Summary
細菌細胞間でDNAを移動するバクテリオファージの能力は、それらを細菌宿主の遺伝子操作のための効果的なツールにします。ここで紹介するのは、 ボレリア・ブルグドルフェリのバクテリオファージであるφBB-1を誘導、回収、および使用して、ライム病スピロヘータの異なる株間で異種DNAを形質導入するための方法論です。
Abstract
スピロヘータ ボレリア・ブルグドルフェリ への外来DNAの導入は、エレクトロポレーションを用いた形質転換によってほぼ独占的に達成されてきた。このプロセスは、他のよりよく特徴付けられたグラム陰性菌と比較して 、ライム病スピロヘータの効率が著しく低い。形質転換の成功率は、特定のバックグラウンドからの高品質のDNAが濃縮されていることに大きく依存し、株ごとに大きなばらつきがあります。外来DNA(すなわち、シャトルベクター、蛍光レポーター、および抗生物質耐性マーカー)を B.ブルグドルフェリ に導入するための代替手段は、ライム病スピロヘータの遺伝子操作のための有用なツールの兵器庫への重要な追加となる可能性があります。バクテリオファージは、形質導入と呼ばれるプロセスにおける細菌間のDNAの移動の自然なメカニズムとしてよく認識されています。本研究では、ユビキタスボレリアファージφBB-1を用いて、同じ遺伝的背景と異なる遺伝的背景の両方を持つ B.ブルグドルフェリ 細胞間でDNAを形質導入する方法を開発しました。形質導入されたDNAには、ボレリアDNAと異種DNAの両方が小さなシャトルベクターの形で含まれています。この実証は、ライム病スピロヘータの遺伝子操作のためのエレクトロポレーションの補完としてのファージ媒介形質導入の潜在的な使用を示唆している。本報告では、 B. burgdorferi由来のファージφBB-1の誘導および精製方法、形質導入アッセイにおけるこのファージの使用、および潜在的な形質導入物質の選択およびスクリーニングについて述べる。
Introduction
スピロヘータ細菌ボレリア・ブルグドルフェリの遺伝子操作のためのツールの開発は、ライム病の性質の理解に計り知れない価値を追加しました1,2,3,4。B. burgdorferiは、小さな線状染色体と直鎖状および環状プラスミドの両方からなる異常に複雑なゲノムを持っています5,6。自発的なプラスミド喪失、遺伝子内再配列(同じ生物内のあるプラスミドから別のプラスミドへの遺伝子の移動)、および遺伝子の水平移動(HGT、2つの生物間のDNAの移動)は、B. burgdorferiの間で目まぐるしい量の遺伝的不均一性を引き起こしました(例として、Schutzerら7を参照)。結果として生じる遺伝子型(または「株」)はすべて同じ種のメンバーですが、異なる哺乳類宿主に伝達し感染する能力に影響を与える遺伝的差異があります8、9、10、11。このレポートでは、「株」という用語は、特定の自然由来の遺伝的背景を持つB.ブルグドルフェリを指すために使用されます。用語「クローン」は、特定の目的のために、または実験的操作の結果として遺伝子改変された株を指すために使用されるであろう。
B. burgdorferiで使用できる分子ツールボックスには、選択マーカー、遺伝子レポーター、シャトルベクター、トランスポゾン突然変異誘発、誘導性プロモーター、および逆選択マーカーが含まれます(レビューについては、Drektrah and Samuels12を参照)。これらの方法論を効果的に使用するには、目的のB.ブルグドルフェリ株に異種(外来)DNAを人工的に導入する必要があります。B. burgdorferiでは、異種DNAの導入は、電気パルスを利用して細菌膜を培地に導入されたDNAの小片に対して一過性に透過させる方法であるエレクトロポレーションによってほぼ独占的に達成される1。大部分の細胞(≥99.5%と推定)はパルスによって殺されますが、残りの細胞は異種DNAを保持する頻度が高い13。細菌にDNAを導入する最も効率的な方法の一つと考えられていますが、B. burgdorferiへのエレクトロポレーションの頻度は非常に低いです(5細胞に1つの形質転換体×104から5×106細胞の範囲)13。より高い頻度の変換を達成するための障壁は、技術的および生物学的の両方であるように思われます。B. burgdorferiのエレクトロポレーションを成功させるための技術的障壁には、必要なDNAの量(>10μg)と、エレクトロコンピテントセルを調製する際のスピロヘータが正確に正しい成長段階(中ログ、2×10 7細胞・mL−1と7 × 107細胞・mL−1の間)の両方が含まれます12,13。ただし、これらの技術的障壁は、生物学的障壁よりも克服しやすい場合があります。
ライム病の研究者は、B.ブルグドルフェリクローンが遺伝的に操作される能力に関して2つの大きなカテゴリーに分けることができることを認識しています13,14。高継代、実験室適応分離株は、しばしば容易に形質転換されるが、通常は感染力に必須のプラスミドを失い、生理学的に異常な挙動を示し、哺乳類宿主に感染することも、ダニベクター内で持続することもできない12,13。これらのクローンは、実験室内でスピロヘータの分子生物学的に解剖するのに有用でしたが、風土病サイクルの生物学的文脈の中でスピロヘータを研究するためにはほとんど価値がありません。一方、低継代感染分離株は、感染状態を反映した生理学的に振る舞い、感染サイクルを完了することができますが、通常は異種DNAの導入に難解であるため、研究のために操作することは困難です12,13。低継代分離株の形質転換の難しさは、少なくとも2つの異なる要因に関連している:(i)低継代分離株は、特にエレクトロポレーションに必要な高密度条件下で、しばしば緊密に凝集し、したがって、多くの細胞が電荷の完全な適用または培地中のDNAへのアクセスのいずれかを遮断する13,15;(ii)B.ブルグドルフェリは、高継代分離株で失われる可能性のある少なくとも2つの異なるプラスミド媒介制限修飾(R-M)系をコードする14,16。R-Mシステムは、細菌が外来DNAを認識して排除できるように進化しました17。実際、B. burgdorferiのいくつかの研究では、DNAのソースが大腸菌ではなくB. burgdorferiである場合に形質転換効率が向上することが示されています13,16。残念ながら、エレクトロポレーションに必要な高濃度のDNAをB. burgdorferiから取得することは、費用と時間のかかる見通しです。エレクトロポレーションおよび低継代分離株を選択する際の別の潜在的な懸念は、このプロセスが、重要な病原性関連プラスミドlp2514,18,19を失った形質転換体に有利に働くように見えることです。したがって、エレクトロポレーションを介して低継代B.ブルグドルフェリ単離株を遺伝的に操作する行為そのものが、風土病サイクル20内の生物学的に関連する分析に適さないクローンを選択し得る。これらの問題を考えると、異種DNAを高継代B.ブルグドルフェリクローンに電気変換し、エレクトロポレーション以外の方法で低継代感染分離株に移すことができるシステムは、ライム病スピロヘータで使用できる分子ツールのコレクションの増加に歓迎すべき追加となる可能性があります。
形質転換(裸のDNAの取り込み)に加えて、細菌が異種DNAを定期的に取り込むメカニズムは他に2つあります:互いに直接物理的に接触している細菌間のDNAの交換であるコンジュゲーションと、バクテリオファージによって媒介されるDNAの交換である形質導入21。実際、HGTを媒介するバクテリオファージの能力は、多数の細菌系内の分子プロセスを解剖するための実験ツールとして使用されてきた22、23、24。B. burgdorferiは裸のDNAの取り込みに自然有能ではなく、B. burgdorferiが接合を成功させるために必要な装置をコードしているという証拠はほとんどありません。 しかし、以前の報告では、B. burgdorferi25,26,27,28の温帯バクテリオファージであるφBB-1の同定と予備的な特性評価が記載されている。φBB-1は、B. burgdorferi25内に見られる30 kbプラスミドのファミリーをパッケージ化します。このファミリーのメンバーはCP32に指定されています。Stevensonらは、B. burgdorferi株間のHGTへの参加におけるφBB-1の役割と一致して、他の点では異なるcp32を持つ2つの株で同一のcp32が見つかったことを報告し、おそらく形質導入を介して、これら2つの株間でこのcp32が最近共有されていることを示唆しています29。また、他の点では比較的安定したゲノム30,31,32,33のcp32の間でHGTを介した有意な組換えの証拠もあります。最後に、φBB-1がcp32sおよび異種シャトルベクターDNAの両方を、同じ株の細胞間および2つの異なる株の細胞間で形質導入する能力は、以前に実証されている27,28。これらの知見から、φBB-1はB. burgdorferiの分子生物学解剖のための別のツールとして提案されている。
このレポートの目的は、 B. burgdorferiからファージφBB-1を誘導および精製する方法を詳述し、 B. burgdorferi クローン間の形質導入アッセイを実行し、潜在的な形質導入物質を選択およびスクリーニングするためのプロトコルを提供することです。
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Protocol
組換えDNAおよびBSL-2生物を用いたすべての実験は、クイニピアック大学機関バイオセーフティ委員会によってレビューおよび承認されました。
1. φBB-1生産のための B.ブルグドルフェリ 培養液の調製
- 6.6%熱不活化正常ウサギ血清(BSK)を添加したバーバー・ストーナー・ケリー培地を調製します15。1 Lの1x BSKに対して、表1に記載されている成分を900 mLの水に混ぜ合わせ、 1 N水酸化ナトリウムを使用してpHを7.6に調整し、4°Cで2〜4時間ゆっくりと混合します。混合が完了したら、必要に応じてpHを確認して7.6に再調整し、水で容量を1 Lに増やします。0.22 μMフィルター( 材料表を参照)を通過させて培地を滅菌し、新鮮なものを使用するか、4°Cで≤2か月間保管します。
- 形質導入プロトコルを開始する3〜5日前に、150 μLの適切なB.ブルグドルフェリクローンを、しっかりとキャップされた滅菌コニカル遠心チューブ内の15 mLの1x BSKに接種します(材料の表を参照)。B. burgdorferiクローン内の異種DNAの選択と維持のために、適切な濃度の抗生物質または抗生物質の組み合わせを培地に補給します(表2)。
注: B.ブルグドルフェリ はバイオセーフティレベル2の生物です。この生物を扱う間、すべての適切な予防策を講じてください。 B. burgdorferi の生きた培養物を使って、認定され適切に消毒されたクラスIIバイオセーフティキャビネットですべての作業を行います。 B. burgdorferi と生物自体に接触するすべての物質は、CDCガイドライン34に基づいて適切に廃棄してください。 - 培養物が≥5 ×10 7 スピロヘータ·mL−1の密度に達するまで、振とうせずに33°Cで培養物をインキュベートします。
2. B. burgdorferi 培養物の密度を決定する (Samuels から改変)15
- 5 × 106 細胞・mL−1を超えると予想される密度については、分光法を使用して細胞密度を決定します。
- 1 mLの培養液を1.7 mLの微量遠心チューブに移し、8,000 x g で室温で5分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、細胞ペレットを1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2 HPO 4、および1.8 mM KH2PO4)に再懸濁します。細胞懸濁液全体をセミミクロUV透明キュベットに移します。
- 波長600nm(A600)で再懸濁したサンプルの光学密度を決定する。分光光度計( 材料表を参照)をPBSに対してゼロにします。
- 元の培養液中のスピロヘータ·mL−1 の濃度を計算するには、A600 での光学密度に1.4×10を掛けます9。
- 密度が5×104 細胞・mL−1 から5×106 細胞・mL−1の間であると予想される密度については、ペトロフ・ハウザー計数チャンバー( 材料表を参照)を使用して細胞密度を決定し、スピロヘータの数を直接カウントします。この方法は、適切な希釈後の高密度にも使用できます。
注:生きたスピロヘータの視覚化には、暗視野コンデンサーで改造された顕微鏡が必要です。- 10 μLのサンプルを計数チャンバーに塗布し、適切なカバーガラスで覆います。密度が1 × 107を超える場合は、サンプルをPBSで希釈して、フィールドあたり50〜100個のスピロヘータを生成します。
- 暗視野顕微鏡を使用して200x〜400xの倍率で細胞をカウントします。すべての平面で16個の小さな正方形の25グループのフィールド全体を数えます。
- カウント数に希釈係数(存在する場合)を掛け、5 × 104 を掛けて、元の培養の細胞·mL−1 を生成します。
3. B.ブルグドルフェリ ファージφBB-1の誘導
注:オートクレーブですべてのガラス製品とプラスチック製品を滅菌します。オートクレーブまたは0.22 μMフィルターによるろ過により、すべての溶液を滅菌します。以下の手順は15 mLの容量に基づいて示されていますが、この方法は、実験の個々のニーズに応じて、より小さな容量またはより大きな容量に拡張可能です。
- ファージが産生される B. burgdorferi 培養物(ドナー)については、ステップ2のいずれかの方法で計算された濃度を使用して、4 mLの2×108 スピロヘータ·mL−1を生成するために必要なスターター培養の量を決定します。これにより、回復段階で15 mL中に5 ×10 7 スピロヘータ·mL−1 の最終濃度が得られます(以下のステップ3.6)。
- ステップ3.1で計算した培養量を6,000 x g で10分間遠心分離します。上清をデカントし、ペレットを4 mLの新鮮なBSKに再懸濁します。 最小限のヘッドスペースでサンプルを保持するために、利用可能な最小の滅菌チューブにサンプルを移します。
- ファージ産生を誘導するために、4mLの培養容量に基づく推奨濃度(表3)に適量の誘導剤を添加します。チューブにしっかりと蓋をして、よく混ぜます。
- サンプルを33°Cで2〜4時間インキュベートします。
- インキュベーション後、サンプルを15 mL遠沈管に移します。サンプルを6,000 x g で10分間遠心分離します。上清をデカントします。
- 細胞ペレットを15 mLの1x BSKに再懸濁します。
注:ファージの誘導後、形質導入アッセイを進めるには2つの異なる方法があります。これらのメソッドは、 図 1 と手順 4 と手順 6 に示されています。
4.ドナーを誘導剤に曝露した後の共培養中の形質導入(図1A)
注:このプロトコルは、ファージ産生株(ドナー)が特定の抗生物質に対して耐性を持ち、形質導入される株(レシピエント)が別の抗生物質に対して耐性を持っている場合にのみ使用できます。
- 上記のステップ1のドナー株について説明したように、形質導入アッセイにおいてレシピエントとして使用する B.ブルグドルフェリ 培養物を調製する。ステップ2のように決定された密度に基づいて、1×10個の7 スピロヘータ・mL−1を15mL生成するのに必要な容量を計算します。
- ステップ4.1で計算した培養量を6,000 x g で10分間遠心分離します。上清をデカントします。
- ステップ3.6(ファージドナーを再懸濁)から1mLの培養物にペレットを再懸濁する。再中断されたレシピエントをドナーと一緒にカルチャに追加します。抗生物質を補給しないでください。両方の培養物を含む総容量は15mLです。
- 33°Cで72〜96時間インキュベートします。
- ステップ7に記載されるように共培養後に固相プレーティングによる形質導入体の選択を行う。
5.形質導入アッセイで使用するファージを回収するためのポリエチレングリコール(PEG)沈殿
注:このプロトコルは、ファージ産生株(ドナー)が特定の抗生物質に対して耐性を持ち、形質導入される株(レシピエント)が抗生物質耐性を持たないか、別の抗生物質に対して耐性がある場合に使用できます。
- ステップ3.6の培養物に 、表2に示す濃度の適切な抗生物質を補充します。サンプルを33°Cで72〜96時間インキュベートします。
- PEG沈殿のための溶液を調製する。
- 500 mLの5 M NaClを調製します。オートクレーブ滅菌し、冷ましてからご使用ください。室温で保管してください。
- 200 gのPEG8000を400 mLの水に溶解して、500 mLの40%PEGを調製します。溶液がよく混ざるまで攪拌しながら穏やかに加熱する。水で容量を500 mLまで上げます。PEG8000を完全に溶解して溶液を滅菌するには、溶液をオートクレーブして冷却してから使用してください。室温で保管してください。
- 100 mLの懸濁培地(SM;100 mM NaCl、10 mM MgSO4、および50 mM Tris-HCl [pH 7.5])を調製します。オートクレーブ滅菌で滅菌します。4°Cで保存してください。
- ド ナーB.ブルグドルフェリ クローンからのファージのPEG沈殿(ステップ3.6から)の場合、72〜96時間のインキュベーション後、サンプルを8,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。
- 上清を清潔な50mLコニカルチューブにデカントします。セルペレットを廃棄します。5 M NaClを最終濃度1 Mまで加えます。室温で1時間穏やかに揺ります。
- サンプルを8,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を清潔な50mLコニカルチューブにデカントします。ペレットは小さいか存在しない可能性があります。40%PEG8000溶液を最終濃度10%になるまで上清に加える。よく混ぜて、氷の上に1時間以上一晩置きます。
注:より長い時間は、ファージ回収の有意な増加と相関していないようです。 - サンプルを8,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ファージ粒子を含むペレットを失うことなく、できるだけ多くの余分な液体を取り除きます。
- ペレットを最小量のSMに再懸濁し、SMを使用してボトルの側面を洗い流し、潜在的なファージ粒子を収集します。推奨される比率は、元の上清10 mLあたり400 μLのSMですが、ペレットのサイズによっては、完全な再懸濁に多かれ少なかれSMが必要になる場合があります。
- 回収したファージサンプルを、再懸濁液の量に基づいて等量のクロロホルムで処理します。サンプルをよく混合し、8,000 x g で10分間遠心分離します。水性(最上)層をきれいなチューブに移し、厚い界面層を避けます。
注:φBB-1は非エンベロープバクテリオファージであり、クロロホルム処理の影響を受けません25。このステップは、膜結合構造(すなわち、細胞またはブレブ)をさらに破壊し、潜在的な細胞汚染物質を殺すために行われます。クロロホルムは揮発性有機物であり、換気の良いドラフトでのみ使用してください。クロロホルムを含む物質は有機廃棄物として廃棄してください。 - 最初のクロロホルム処理後に回収された容量を決定し、その容量の10%に等しい量のクロロホルムでサンプルを再度処理します。よく混合し、8,000 x g で10分間遠心分離します。水性(最上)層を除去し、界面または有機層のいずれかを避けるように注意する。水層をきれいなチューブに移します。
- ファージを直ちに使用するか(ステップ6に記載)、4°Cで保存してください。
注:φBB-1ファージサンプルの凍結は推奨されません。φBB-1の4°Cでの安定性は厳密には調べられていませんが、回収後最大1ヶ月間4°Cで保存されたサンプルは、形質導入アッセイで成功裏に使用されています。
6. φBB-1のPEG沈殿後の形質導入アッセイ(図1B)
- 上記のステップ1のドナー株について説明したように、形質導入アッセイでレシピエントとして使用する B.ブルグドルフェリ 培養物を調製する。ステップ2のように決定された密度に基づいて、10個のスピロ ヘータ×mL−1を15mL生成するために必要なレシピエントの培養量を計算します。
- ステップ6.1で計算した培養量を6,000 x g で10分間遠心分離します。上清をデカントし、ペレットを14.5 mLの新鮮なBSKに再懸濁します。
- ≤500 μLのPEG沈殿ファージサンプル(ステップ5から)をレシピエントクローンの培養液に加えます。よく混合し、33°Cで72〜96時間インキュベートします。
注:PEG沈殿中に回収されるファージの量は、いくつかの要因に応じて変動する可能性があります。しかしながら、誘導 されたB.ブルグドルフェリ 株CA−11.2Aの15mL培養物から、500μLは典型的には50〜1,000個の生菌ファージ28を含有する。ファージ回収量≥500μLは、おそらくSMとBSKの比率の増加により、 B.ブルグドルフェリ の増殖に悪影響を及ぼします。 - ステップ7に記載されるようにPEG沈降ファージと混合した後に固相プレーティングによって形質導入体の選択を行う。
7. 形質導入剤の選定
注:潜在的な形質導入剤の固相メッキは、Samuels15によって最初に記述されたプロトコルの単層変更を使用して実行されます。 B. burgdorferi コロニーは寒天内で増殖するため、固相プレーティングによる形質導入剤の選択には、プレートを注ぐ間にサンプルを培地に添加する必要があります。96ウェルプレートにおける希釈法を用いる形質転換体の選択のための代替方法も、以前に記載されている35。この技術は形質導入体の選択にも有効かもしれないが、この目的のためにはまだ試みられていない。
- 形質導入アッセイおよびプレーティングするコントロールからのサンプル数に基づいて、形質導入剤の選択に必要なプレート数を決定します。
注:通常、サンプルごとに2つのプレートが注がれ、1つは培養量の約10%に相当し、もう1つは残りの培養液を含みます。さらに、ドナーおよびレシピエントとして使用されるファージ調製物および/または親クローンが、選択中に使用された抗生物質の存在下で増殖しないことを個別にテストするためのネガティブコントロールとして機能するポアプレート。少なくとも2つの余分なプレート用のメッキ材料を準備することもお勧めします。たとえば、めっきするサンプルとコントロールの数が8の場合、10枚のプレートに十分なめっきミックスを準備します。 - 以下に説明するようにめっき用の溶液を調製する。
注:各プレートは30 mLで、メッキ用の1.5x BSK20 mLと2.1%アガロース(2:1の比率)10 mLで構成されます。これにより、最終濃度が1x BSKおよび0.7%アガロースのプレートが得られます。例えば、10枚のプレートの場合、200 mLの1.5x BSKと100 mLの2.1%アガロースからなる300 mLの総メッキミックスを調製します。- 表1の1.5x BSKについて記載されている各成分の量を使用して、ステップ1.1で1x BSKについて説明しているように、1.5x BSKを1 L準備します。1x BSKの説明に従って保存します。
- 2.1%アガロースを水とオートクレーブで調製します。新鮮なアガロース溶液を使用するか、室温で保存してください。室温で保管する場合は、めっき前に完全に溶融するまで蓋をした状態で電子レンジで加熱します。
- 適切な濃度を達成するために必要な抗生物質の量を決定します(表2)全体のメッキミックスに基づいて。
注:最終めっき液の総量が300 mLの場合は、200 mLの1.5x BSKと十分な抗生物質を混合して、300 mL全体が正しい最終抗生物質濃度になるようにします。形質導入アッセイのドナーとレシピエントの両方が異なる抗生物質耐性遺伝子を持っている場合、プレーティングミックスには両方の抗生物質が含まれている必要があります。ドナーからのPEG沈殿ファージ(ステップ5で調製)が抗生物質耐性マーカーをコードし、レシピエントが抗生物質耐性マーカーをコードしていない場合、プレーティングミックスには抗生物質を1つだけ含める必要があります。
- 注ぐプレートの数に基づいて、適切な量の1.5x BSKと抗生物質を、メッキ混合物全体を保持するのに十分な大きさの滅菌ボトルに移します。56°Cの水浴中で≥15分間平衡化します。
- オートクレーブまたはマイクロ波から採取した溶融アガロースを56°Cの水浴中で≥15分間平衡化します。
- 平衡化後、決定した量の2.1%アガロースを1.5x BSK(抗生物質を含む)とともにボトルに加え、めっき液を42°Cの水浴に10〜15分間戻します。
注意: 高温はスピロヘータを損傷または殺す可能性があります36。上記と同じウォーターバスを使用する場合は、平衡化のタイマーを開始する前に、ウォーターバスを42〜45°Cに冷却してください。めっき液を42°Cで20分以上平衡化させないと、プレートを注いで固まり始めます。 - 平衡化中に、めっきする B.ブルグドルフェリ サンプルを準備します。めっきする量を滅菌済みの50 mLコニカル遠心チューブに移します( 材料の表を参照)。
- 1.5 mL(最終的な30 mLプレート容量の<5%)未満の量をめっきする場合は、サンプルを新しいチューブに移し、めっき中にめっき混合物をサンプルに直接追加します。
- 大容量の場合は、必要な量の培養液を新しいチューブに移し、室温で6,000 x g で10分間遠心分離します。上清の100〜500 μLを除くすべてをデカントし、残りを使用してペレットを完全に再懸濁してからめっきします。
- 共培養後のコントロールプレートの場合、ドナーまたはレシピエントクローンの≥107 細胞を滅菌50 mLコニカル遠心チューブに追加します。容量が1.5 mLを超える場合は、ステップ7.6.2と同様にペレットを遠心分離して再懸濁します。PEG沈殿ファージを用いて形質導入アッセイを行った場合、レシピエントクローンに加えて、100〜250μLのファージサンプルを滅菌済みの50mLコニカルチューブに入れてめっきします。
- めっき液が42〜45°Cで10〜15分間平衡化した後、30mLのめっき液を適切なサンプルの入ったチューブに移します。すぐにメッキミックスとサンプルをラベル付きプレートに分注します。めっきするサンプルごとに新しいピペットで繰り返します。
- プレートを15〜20分間固化させてから、5%CO2を添加した33°Cのインキュベーターに入れます。注いだ後、少なくとも48時間はプレートを反転させないでください。
- レシピエントクローンのバックグラウンドに応じて、10〜21日間のインキュベーション後に、選択プレート上のアガロース内にコロニーが現れることを確認します。滅菌綿栓5.75ホウケイ酸ピペット( 材料の表を参照)を使用して、両方の抗生物質の存在下でプレート上で成長する少なくとも5〜10個のコロニーを選び、適切な抗生物質を含む1xBSKの1.5mLに接種します。
- 接種したコロニーをステップ1.3のように33°Cで3〜5日間、または暗視野顕微鏡を使用して20倍の倍率でフィールドあたり約20〜40スピロヘータの密度に達するまで成長させます。
注:スクリーニング後(ステップ8を参照)、0.22 μmフィルターでろ過滅菌した60%グリセロールと40%1x BSKの混合物と等量の培養液を混合することにより、スピロヘータを-80°Cで長期保存するために凍結できます。
8. 潜在的な形質導入剤の検証
注:2つの抗生物質の存在下でプレート上で増殖するクローンをスクリーニングして、予想される(レシピエント)バックグラウンドで真の形質導入剤を表していることを確認します。これらの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応による特定の領域の増幅、および潜在的にシーケンシングに基づいています。 B. burgdorferi でPCRを行う詳細なプロトコルおよび実施方法は、他の場所に記載されている(最近の例については、Seshu et al.37を参照されたい)。使用する菌株に基づいて形質導入体のスクリーニングに使用するプライマーを選択します。形質導入体のスクリーニングにアプローチする方法に関するいくつかの提案を以下に記載する。
- PCRスクリーニングのために B.ブルグドルフェリ 溶解物を調製します。
注:次のプロトコルを使用して、ステップ7.9のように増殖した培養細胞から洗浄 したB.ブルグドルフェリ 溶解物を生成し、PCRによるDNAの即時分析を行います。この方法は、BSKにおける潜在的な阻害剤の干渉を最小限に抑えるように設計されていますが、シーケンシングまたは保存用の高品質のDNAを製造するには推奨されません。そのためには、全ゲノム抽出用のプロトコルまたはキットを使用してください( 材料表を参照)。親クローン(ドナー株とレシピエント株の両方)からのライセートも、各分析に含めるために同時に調製することを強くお勧めします。- 選択した各潜在的な形質導入体500 μLを、ステップ7.10と同様にクリーンなマイクロ遠心チューブに移して培養します。
- 培養液を室温で8,000 x g で10分間遠心分離します。
- 上清を除去し、各ペレットを500 μLのTE(10 mM Tris Cl、pH 8.0; 1 mM EDTA、pH 8.0)に再懸濁します。室温で8,000 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、各ペレットを50 μLのPCR品質の水に再懸濁します。サンプルを10分間煮沸します。それらを短時間冷ましてから、室温で8,000 x g で10分間遠心分離します。
- 各PCRについて、遠心分離したサンプルの上部から2 μLを直ちに使用します。ペレットを乱さないでください。
- PCRを使用して、抗生物質耐性をコードする特定の遺伝子の潜在的な形質導入物質をスクリーニングします。形質導入アッセイで一般的に使用される抗生物質耐性マーカーをスクリーニングするためのプライマーについては 、表4 を参照してください。
注:私たちの経験ではまれですが、 B.ブルグドルフェリ の異種DNAの選択に使用されるアミノグリコシド抗生物質への自然突然変異が発生する可能性があります。 - 別の株またはクローンマーカーを使用して潜在的な形質導入物質をスクリーニングし、バックグラウンドがレシピエントのバックグラウンドであることを確認します。これらの分析には、ドナーとレシピエントの両方の親クローンを含めます。使用した菌株と、菌株の完全性を決定するための個々のラボプロトコルに基づく配列を使用して、菌株特異的マーカーをスクリーニングします。
- ダニベクターまたは哺乳類宿主内で使用するために、または別のクローンとの直接比較のために毒性クローンに形質導入を試みる場合は、形質導入体および親クローンの完全なプラスミド含量を決定する。これは、他の場所に記載されているように、比較株と同じプラスミド含量、または風土病サイクル内の増殖に必要な遺伝的要素の存在を保証するために行われます18、19、37、38、39。
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Representative Results
より容易に形質転換可能なB. burgdorferi株または電気変換に抵抗性のあるクローン間でDNAを移動するためのバクテリオファージの使用は、ライム病の決定要因の継続的な分子調査のための別のツールを表しています。本明細書に記載される形質導入アッセイは、潜在的な形質導入物質の選択のために1つまたは2つの抗生物質のいずれかを使用して、目的の任意のクローン間のDNAの移動を容易にするために必要に応じて改変することができる。高継代株CA-11.2Aクローンと高継代株B31クローンおよび低継代毒性株297の両方との間のプロファージDNAと異種大腸菌/B.ブルグドルフェリシャトルベクターの両方の形質導入が以前に実証されています28。以下に示す結果は、2つの高継代病原性クローン間のプロファージDNAの移動を示しています。ドナークローンc1673は、プロファージDNA27,28上のカナマイシン耐性遺伝子をコードするB.ブルグドルフェリ株CA-11.2Aクローンである。レシピエントは、c1706と呼ばれるB.ブルグドルフェリ株B31のクローンであり、染色体28上のゲンタマイシン耐性マーカーをコードしています。形質導入アッセイは、図1Bに例示されるように実施した。5%エタノールに曝露されたc1673の上清から回収したPEG沈殿ファージを、プロトコルのステップ6に記載されるようにc1706と混合した。
エタノール曝露されたc1673(カナマイシンに対する耐性をコードする)の上清からPEG沈殿によって回収されたファージの約20%をc1706(ゲンタマイシンに対する耐性をコードする)と混合した後、混合物を両方の抗生物質の存在下で播種した。カナマイシンとゲンタマイシンの両方の存在下で増殖することができるコロニー形成単位(CFU)は、形質導入事象の指標となる(図2)27,28。CFUの数は、最初のレシピエント細胞あたりの形質導入頻度として報告されます。この代表的な実験では、ファージを1×107レシピエント細胞とインキュベートした後に約275の形質導入体を回収し、レシピエント細胞あたり2.75 × 10-5 CFUの形質導入頻度をもたらしました。
潜在的な形質導入体の回収に続いて、カナマイシンおよびゲンタマイシン耐性をコードする遺伝子のPCR増幅を、 図3に示す2つの代表的なサンプルを用いて、10個のクローンで行った。カナマイシン耐性遺伝子は、ドナー(c1673)および潜在的な形質導入物質から増幅される可能性がありますが、レシピエント(c1706)からは増幅できませんでした。同様に、ゲンタマイシン耐性遺伝子は、レシピエント(c1706)および潜在的な形質導入体から増幅される可能性がありますが、ドナーからは増幅されません。したがって、回収されたクローンは、抗生物質耐性遺伝子の両方を特異的にコードし、自然変異体ではなく形質導入事象を表す。
カナマイシン耐性カセットがドナーからレシピエントにφBB−1によって形質導入されたことを実証するために、形質導入体のバックグラウンドを、前述のように株特異的マーカーを用いて決定した28。これは、形質導入体が形質導入の共培養法によって生成された場合に特に重要です。簡単に説明すると、以前に公開されたプライマー28 を使用して、さまざまなボレリアプラスミドの特定の領域を増幅し、クローンのバックグラウンドを同定するために使用できるプロファイルを生成しました(図4)。CA-11.2Aバックグラウンドのc1673クローンは特定のアンプリコン4、5、および6をエンコードしますが、高継代B31バックグラウンドを持つc1706はエンコードしません。同様に、2つのトランスダクトにはアンプリコン4、5、および6がありません。したがって、これらのクローンは、C1706バックグラウンドを有し、C1673からカナマイシン耐性遺伝子を獲得している。
| コンポーネント | 1x BSK (培養用) (1 L) | 1.5x BSK (メッキ用) (1 L) |
| ウシ血清アルブミン(画分V) | 35グラム | 52.5 グラム |
| 10x CMRL-1066 (L-グルタミンなし) | 8グラム | 12グラム |
| ネオペプトン | 4グラム | 6グラム |
| 酵母ート | 1.6 グラム | 2.4 グラム |
| ヘペス | 4.8 グラム | 7.2 グラム |
| グルコース | 4グラム | 6グラム |
| クエン酸ナトリウム | 0.56 グラム | 0.84 グラム |
| ピルビン酸ナトリウム | 0.64 グラム | 0.96 グラム |
| N-アセチルグルコサミン | 0.32 グラム | 0.48 グラム |
| 炭酸水素ナトリウム | 1.76 グラム | 2.64 グラム |
| 熱不活性化正常ウサギ血清(INRS) | 66ミリリットル | 99ミリリットル |
表1:形質導入アッセイのためのB.ブルグドルフェリクローンの培養および選択のためのBSK。B. burgdorferiを培養するための1x BSKおよびB. burgdorferiクローンの固相選択のための1.5x BSKの製剤化および調製は、Samuels15に基づいている。B. burgdorferiの増殖を支持するBSK(またはMKP)37,40,41の異なる製剤は、形質導入アッセイを用いてまだ試験されていない。
| 抗生物質 | 在庫集中 | Bbの培養液中の最終濃度 |
| カナマイシン | 100 mg.mL-1 (水中) | 200-400 μ g.mL-1 |
| ゲンタマイシン | 50 mg.mL-1 (水中) | 50 μ g.mL-1 |
| ストレプトマイシン | 50 mg.mL-1 (水中) | 50 μ g.mL-1 |
| エリスロマイシン | 2 mg.mL-1 (EtOH) | 0.06 μ g.mL-1 |
表2:B. burgdorferiの異種DNAの選択と維持に使用される可能性のある抗生物質と濃度。このリストは、ボレリア・ブルグドルフェリ42,43,44,45で一般的に使用されている現在の抗生物質耐性マーカーに基づいています。カナマイシン、ゲンタマイシン、およびストレプトマイシンは水中で調製され、0.22 μMフィルターでろ過滅菌され、-20°Cで保存されます。 エリスロマイシンは95%エタノール中で調製され、−20°Cで保存される。 多くの研究所は、200μg・mL−1の濃度での選択のためのカナマイシンの使用に成功したと報告しています。形質導入アッセイでの選択にゲンタマイシンとカナマイシンの両方を使用する場合、400μg・mL−1カナマイシンが使用されます。aadA遺伝子は、ストレプトマイシンとスペクチノマイシン44の両方に耐性を与えます。EにaadA遺伝子を含む構築物の選択のための。 大腸菌、100μg・mL−1スペクチノマイシンを使用する。アミノグリコシド(カナマイシン、ゲンタマイシン、およびストレプトマイシン)は、ライム病の治療に臨床的に関連していないことに注意してください。しかしながら、エリスロマイシンは特定の状況で臨床的に使用される46。B. burgdorferiにおけるこの抗生物質に対する自然な耐性が報告されていますが47、この耐性マーカーは、ここで報告された形質導入アッセイではこれまで使用されていません。.
| 誘導剤 | 原液濃度(溶剤) | サンプル中の最終濃度 |
| エタノール | 100% (なし) | 5% |
| マイトマイシンC | 2 mg.mL-1 (水) | 20 μ g.mL-1 |
| 1-メチル-3-ニトロソニトログアニジン | 50 mg.mL-1 (DMSO) | 10 μ g.mL-1 |
表3:B.ブルグドルフェリからのφBB-1の誘導に使用される潜在的な誘導剤および濃度。N-メチル-N′-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)、マイトマイシンC、エタノール、メタノール、イソプロパノールはすべて、B.ブルグドルフェリ株CA.11-2A 25,26,28において構成レベルを超えてφBB-1を誘導することが実証されています。MNNGは発がん性物質および環境ハザードの疑いがあります。注意して使用し、可燃性溶剤に溶解し、焼却して廃棄してください。マイトマイシンCは発がん性の疑いがあり、潜在的な環境ハザードです。化学ヒュームフードの下で注意して使用し、適切に廃棄してください。公表されたデータは、MNNGがφBB-126を誘導するための最も効果的な薬剤であることを示唆していますが、この化学物質を扱うことの危険性とそれを取得することの難しさは、特に学生にとって、その使用を複雑にします48。エタノールによる誘導は、メタノールまたはイソプロパノール28を用いた場合よりも一貫して優れており、形質導入アッセイにおいて最も一般的に使用されている。
| 遺伝子名または指定 | 抗生物質耐性 | 参考 | プライマー名 | プライマー配列(5 ́〜3 ́) | |||
| Tn903からのカンR | カナマイシン | 42 | カンR 382F | CGGTTGCATTCGATTCCTGT | |||
| カンR 684R | GGCAAGATCCTGGTATCGGT | ||||||
| aacC1 | ゲンタマイシン | 43 | aacC1 166F | ACCTACTCCCAACATCAGCC | |||
| aacC1 497R | TCTTCCCGTATGCCCAACTT | ||||||
| アーダ | ストレプトマイシン | 44 | aadA 273F | TGTGCACGGACGACATCATTC | |||
| aadA 594R | TACTGCGCTGTACCAAATGC | ||||||
表4:抗生物質耐性マーカーの形質導入の予備分析に用いたプライマー。 ここに示すプライマーは、形質導入アッセイで一般的に使用される抗生物質耐性遺伝子を検出するためのものです。これらのプライマーは、92°Cで15秒間変性、56°Cで15秒間のプライマーアニーリング、72°Cで30秒間のターゲットDNA伸長の28サイクルを繰り返したPCRで使用されます。
図1:DNAのファージ媒介運動(形質導入)をモニタリングするための形質導入アッセイ。 形質導入アッセイは、(A)共培養法または(B)PEG沈殿により培養上清から回収したファージのいずれかを用いて行うことができる。共培養法(A)では、φBB-1によって形質導入されるDNA上の抗生物質耐性遺伝子をコードする誘導B .ブルグドルフェリ クローン(ドナー)(緑丸)を、染色体または他の安定な遺伝要素(赤丸)上の第2の抗生物質耐性遺伝子をコードする非誘導 B.ブルグドルフェリ クローン(レシピエント)とともに培養する。この方法では、2つの異なる抗生物質耐性マーカー(この例では、カナマイシンおよびゲンタマイシン耐性をコードする遺伝子)の使用が必要である。形質導入アッセイ(B)において精製ファージを使用するために、誘導されたドナーからの上清のPEG沈殿によって回収されたファージ粒子は、レシピエントと混合される。2つの異なる抗生物質を用いてここに示すが、この方法は、以前に実証されたように、φBB-1プロファージDNA上にコードされた1つの抗生物質耐性マーカーのみを用いて行うことができる27。インキュベーション後、形質導入剤は、両方の抗生物質の存在下で固相プレーティングによって選択されます。ファージDNAにコードされた抗生物質耐性マーカーを1つだけ使用してメソッド B を使用する場合、固相プレーティング中にその抗生物質のみを使用して選択が行われます。形質導入剤には、抗生物質耐性マーカーの両方が含まれ、レシピエントの背景があります。この図は、オックスフォード大学出版局の許可を得て、Eggers et al.28 から転載されています。モデル化された実験では、c1673とc1650は2つの異なるCA-11.2Aクローンを表します。c1673はカナマイシン耐性をコードするφBB−1プロファージを担持し、c1650は非ファージ位置28においてゲンタマイシン耐性マーカーをコードする。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:形質導入アッセイに続く固相プレーティングによって選択されたコロニー形成単位。 c1673由来のファージとc1706の混合後に両方の抗生物質の存在下で増殖するコロニーは、潜在的な形質導入物質を表す。個々のドナーおよびレシピエントクローンまたはファージ調製のサンプル(図示せず)を含む対照プレート上でコロニーを増殖させるべきではない。元のサンプル中の生産ファージの最小数は、CFUの数を数え、希釈係数を掛けることによって決定できます。この場合、ドナーの15mL培養物からPEG沈殿したファージサンプルの20%が約275コロニーをもたらした。したがって、PEG沈殿によって回収された生産的ファージの元の濃度は、 ≥1.3 ×10 3 ビリオンであった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:2つの潜在的な形質導入物質からのカナマイシン耐性とゲンタマイシン耐性を付与する遺伝子のPCR増幅。 カナマイシン耐性遺伝子およびゲンタマイシン耐性遺伝子(表4)のプライマーを用いたPCRを行い、2つのコロニー(形質導入体1および形質導入体2)から生成されたライセートをスクリーニングした。これらのコロニーは、c1673(ドナー)およびc1706(レシピエント)の混合に続いてカナマイシンおよびゲンタマイシンの両方を含むプレート上で選択された。アンプリコンは、1xトリスアセテート-EDTA(TAE)バッファー中で120 Vで60分間電気泳動した1%アガロースゲルで分離し、0.5 μg·mL-1 臭化エチジウムで染色しました。数字はキロ塩基対のサイズマーカーを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:形質導入剤のバックグラウンドの確認。 前述のように、c1673、c1706、および2つの形質導入体から特定の遺伝的要素の領域を増幅し、形質導入体のバックグラウンドがレシピエントクローンc1706のバックグラウンドであることを確認しました。選択された領域は、 B. burgdorferi 型株B316内の特定の直鎖または環状プラスミド(それぞれlpまたはcp)上の遺伝子配列に基づいていました。1 = BBA60 (lp54), 2 = BBB19 (cp26), 3 = BBE22 (lp25), 4 = BBG13 (lp28-2), 5 = BBI28 (lp28-4), 6 = BBK12 (lp36), 7 = BBS41 (cp32), および 8 = fla 遺伝子 (染色体)。アンプリコンを1%アガロースゲルで分解し、1x TAEバッファー中120 Vで60分間電気泳動し、0.5 μg·mL−1 エチジウムブロマイドで染色しました。数字はキロ塩基対のサイズマーカーを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
形質導入の使用は、B. burgdorferi 1,4,13,37の電気変換に関連する生物学的および技術的障壁の少なくともいくつかを克服する1つの方法を表すことができる。多くの系において、バクテリオファージは、一般化形質導入または特殊化形質導入のいずれかによって、細菌細胞間で宿主(非プロファージ)DNAを移動させることができる22、23、24、49、50。特殊な形質導入では、いくつかの宿主遺伝子が常にプロファージDNA49,50とともにファージキャプシド内にパッケージ化されています。例えば、φBB-1は、プラスミド上でファージゲノムであるcp32の部分に密接に関連しているため、細菌起源のcp32の部分を常にパッケージ化します。一般化された形質導入において、バクテリオファージのパッケージング機構は、相同な非ファージ配列にラッチし、ファージDNAの代わりにランダム宿主DNAを「偶然に」パッケージングすると考えられている。これらのDNA片は、次に別の細胞49,50に導入することができる。B. burgdorferiのファージによる一般化された形質導入についてはまだほとんど知られていません。しかし、よりよく特徴付けられた細菌系では、細胞から放出されるバクテリオファージの1%がファージDNAの代わりにランダムな細菌遺伝子を含む可能性があります51。これまでのところ、染色体マーカーが異なるB. burgdorferiクローン間で形質導入されることは観察されていないが、cp32と小さな異種シャトルベクターの両方がφBB-1によってパッケージングおよび形質導入され得るという事前の実証は、このファージが特殊化形質導入と一般化形質導入の両方に関与し得ることを示している28。したがって、実験室での形質導入のユースケースが提案されており、染色体変異を生成する電気変換は依然として目的のバックグラウンドで行われています。しかし、トランスにおける相補のためのシャトルベクター、または電気変換に抵抗する株へのレポーターコンストラクトを使用した発現研究のためのシャトルベクターの導入は、より形質転換可能な高継代クローンと形質転換性の低い株との間の形質導入を介して行うことができます。将来の研究が染色体遺伝子座をパッケージ化して移動させるφBB−1の能力を実証する場合、本明細書に記載の方法は、より容易に形質転換可能な株と他の方法では電気形質転換が困難な株との間で改変染色体DNAを移動させるのにも有用であることが証明され得る。cp32様プラスミドは、すべてのB.ブルグドルフェリ株および他のライム病スピロヘータの大部分に広まっています52,53;また、B. mayonii、B. miyamotoi、および再発熱を引き起こすものを含む他のボレリア種のホモログの証拠もあります54,55,56。他のボレリア種のホモログもプロファージであるかどうかはまだわかっていませんが、もしそうなら、形質導入はこれらの種の分子解剖のためのツールにもなり得ます。
ここでは、DNAを形質導入するための2つの方法が提示されています:選択前にドナーとレシピエントのクローンを一緒に共培養する方法(図1A)またはドナーからのPEG沈殿ファージとレシピエントのみの混合(図1B)。レシピエント細胞あたりの形質導入イベント数は、PEG沈降ファージ28を使用した場合よりも共培養後に多くなりますが、共培養では、ドナーとレシピエントの両方が異なる抗生物質耐性マーカーを持っていること、および潜在的な形質導入物質のバックグラウンドを注意深くスクリーニングする必要があります。φBB-1プロファージはボレリア52,53に遍在しているため、活発に増殖するクローンを混合すると、抗生物質耐性マーカーまたは他の異種DNAがレシピエントからドナーに移動する可能性があります(意図したようにドナーからレシピエントへではなく)。形質導入アッセイでPEG沈殿ファージを使用すると、ドナーがファージ/レシピエントミックスに存在しないため、この可能性がなくなります。さらに、ファージとそのゲノム内容物を分析(すなわち、構造解析、定量、パッケージ材料の同定など)および形質導入の両方に使用する場合は、ファージのPEG沈殿が必要です。これらの利点にもかかわらず、PEG沈殿ファージを使用することには潜在的な欠点があります。共培養の場合ほど多くの形質導入剤を生成しないことに加えて、PEG沈殿は時間がかかり、重大なファージ損失につながる可能性があり、下流のアプリケーションを妨害する可能性のある汚染物質を含むサンプルをもたらします57,58。
形質導入は、これまでに3つのB. burgdorferi株、CA-11.2A、高継代B31クローン、および低継代297クローン28から実証されています。これら3つのうち、B.ブルグドルフェリ株CA-11.2Aは、誘導後に最も多くのファージを産生します25,26,28;しかし、誘導後も、B. burgdorferiから回収されたファージの数は、コリファージλ25,28,59などのより特性の良いシステムで回収されたファージよりも桁違いに少ない。したがって、PEG沈殿後のファージの共培養または混合のいずれかを介した形質導入の使用において生じる可能性のある1つの問題は、誘導剤にさらされた場合でも、B.ブルグドルフェリから放出される少数のバクテリオファージである。さらに、ファージ産生におけるバッチ間のばらつきは、すべての条件、培地成分、および方法が実験間で一貫しているように見える場合でも、有意です。このため、所与のクローンから、または所与の条件下で少なくとも最小数のファージが産生されることを決定することが重要である。サンプル中のファージ数を決定するための従来のアッセイでは、ファージを含む少量のサンプルを、バクテリオファージが溶解している許容細菌宿主と混合する必要があります。サンプル中の産生ファージ粒子の数は、そのバックグラウンドで発生する溶解事象の数によって決定され、細菌60,61の芝生上にプラークが形成される。ファージの数はプラーク形成単位(PFU)として報告される61。プラークアッセイを使用して誘導後に放出される生産的なφBB-1の数を定量化することは、密集した芝生でボレリア・ブルグドルフェリを成長させることができず、φBB-1の溶解複製サイクルと溶解複製サイクルの間の切り替えを制御するメカニズムの現在の理解の欠如によって妨げられています。実際、B. burgdorferiの溶解培養物の事例報告は数多くありますが、これまでのところ、培養物全体の溶解の観察とファージの産生を相関させる研究は発表されていません。経験から、所与の培養物中の少数の細胞のみが、おそらく溶解によってファージを自発的に産生するようであり、この産生は、既知の誘導剤への曝露によってのみわずかに増加することができる25,28,62。したがって、プラークアッセイは現在、B. burgdorferi由来のφBB-1を定量することはできない。
B. burgdorferiの誘導後に産生される生産的ファージの数を定量化するために、このレポートに記載されている形質導入アッセイは、バクテリオファージによってパッケージされたものとは異なる抗生物質を含む許容性B.ブルグドルフェリクローンを使用して実行できます。このアッセイは、形質導入から生じるコロニーをもたらし、各コロニーは確認されたファージを表す。したがって、サンプル中のファージの最小数は、PFUではなくCFUとして報告することができます。この数は、PEG沈殿(使用する場合)によるファージの回収、ファージによるDNAの付着と注入、およびB. burgdorferiの固相プレーティングに固有の非効率性のために、産生されるファージの実際の総数よりも(はるかに)少ない可能性があります。
B. burgdorferi培養の上清中のプロファージDNAの総量を決定する方法の1つは定量的PCR(qPCR)ですが、B. burgdorferi由来のcp32 DNAのqPCRプロトコルは文献によく表されておらず、qPCRはまだこの目的のために広く使用されている方法論ではありません。 所与のサンプル中に少なくとも中程度のレベルのファージDNAが存在することを定性的に決定するために、抽出前のDNase処理後のB.ブルグドルフェリ培養物のPEG沈殿上清から全DNAを抽出することができます。ファージDNAは、無傷のファージキャプシド25によって保護されます。回収されたDNAはアガロースゲルで分解され、DNA染色で視覚化されます。このプロトコルは、典型的には、ファージヘッド25内にパッケージされた線状DNAを表すかすかな30kbバンドを生じる。染色の感度およびマーカーに対する正しいサイズのファージDNAバンドの強度に基づいて、回収された総ファージのおおよその数を決定することができる25、27。上清から回収された総ファージDNAのレベルと形質導入アッセイ後に回収された形質導入体の数との強い正の相関が以前に実証されている28。
ドナー株とレシピエント株の選択は、分子ツールとしての形質導入の使用を成功させるために重要です。φBB-1のプロファージとしてのcp32sの理解は、ライム病スピロヘータ52,53におけるcp32sの普及性と、個々のB.ブルグドルフェリ細胞がこれらのプラスミドの複数のホモログを含むことができるという事実の両方によって複雑になります。細胞内のすべてのcp32は、調べられたファージ産生株のファージヘッド内にパッケージされているようです27。ただし、cp32を含むすべてのB.ブルグドルフェリ株がバクテリオファージを産生できるかどうかは明らかではなく、使用前にこの能力について菌株をテストする必要があります。.同様に、特定の株がφBB-1によって形質導入されることを可能にする受容体については何も知られていないが、属全体にわたるプロファージプラスミドの遍在性は、特定の株が形質導入され得る可能性が高いことを示唆している。個々のB. burgdorferi細胞内に複数のcp32プラスミドが存在することから推測されるように、現存するプロファージの存在によって付与されるファージ免疫63はないようです。株CA.11-2A、B31、および297は形質導入アッセイに使用されており、どちらもφBB-127,28によって形質導入することができます。以前の報告では、PEG沈殿ファージ27を使用して限られた数の株にしか形質導入が可能であることが示されていましたが、これまでにテストされたすべての株が共培養法28を使用して形質導入に成功しているため、その方法の技術的な問題による可能性があります。
形質導入アッセイを使用する実験を設計する場合、ドナー株の選択に関する主な考慮事項は、遺伝的背景、エレクトロポレーションを介して容易に形質転換される能力、およびファージを産生する能力であるべきです。すべての株の高継代クローンの網羅的な調査は行われていませんが、CA-11.2A株は誘導がない場合でも検出可能なレベルで構成的にファージを生成します。同様に、B31の継代クローンは、分子研究で一般的に使用される株5と完全に配列決定される最初のB.ブルグドルフェリ株であり、検出可能な量のφBB-1を構成的に生成し、一般に高度に形質転換可能である1,4,25,27,37,64。.調査で他の株が必要な場合は、まずその菌株の高継代クローンをエレクトロポレーションを介して抗生物質耐性マーカーを含むプラスミドを導入して形質転換能を試験し、次にCA-11.2AやB31などの許容レシピエントで形質導入アッセイを実行して形質導入能力を評価することをお勧めします。同様に、レシピエント株またはクローンが形質導入に対して許容性であることを確実にするために、抗生物質に対するプロファージコード耐性を有するCA−11.2Aなどのファージ産生株を目的のクローンと混合して、形質導入が起こることを確実にすることができる。
φBB-1の分子生物学と、特に風土病のサイクルを通過する際のB .ブルグドルフェリ内のHGTにおけるその役割については、まだ多くのことがわかっていません。しかし、実験室内でファージDNAと異種DNAの両方を実験的に形質導入するφBB-1の能力は、 B.ブルグドルフェリ の分子解剖とライム病の病因におけるその役割のための別のツールを追加する機会を提供します。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者は、Shawna Reed、D. Scott Samuels、Patrick Secorの有益な議論と、技術支援を提供してくれたVareeon (Pam) Chonweerawongに感謝したいと思います。この研究は、生物医科学部とクイニピアック大学健康科学部のクリスチャンH.エガーズへの教員研究助成金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| 12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) | USA Scientific | 1450-0810 | holds 4 mL with low void volume (for induction) |
| 15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 5618-8271 | |
| 1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) | Millipore Sigma | CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute | |
| 5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | autoclave prior to use |
| 50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 1500-1211 | |
| Absolute ethanol | |||
| Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
| Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
| Bovine serum albumin (serum replacement grade) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| Chloroform (for molecular biology) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood |
| CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) | US Biological | C5900-01 | cell culture grade |
| Erythromycin | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
| Gentamicin reagent solution | Gibco | 15750-060 | |
| Glucose (Dextrose Anhydrous) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Kanamycin sulfate | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (0.22 µM pore size) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions |
| Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood |
| N-acetyl-D-glucosamine | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| Oligonucleotides (primers for PCR) | IDT DNA | ||
| OmniPrep (total genomic extraction kit) | G Biosciences | 786-136 | |
| Petri Dish (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | HS-3900 | |
| Petroff-Hausser counting chamber cover glass | Hausser scientific | HS-5051 | |
| Polyethylene glycol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | heat inactivate as per manufacturer's instructions |
| Semi-micro UV transparent cuvettes | USA Scientific | 9750-9150 | |
| Sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Streptomycin sulfate solution | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804-500G | sodium citrate for BSK |
References
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
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