היכולת של בקטריופאג' להעביר דנ"א בין תאי חיידקים הופכת אותם לכלים יעילים למניפולציה גנטית של החיידקים המארחים שלהם. מוצגת כאן מתודולוגיה לגרום, לשקם ולהשתמש ב-φBB-1, בקטריופאג' של בורליה בורגדורפרי, כדי להמיר דנ"א הטרולוגי בין זנים שונים של ספירוצ'טה של מחלת ליים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מניפולציה גנטית בתיווך פאגים של מחלת ליים ספירוכטה בורליה בורגדורפרי
במאמר זה
סיכום
תקציר
החדרת דנ"א זר לתוך הספירוכטה Borrelia burgdorferi הושגה כמעט אך ורק על ידי טרנספורמציה באמצעות אלקטרופורציה. לתהליך זה יש יעילות נמוכה יותר באופן ניכר במחלת ליים ספירוצ'ט בהשוואה לחיידקים גראם שליליים אחרים, המאופיינים טוב יותר. אחוזי ההצלחה של הטרנספורמציה תלויים מאוד בכך שיש כמויות מרוכזות של דנ"א באיכות גבוהה מרקעים ספציפיים וכפופים לשונות משמעותית מזן לזן. אמצעים חלופיים להחדרת דנ"א זר (כלומר, וקטורים של מעבורת, כתבים פלואורסצנטיים וסמני עמידות לאנטיביוטיקה) לתוך B. burgdorferi יכולים להיות תוספת חשובה לחימוש של כלים שימושיים למניפולציה גנטית של ספירוכט מחלת ליים. בקטריופאג' הוכר היטב כמנגנונים טבעיים לתנועת דנ"א בין חיידקים בתהליך שנקרא טרנסדוקציה. במחקר זה פותחה שיטה לשימוש בפאג' הבורליאלי φBB-1 הנמצא בכל מקום כדי להמיר דנ"א בין תאי B. burgdorferi מרקע גנטי זהה ושונה. הדנ"א המתמר כולל גם דנ"א בורליאלי וגם דנ"א הטרולוגי בצורה של וקטורים קטנים. הדגמה זו מציעה שימוש אפשרי בהתמרה בתיווך פאגים כהשלמה לאלקטרופורציה למניפולציה הגנטית של מחלת ליים ספירוכט. דו"ח זה מתאר שיטות לאינדוקציה וטיהור של פאג φBB-1 מ - B. burgdorferi, השימוש בפאג זה במבחני טרנסדוקציה, ובחירה וסינון של מתמרים פוטנציאליים.
מבוא
פיתוח כלים למניפולציה גנטית של החיידק הספירוכטלי Borrelia burgdorferi הוסיף ערך לאין שיעור להבנת טבעה של מחלת ליים 1,2,3,4. ל-B. burgdorferi יש גנום מורכב במיוחד המורכב מכרומוזום ליניארי קטן ופלסמידים ליניאריים ומעגליים 5,6. אובדן פלסמיד ספונטני, סידור מחדש תוך-גני (תנועה של גנים מפלסמיד אחד למשנהו בתוך אותו אורגניזם) והעברת גנים אופקית (HGT, תנועת הדנ"א בין שני אורגניזמים) הולידו כמות מסחררת של הטרוגניות גנטית בקרב B. burgdorferi (לדוגמה, ראו Schutzer et <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים המשתמשים בדנ"א רקומביננטי ובאורגניזמים BSL-2 נבדקו ואושרו על ידי הוועדה הביולוגית המוסדית של אוניברסיטת קוויניפיאק.
1. הכנת תרבות B. burgdorferi לייצור φBB-1
- הכינו את סרום הארנב הרגיל (BSK) של ברבור-סטונר-קלי בתוספת של 6.6% סרום ארנבת רגיל (BSK) המומת בחום15. עבור 1 ליטר של 1x BSK, שלב את הרכיבים המפורטים בטבלה 1 ב-900 מ"ל מים, התאם את ה- pH ל- 7.6 באמצעות 1 N נתרן הידרוקסיד, וערבב באיטיות ב- 4 °C למשך 2-4 שעות. לאחר השלמת הערבוב, בדוק והתאם מחדש את ה- pH ל -7.6 במידת הצורך, והגדל את הנפח ל -1 ליטר עם מים. יש לעקר את המדיום על ידי מעבר דרך מסנן של 0.22 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השימוש בבקטריופאג' כדי להעביר דנ"א בין זנים של B. burgdorferi הניתנים לשינוי בקלות רבה יותר או שיבוטים שהם סרבנים לאלקטרו-טרנספורמציה מייצג כלי נוסף להמשך החקירה המולקולרית של הגורמים המשפיעים על מחלת ליים. ניתן לשנות את בדיקת ההתמרה המתוארת כאן לפי הצורך כדי להקל על תנועת הדנ"א בין כל שיבוט מעניין באמצעות אנטיביוטיקה אחת או שתיים לבחירת מתמרים פוטנציאליים. ההתמרות של דנ"א נבואי ושל וקטורים הטרולוגיים E. coli/B. burgdorferi בין שיבוט זן CA-11.2A בעל מעבר גבוה לבין שיבוט זן B31 בעל מעבר גבוה ושי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השימוש בהתמרה יכול לייצג שיטה אחת להתגבר לפחות על חלק מהמחסומים הביולוגיים והטכניים הקשורים לאלקטרו-טרנספורמציה של B. burgdorferi 1,4,13,37. במערכות רבות, בקטריופאג' יכול להעביר דנ"א מארח (שאינו נבוא) בין תאי חיידקים על ידי התמרה כללית או מיוחדת של 22,23,24,49,50.<.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחבר אין מה לחשוף.
תודות
המחבר מבקש להודות לשאונה ריד, ד. סקוט סמואלס ופטריק סקור על הדיון המועיל שלהם ולווריון (פאם) צ'ונוואראוונג על עזרתם הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה למדעים ביו-רפואיים ומענקי מחקר מהפקולטה לכריסטיאן ה. אגרס מבית הספר למדעי הבריאות באוניברסיטת קוויניפיאק.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| יחידות סינון 1 ליטר (PES, 0.22 ומיקרו; m גודל נקבוביות) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| צינור 12 מ"מ x 75 מ"מ (מכסה מיקום כפול) (פוליפרופילן) | USA Scientific | 1450-0810 | מכיל 4 מ"ל עם נפח ריק נמוך (לאינדוקציה) |
| 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים (פוליפרופילן) | USA Scientific | 5618-8271 | |
| 1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) | Millipore Sigma | זהירות: מסרטן פוטנציאלי; כבר לא זמין, לא בדקתי תחליף מוצע | |
| 5.75 אינץ' פסטר פיפטות (כותנה מחוברת / זכוכית בורוסיליקט / לא סטרילית) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | אוטוקלאב לפני השימוש |
| בצינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"ל (פוליפרופילן) | USA Scientific | 1500-1211 | |
| אתנול | |||
| Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
| Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
| אלבומין בסרום בקר (דרגת החלפת סרום) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| כלורופורם (לביולוגיה מולקולרית) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | זהירות: אורגני נדיף; יש להשתמש רק בקולטים אדים כימיים |
| CMRL-1066 w/o L-גלוטמין (אבקה) | ארה"ב ביולוגי | C5900-01 | תרבית תאים בדרגת |
| אריתרומיצין | מוצרי מחקר בינלאומיים | Corp E57000-25.0 | |
| תמיסת ריאגנט ג'נטמיצין | Gibco | 15750-060 | |
| גלוקוז (דקסטרוז נטול מים) | תרמו פישר מדעי | BP350-500 | |
| HEPES | תרמו פישר סיינטיפיק | BP310-500 | |
| קנמיצין סולפט | תרמו פישר סיינטיפיק | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (0.22 ומיקרו; גודל נקבוביות M) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | לסינון אנטיביוטיקה לעיקור ותמיסות אחרות בנפח קטן |
| Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | זהירות: מסרטן פוטנציאלי; השתמש רק במכסה אדים כימי |
| N-acetyl-D-glucosamine | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| אוליגונוקלאוטידים (פריימרים ל-PCR) | IDT DNA | ||
| OmniPrep (ערכת מיצוי גנומי כולל) | G Biosciences | 786-136 | |
| צלחת פטרי (100 מ"מ ופעמים; 15 מ"מ) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| תא ספירה פטרוף-האוסר | מדעי Hausser | HS-3900 | |
| Petroff-Hausser כיסוי תא ספירה זכוכית | Hausser Scientific | HS-5051 | |
| פוליאתילן גליקול 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| סרום ארנב לא סטרילי עקבות המוליז צעירים (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | השבתת חום לפי הוראות היצרן |
| קובטות שקופות UV למחצה מיקרו | ארה"ב סיינטיפיק | 9750-9150 | |
| נתרן ביקרבונט | תרמו פישר סיינטיפיק | BP328-500 | |
| נתרן כלורי | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| נתרן פירובט | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Streptomycin סולפט תמיסת | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| טריסודיום ציטראט דיהידראט | Millipore Sigma | S1804-500G | נתרן ציטראט עבור BSK |
מקורות
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorf....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
