमएलकेएल के साथ एक स्थिर बातचीत को सक्षम करके नेक्रोप्टोसिस सक्रियण के लिए एक शर्त है। यह प्रक्रिया पहले से ही बेसल स्तरों पर होती है और इसके परिणामस्वरूप नेक्रोप्टोसिस प्रेरण 2,5,31 से पहले एक स्थिर निष्क्रिय पी-आरआईपीके 3 (एस227)/एमएलकेएल डिमर का गठन होता है। इसी तरह, इस अध्ययन में इस्तेमाल एंटी-पी-आरआईपीके 3 एंटीबॉडी भी पश्चिमी सोख्ता 26 द्वारा अनुपचारित कोशिकाओं में पी-आरआईपीके 3 (एस227) का पता लगाता है।

सक्रियण लूप के भीतर RIPK3 द्वारा MLKL के फॉस्फोराइलेशन, T357 और S358 पर, निष्क्रिय p-RIPK3 (S227)/MLKL कॉम्प्लेक्स के पृथक्करण के परिणामस्वरूप होता है और एक संवहन परिवर्तन को प्रेरित करता है जिससे MLKL अपने N-टर्मिनल चार हेलिक्स बंडल डोमेन को उजागर करता है। सक्रिय पी-एमएलकेएल तब ओलिगोमेराइज्ड होता है और कोशिका झिल्ली में यातायात करता है जहां यह लिपिड बाइलेयर में अपने चार हेलिक्स बंडलों को डालता है, जिसके परिणामस्वरूप सेल लाइसिस 1,2,6 होता है। इस टीएसए इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने जेडबीपी 1-प्रेरित नेक्रोप्टोसिस के दौरान एस 358 एमएलकेएल फॉस्फोराइलेशन में एक मजबूत वृद्धि का पता लगाया। पी-एमएलकेएल (एस 358) साइटोसोल के भीतर और प्लाज्मा झिल्ली पर समूहित था और जेडबीपी 1 सक्रियण पर नाभिक के भीतर भी पाया गया था। दरअसल, जेडबीपी 1 को आईएवी संक्रमण 8,30 के संदर्भ में परमाणु झिल्ली के एमएलकेएल-मध्यस्थता गड़बड़ी को उत्तेजित करने के लिए सूचितकिया गया है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि टीएसए न केवल ब्याज के एंटीजन और प्राथमिक / द्वितीयक एंटीबॉडी पर बायोटिन-टायरामाइड जमा करता है, बल्कि पड़ोसी प्रोटीन पर भी। इसलिए, टीएसए आदर्श रूप से पता लगाए गए प्रोटीन के सटीक उपकोशिकीय स्थानीयकरण पर जानकारी निकालने के लिए उपयुक्त नहीं है, और हम सह-स्थानीयकरण अध्ययनों के लिए टीएसए की सिफारिश नहीं करते हैं।

बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्र बायोटिनाइलेटेड टायरामाइड की स्थिरता को प्रभावित करते हैं। सिग्नल संवेदनशीलता में कमी को रोकने के लिए, हम टायरामाइड को एलिकोट करने और प्रत्येक प्रयोग के लिए एक ताजा एलिकोट का उपयोग करने की सलाह देते हैं। बायोटिन-टायरामाइड स्टॉक में बैच-टू-बैच अंतर के साथ सावधानी बरतनी चाहिए। यदि बायोटिन-टायरामाइड की अंतिम एकाग्रता बहुत अधिक है, तो टीएसए प्रवर्धन की गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि विशिष्ट संकेत को मुखौटा करेगी। इसे नियंत्रित करने के लिए, हम हर नए बायोटिन-टायरामाइड बैच को टाइट करने और प्राथमिक धुंधला नियंत्रण शामिल करने की सलाह देते हैं जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़ दिया जाता है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, टीएसए एक लक्ष्य तक सीमित था। फॉस्फोराइलेटेड आरआईपीके 3 और एमएलकेएल का पता लगाने को एक ही धुंधलापन में नहीं जोड़ा गया था, क्योंकि दोनों प्राथमिक एंटीबॉडी एक ही प्रजाति में उठाए गए थे। प्रोटोकॉल को मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरोसेंट टीएसए 32,33 का उपयोग करके एक ही नमूने के भीतर कई टीएसए-प्रवर्धित संकेतों (जैसे, पी-आरआईपीके 3 [एस227] और पी-एमएलकेएल [एस 358]) का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अंत में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए टीएसए-मध्यस्थता प्रवर्धन का उपयोग खराब सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ अन्य सिग्नलिंग मार्गों के बायोमार्कर की पहचान के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम प्रशिक्षण, समर्थन और उपकरण पार्क तक पहुंच के लिए वीआईबी बायोइमेजिंग कोर को धन्यवाद देना चाहते हैं। जेएन को रिसर्च फाउंडेशन फ्लैंडर्स (एफडब्ल्यूओ) से पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया है। जेएम समूह में अनुसंधान को ओडिसियस द्वितीय अनुदान (जी0एच 8618 एन), ईओएस इनफ्लैडिस (40007512), रिसर्च फाउंडेशन फ्लैंडर्स (एफडब्ल्यूओ) से एक जूनियर रिसर्च ग्रांट (जी031022 एन), एक सीआरआईजी युवा अन्वेषक प्रमाण-ऑफ-कॉन्सेप्ट अनुदान और गेंट विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। पी.वी. समूह में अनुसंधान को ईओएस मॉडल-आईडीआई (30826052), ईओएस इनफ्लैडिस (40007512), एफडब्ल्यूओ वरिष्ठ अनुसंधान अनुदान (जी.0सी76.18 एन, जी.0बी71.18 एन, जी.0बी96.20 एन, जी.0ए9322एन), मेथुसलेम (बीओएफ16/MET_V/007), आईबीओएफ20/आईबीएफ/039 एटलांटिस, फाउंडेशन ऑफ कैंसर (एफ/20) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP Agilent Technologies Belgium K4002 Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633 Thermofisher 35513 Secundary antibody
HSV-1 ICP0 Santa Cruz sc-53070 Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum In house production xx Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL Abcam ab187091 Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3 Abcam ab209384 Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI Thermofisher D21490 To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 Thermofisher S11226 To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2 Sigma H1009 Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA SANBIO AR1068 To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide R&D Systems 6241 To amplify signal, HRP substrate
BV-6 Selleckchem S7597 BV6 IAP Inhibitor
         For cell culture: to detach the cells
         8.0 g/L NaCl
         0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04% In house formulation 1.1 g/L Na2HPO4
         0.2 g/L NaH2PO4
         0.2 g/L KCl
         0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum TICO FBS EU XXX For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840 Aobious AOB0917 RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513 For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock Active Motif 15252 Blocking solution
PBS Gibco 10444402
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α In house production - Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML To permeabilise the cells
Trypan blue Merck 11732 For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine Sigma-Aldrich T4424 For cell culture: to detach the cells
zVAD Bachem BACE4026865.0005 Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom iBidi 80807 To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium Electron Microscopy Sciences 71001-10 To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C ZEISS 444970-9000-000 To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner ZEISS 000000-0105-200 To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope To visualise the sample
Software
Excel Office xx To process the data
Prism 9 Graphpad xx To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3 Volocity xx To perform quantifications
Zen black ZEISS xx To aquire and process images
Zen blue ZEISS xx To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain produced by  Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain Produced by Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8 in house stock in house replication IAV as a trigger for necroptosis

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 188
मानव कोशिकाओं में एचएसवी -1 संक्रमण के बाद आरआईपीके 3 और एमएलकेएल के जेडबीपी 1-निर्भर फॉस्फोराइलेशन के इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के लिए टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन
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Nemegeer, J., Lemeire, K., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells. J. Vis. Exp. (188), e64332, doi:10.3791/64332 (2022).

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