Summary
A taxa de filtração glomerular (TFG) é o marcador ideal para avaliar a função renal. No entanto, o método de medição padrão usando injeção de inulina com análise seriada de sangue e urina é impraticável. Este artigo delineia um método prático para medir a TFG por via transdérmica em leitões.
Abstract
A medida transdérmica da taxa de filtração glomerular (TFG) tem sido utilizada para avaliar a função renal em animais conscientes. Esta técnica está bem estabelecida em roedores para estudar lesão renal aguda e doença renal crônica. No entanto, a medição da TFG usando o sistema transdérmico não foi validada em suínos, uma espécie com um sistema renal semelhante ao dos seres humanos. Assim, investigamos o efeito da sepse na TFG transdérmica em suínos neonatais anestesiados e ventilados mecanicamente. A sepse polimicrobiana foi induzida por ligadura e punção cecal (FLP). O sistema de medição da TFG transdérmica, composto por um sensor de fluorescência miniaturizado, foi anexado à pele raspada do porco para determinar a depuração da sinistrina conjugada fluoresceína-isotiocianato (FITC), um marcador de TFG injetado por via intravenosa. Nossos resultados mostram que, às 12 h pós-FLP, a creatinina sérica aumentou com a diminuição da TFG. Este estudo demonstra, pela primeira vez, a utilidade da abordagem da TFG transdérmica na determinação da função renal em suínos neonatais ventilados mecanicamente.
Introduction
Uma avaliação prática e quantitativa da função renal é a medida da taxa de filtração glomerular (TFG), que informa o quão bem os rins filtram o sangue com base no princípio da depuração1. Um método anterior de mensuração da TFG envolve a injeção intravenosa de compostos exógenos, como inulina ou sinistrina, realizando medições seriadas dos níveis plasmático/urinário para detectar sua depuração 2,3. Esse método é complicado, exigindo a coleta seriada de amostras de plasma e urina4. Uma alternativa é a medição de produtos finais metabólicos endógenos, como a creatinina. No entanto, isso é demorado e, às vezes, impreciso, pois não é apenas filtrado pelo glomérulo, mas também secretado pelos túbulos 5,6. Além disso, o nível de creatinina é influenciado pelo sexo, idade, dieta e massa muscular 7,8,9.
Uma medida mais precisa, minimamente invasiva e amplamente utilizada da TFG é o uso de monitores de TFG transdérmicos, que medem a TFG em tempo real em animais 4,10. A sinistrina, um marcador renal exógeno altamente solúvel e livremente filtrado, é marcada com fluoresceína-isotiocianato (FITC). Esse composto conjugado é injetado por via intravenosa, e a função renal em tempo real pode ser avaliada sem a coleta de amostras de sangue e urina11. O uso da medida da TFG transdérmica foi validado em roedores 12, cães13 e gatos14, mas não em suínos.
As espécies suínas compartilham diversas características anatômicas e fisiológicas com o ser humano, tornando-as animais ideais para o estudo de diversas doenças humanas15. O uso de suínos em pesquisas biomédicas translacionais tem se tornado cada vez mais popular e preferido em relação aos modelos de roedores, pois mimetiza a fisiologia e a fisiopatologia humanas16. Os suínos neonatais são de interesse na compreensão dos mecanismos de doenças exclusivas dos pacientes pediátricos17. Além disso, o recente avanço do transplante de órgãos suínos para humanos estimula a ampliação das ferramentas diagnósticas para ensaios pré-clínicos e clínicos 18,19,20,21. Este artigo, pela primeira vez, fornece um guia para o uso do dispositivo transdérmico na medição da TFG em suínos neonatais.
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Protocol
Os procedimentos são escritos de acordo com os padrões nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Tennessee (UTHSC).
NOTA: Os leitões do grupo experimental são submetidos à ligadura e punção cecal, enquanto o grupo simulado só sofre abertura do abdômen sem ligadura ou punção cecal. Leitões em ambos os grupos são mantidos sob anestesia por 12 h após o procedimento para permitir tempo suficiente para que a sepse e a lesão renal aguda (LRA) ocorram no grupo experimental. A medida da TFG transdérmica ocorrerá às 8 h após o procedimento por um total de 12 h.
1. Fornecimento e alojamento dos leitões
- Identifique uma fazenda de suínos local que possa fornecer leitões neonatais com idades entre 3 e 5 dias. Agende a entrega no início da semana para completar a experimentação antes que qualquer leitão tenha mais de 7 dias.
NOTA: O fornecedor forneceu três a cinco leitões às segundas-feiras para esta experiência; na sexta-feira, os leitões teriam sido submetidos ao experimento. Usar o mesmo sexo e idade próxima da mesma idade é essencial para evitar fatores de confusão. - Após a chegada do leitão, certifique-se de que ele tenha uma identificação individual (por exemplo, uma marca auricular e um registro que inclua peso e idade).
- Abrigue os leitões em uma unidade de cuidados com animais de laboratório (LACU) sob os cuidados de um veterinário licenciado. Os animais são alojados como um grupo em um curral espaçoso com um piso de concreto sólido que é facilmente lavado com água para manter um bom saneamento.
- Adicione um móvel, como uma bola pesada, para permitir o enriquecimento e a estimulação ambiental.
- Garantir que o LACU ofereça condições ambientais ideais, incluindo os seguintes elementos-chave: saneamento, nutrição, controle de temperatura, ventilação e ciclo dia-noite, controlando a iluminação.
- Peça ao veterinário que verifique o leitão diariamente, incluindo a medição do peso, para informar o investigador se algum leitão parecer doente, o que pode exigir a exclusão da experiência.
- Deixe os leitões por pelo menos 1 dia para se aclimatar ao ambiente, o que ajuda a minimizar o estresse.
2. Preparação pré-operatória
- Prepare a estação cirúrgica antes de iniciar o experimento. Isso inclui uma almofada de aquecimento, cateteres, um ventilador, um tubo endotraqueal, solução salina heparinizada e um saco de fluido de lactato de ringer.
NOTA: Os leitões têm fraca capacitância termorreguladora e são propensos à hipotermia que altera a hemodinâmica22,23. Portanto, permitir tempo suficiente para que a almofada de aquecimento aqueça é essencial. - Preparar 10 mg/ml de α-cloralose misturando-a com solução salina a 60 °C até que a mistura esteja límpida. Não superaqueça a solução para evitar a cristalização da medicação após o resfriamento. Filtrar com um filtro de seringa (tamanho 0,22 μm) antes de administrar aos leitões.
- Elaborar medicação anestésica à base de peso animal - Cetamina: 20 mg/kg e Xilazina: 2,2 mg/kg. Use α-cloralose (5 mL/kg) para manter a anestesia.
NOTA: α -cloralose é utilizado devido à facilidade de administração IV quando comparado com o inalado
anestésicos, pois estes últimos requerem uma máquina anestésica e um sistema de limpeza apropriado para serem administrados através de um tubo endotraqueal.
3. Anestesia
- Realizar a indução da anestesia no curral de suínos, ambiente familiar para leitões, para evitar estresse indevido.
- Escolha suavemente o leitão pelas patas traseiras e administre cetamina: 20 mg/kg e Xilazina: 2,2 mg/kg na perna traseira no músculo semimembranoso/semitendíneo, usando uma agulha 23 G 3/4.
- Reserve alguns minutos para que os medicamentos façam efeito. Verifique o nível adequado de anestesia, garantindo que o animal esteja relaxado o suficiente para ficar imóvel, com perda do reflexo palpebral e do tônus da mandíbula para permitir o transporte fácil e seguro para o posto cirúrgico. Avalie o reflexo palpebral tocando o canto interno do olho; ausência de piscar indica anestesia adequada.
4. Traqueostomia
NOTA: Este experimento não é de sobrevivência, de modo que uma traqueostomia é realizada para estabelecer uma via aérea para ventilação mecânica. A traqueostomia é um procedimento rápido e fácil, ao contrário da intubação endotraqueal, que é desafiadora em leitões dada a anatomia da cabeça e das vias aéreas superiores24,25. Além disso, laringoespasmo é comumente relatado durante a intubação, resultando em um período prolongado de hipóxia e hipercarbia que pode comprometer os resultados26.
- Posicione o leitão em decúbito dorsal. Identifique a cartilagem cricotireóidea palpando a proeminência da cartilagem tireoidiana que se sente firme. Esterilize a área usando iodopovidona e etanol a 70% antes de aplicar uma cortina estéril.
- Usando uma lâmina cirúrgica, faça uma incisão da linha média ventral de 2-3 cm inferior à extremidade caudal da cartilagem tireoide.
- Usando um hemostato curvo de mosquito, disseque sem rodeios os tecidos e músculos subcutâneos sobrejacentes (esterno-hioideus e coli cutânea) até que a membrana cricotireoidiana e os primeiros anéis traqueais sejam visualizados. Ao dissecar, seja cauteloso para evitar ferir quaisquer vasos sanguíneos.
- Obtenha uma visão clara da membrana cricotireóidea e dos anéis traqueais24 e, em seguida, use um par de pinças de ângulo reto misturadoras longas para elevar as estruturas.
- Com um par de tesouras pequenas, faça um pequeno corte na membrana cricotireoidiana ou no primeiro anel traqueal. Estenda o corte horizontalmente até ~0,5 cm para passar um tubo endotraqueal de 3,0 mm.
- Insira o tubo na marca de 5 cm. Certifique-se de expansão torácica bilateral e sons respiratórios antes de fixar o tubo.
- Passe fita umbilical ao redor da traqueia para prendê-la no lugar. Fita adicional é usada para prender o tubo à base da mandíbula.
- Ligue o ventilador, conecte o tubo endotraqueal e enrole os botões específicos (por exemplo. Botões SIMV, botões PEEP, etc.) para selecionar as seguintes configurações de linha de base. Modo de Controle de Pressão: ventilação mecânica intermitente sincronizada (SIMV); pico de pressão inspiratória (PIP) - 15; pressão expiratória final positiva (PEEP) - 5; Taxa- 20; Tempo I - 0,6. Após a primeira análise de gases sanguíneos, ajuste as configurações do ventilador de acordo com os resultados da gasometria, com o objetivo de manter a oxigenação e ventilação adequadas.
5. Canulação do vaso femoral
- Estabeleça as vias aéreas e a ventilação, antes de chamar a atenção para os vasos femorais para acesso venoso e monitorização invasiva da pressão arterial. A artéria femoral é identificada pela sensação de um pulso no sulco entre os músculos sartório e grácil, e a veia pode ser encontrada apenas medial à artéria.
- Enquanto o leitão estiver deitado em uma posição dorsal reclinada, esterilize a área da virilha usando iodopovidona e etanol e aplique uma cortina de tamanho apropriado.
- Use uma lâmina cirúrgica para criar uma incisão longitudinal de 3-4 cm, começando cranialmente no vinco inguinal e estendendo-se distalmente ao longo do canal femoral.
- Aplique dissecção contundente e afiada, usando pinça curva do mosquito e tesoura, respectivamente, para dissecar até o nível do feixe neurovascular femoral. O feixe pode ser encontrado profundamente no corpo do músculo gracilil27. Dissecar circunferencialmente a artéria e a veia femoral ao longo de 2-3 cm para permitir a canulação. Ligue pequenos ramos laterais, se necessário.
- Aplique uma gravata de seda 3.0 nas extremidades proximais e distais da artéria e da veia para aplicar tração. Amarre a sutura de seda distal na veia e na artéria, ligando os vasos.
- Começando com a veia femoral, mantenha a tração distal e proximal nas gravatas de seda e, em seguida, use um par de micro tesouras para criar uma venotomia.
- Em seguida, use um introdutor de cateter de coleta de veias para abrir o vaso enquanto insere um cateter de poliuretano pré-medido com um diâmetro interno x diâmetro externo de 0,86 mm x 1,32 mm. Uma vez inserido, amarre a sutura de seda 3.0 proximal para fixar o cateter. Lavar o cateter com 3 mL de solução salina heparinizada (1 U/mL). Esta solução pode ser feita adicionando 0,5 mL de heparina a 50 mL de solução salina normal.
- Insira um cateter de pressão arterial invasivo usando a mesma abordagem acima para criar uma arteriotomia e passar o cateter.
NOTA: Manter a tração distal e proximal é essencial para minimizar a perda de sangue ao acessar a artéria. - Uma vez que os cateteres estejam presos, cubra o local com gaze embebida em solução salina e, se necessário, a pele pode ser suturada usando uma sutura de seda 3.0 para prevenir a infecção.
6. Manutenção da anestesia, fluidos e gasometria
- Monitore a profundidade da anestesia durante todo o experimento, usando o tom da mandíbula e o reflexo palpebral, e administre α-cloralose, por via intravenosa, conforme necessário para manter o animal sob anestesia profunda. Use uma dose de carga inicial de 50 mg/kg e 20 mg/kg para bolos adicionais.
- Infundir lactato de campainha a uma taxa de 4 mL/kg/h durante todo o experimento como fluido de manutenção. Por exemplo, se o peso do leitão for de 3 kg, a taxa de infusão de fluidos é de 12 mL/h.
- Para a análise de gases à beira do leito, retire uma amostra de sangue arterial em uma seringa de gás sanguíneo heparinizada e apresente a amostra à máquina analisadora. Selecione a opção gasometria arterial e aguarde ~2-3 s para que o analisador apresente a agulha de coleta de sangue.
- Insira cuidadosamente a agulha na extremidade da seringa que contém a amostra de sangue. Aguarde até que o analisador aspira a amostra necessária e retire a seringa. Permita que a máquina analise o gás sanguíneo e apresente os resultados.
- Com base nos resultados, ajuste o ventilador para manter o pH entre 7,35--7,45, a pressão parcial de dióxido de carbono (PCO2) entre 35-45 mmHg e a pressão parcial de oxigênio (PaO2) entre 80-150 mmHg. As configurações diferem com base no tipo de ventilador, mas em grande parte envolvem aumentar ou reduzir a frequência respiratória usando botões apropriados para compensar a hipóxia e / ou hipercapnia.
- Extraia 3 mL de sangue em um tubo verde claro (heparina de lítio). Centrifugar a amostra a 2000 xg durante 15 min, mantida a 4 °C para extrair plasma. Uma vez concluído, o plasma pode ser analisado imediatamente para o nível de creatinina sérica com o analisador químico à beira do leito ou armazenado a -80 °C para análise posterior.
- Monitore a temperatura continuamente usando um termômetro de sonda retal e ajuste a temperatura da almofada de aquecimento para manter a temperatura do leitão entre 101 e 103 ° F.
7. Grupo experimental; ligadura e perfuração cecal (FLP) 25,28,29
NOTA: Para leitões do grupo experimental, realizar FLP para induzir sepse polimicrobiana28 e monitorar o animal por 12 h após a cirurgia para permitir tempo suficiente para que a sepse grave ocorra. A gravação transdérmica da TFG começa às 8 h de ligadura pós-cecal para permitir 4 h de gravação.
- Use uma lâmina cirúrgica para criar uma incisão vertical paramediana esquerda de 5-6 cm, pois o ceco em suínos encontra-se na fossa paralombar esquerda30. Dissecar as camadas da parede abdominal, evitando lesões nos vasos epigástricos superficiais.
- Uma vez que a camada peritoneal é incisada, use um afastador para melhorar o acesso às estruturas intrabdominais.
- Identifique o cólon espiral no quadrante superior esquerdo do abdômen. Trace o cólon espiral, caudal e dorsalmente, para localizar o ceco. O íleo é visto juntando-se ao cólon espiral na base do ceco.
- Lige o ceco apenas distal à junção ileocecal (Figura 1).
- Usando uma agulha 18 G, faça sete punções no ceco e extrudir fezes para a área peritoneal.
- Feche o abdômen em camadas com uma sutura de seda 3.0 usando pontos simples interrompidos ou contínuos. Um grampeador também pode ser usado para fechar a camada da pele, se disponível.
8. Grupo falso
- Siga as etapas 7.2-7.4 como acima. Depois de identificar o ceco, coloque-o de volta intocado e feche a parede abdominal da mesma forma.
- Monitore leitões no grupo simulado por 12 h para eliminar qualquer viés de confusão atribuído à exposição prolongada à anestesia.
9. Configuração do dispositivo de TFG transdérmica
- Após 8 h de ligadura cecal, prepare-se para iniciar a medição transdérmica da TFG.
- Use o software de serviço MB versão 3.0 para ajustar a taxa de amostragem no dispositivo GFR. Resumidamente, conecte o dispositivo de TFG transdérmico ao software do computador usando o conector USB. Abra o software, clique em conectar e ajuste o tempo para 4000 ms. Clique em escrever para salvar as configurações.
NOTA: Isso dá até 6 h de tempo total de amostragem. Nos suínos, a TFG transdérmica é completada em 4 h. Para experimentos que exigem amostragem de até 12 h, escolha a opção de 8000 ms. - Anexe os adesivos de dupla face com uma janela transparente ao dispositivo. Conecte o dispositivo a um lado, garantindo que o diodo emissor de luz sobreponha a janela transparente para permitir a detecção do traçador.
- Raspe a área que recobre a parede torácica lateral. Conecte a bateria ao dispositivo e cole imediatamente o adesivo com o dispositivo no lugar e verifique se ele está bem preso (Figura 2). Como os leitões são profundamente anestesiados, a fita adesiva pode ser desnecessária para manter o dispositivo no lugar.
NOTA: O adesivo por si só é suficiente para fixar. No entanto, em procedimentos em que o animal seria manipulado, se tornaria ativo ou onde a anestesia poderia ser interrompida, pode ser importante aplicar uma fita. O curativo também pode ser uma abordagem alternativa31. - Um registro basal de 3-5 min é necessário antes de administrar FITC-sinistrina.
10. Preparação e injeção de FITC-sinitrina
- Preparar uma mistura de FITC-sinistro com solução salina até uma concentração final de 50 mg/ml. A dose administrada ao leitão é de 20 mg/kg. FITC-sinistrin é fornecido em forma de pó.
NOTA: A FITC-sinistro também pode ser administrada através de um cateter venoso periférico inserido na veia auricular. É essencial atingir um alto nível de pico administrando FITC-sinitrina como um bolo de empurrar através do cateter venoso da veia femoral. - Anexe a seringa com medicação a um lado de uma torneira de três vias e a uma descarga salina do outro lado da torneira de parada. Empurre o FITC-sinistro e siga imediatamente com um bolus salino de 5 mL antes de fechar a torneira de parada de três vias para a veia do leitão.
11. Registro transdérmico da TFG
- Mantenha o dispositivo ligado ao leitão durante 4 h. Durante este tempo, mantenha o leitão sob anestesia usando doses intermitentes de α-cloralose a uma concentração de 20 mg / kg para evitar qualquer artefato de movimento.
- No final das 4 h, remova o dispositivo e desconecte imediatamente a bateria.
12. Medição da TFG
- Conecte o dispositivo de TFG transdérmico ao computador usando o conector USB fornecido pelo fornecedor.
- Abra o software de leitura para recuperar dados do dispositivo. Salve os dados brutos clicando na sequência: conectar, ler, renomear e salvar. Conforme instruído no manual, processe e avalie os dados salvos no software de análise.
- Resumidamente, abra o software versão 3.0 e importe os dados. Ajuste as posições de deslocamento, início e fim usando os marcadores automatizados. Remova os artefatos, se necessário, e clique em ajustar. Isso fornece uma leitura que mostra a depuração FITC-sinistrina em minutos (t1/2). O t1/2 é subsequentemente utilizado para calcular aTFGt 32,33 da seguinte forma:
NOTA: Em consulta com o fabricante, o fator de conversão utilizado para suínos é de 20 (indicando que 20% do peso corporal é espaço extracelular), em oposição a 21,33 em ratos (TFGt em mL/min) e 14.616,8 em camundongos (TFGt em μL/min). Isso porque a TFG é medida com precisão em função do líquido extracelular34,35, que por sua vez é dependente do peso corporal 36.
13. Eutanásia de leitões
- Recolher 3 ml de sangue após 12 h de FLP para posterior análise bioquímica.
- Eutanasiar o leitão administrando 0,2 mL/kg de mistura pré-misturada de pentobarbital sódico a 20% e fenitoína sódica por via intravenosa.
- Colha o rim direito para estudo histopatológico antes de levar o leitão ao necrotério.
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Representative Results
Nesta seção, apresentamos, pela primeira vez, os dados representativos do uso da TFG transdérmica em suínos neonatais. Utilizou-se um modelo de ligadura e punção cecal que já demonstrou diminuir a função renal28. Assim, levantamos a hipótese de que, em nossos suínos com FLP, deve haver uma queda aguda na TFG correspondente à LRA, e isso deve ser detectado no dispositivo de TFG transdérmica como aumento do tempo de depuração (t1/2), validando assim seu uso em suínos. Foram incluídos sete leitões machos, três simulados e quatro sepse. Os dois grupos apresentaram pesos comparáveis (Figura 3A). Como esperado28, a sepse de 12 h aumentou os níveis séricos de proteína C-reativa (PCR), um marcador de bacteremia e sepse (Figura 3B). Curvas representativas de clearance de FITC-sinitrina em leitões simulados versus sépticos são mostradas (Figura 4 A,B), com LRA mostrada pela sobreposição das curvas sham e sepse (Figura 4C). A LRA é demonstrada por um aumento da área sob a curva para os suínos CLP. Isso pode ser visto visivelmente quando a curva simulada é colocada na curva CLP. A meia-vida média para FITC-siniestrina nos grupos sham e sepse foi de 114 e 537 minutos, respectivamente (Figura 5A). A TFG média no grupo simulado foi de 5,1 mL/min/100 g do peso corporal, enquanto no grupo sepse foi de 1,06 mL/min/100 g do peso corporal (Figura 5B). Um animal adicional foi excluído quando a sonda foi deslocada, o que perturbou a curva de folga e o tempo. Considerando que a creatinina sérica de 12 h (biomarcador de lesão renal aguda) não se alterou no grupo simulado, ela foi aumentada de ~ 0,6 para 1,08 mg/dL nos suínos sépticos (Figura 6).
Figura 1: Cirurgia de ligadura de cecum. (A) Cecum identificado e trazido para o exterior. (B) Cecum ligado na base com uma gravata de seda antes de perfurar com uma agulha. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fixação do dispositivo transdérmico à pele. (A) Pele raspada antes da fixação do adesivo. (B) Dispositivo de TFG transdérmico ligado ao adesivo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados representativos. (A ) Peso dos leitões utilizados neste estudo e (B) Níveis séricos de proteína C-reativa (PCR) em leitões machos simulados e sépticos ventilados mecanicamente ( teste t não pareado). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Curvas representativas de clearance de FITC-sinitrina em leitões machos simulados e sépticos ventilados mecanicamente. (A ) 12 h sham, (B) 12 h sepse. Os suínos sépticos apresentam insuficiência renal, como demonstrado por um aumento da área sob a curva. Os pontos de dados pretos representam os dados brutos, as linhas azuis os três compartimentos se ajustam, as linhas verdes os intervalos de confiança de 95% e a linha vermelha os dados filtrados. (C) Sobreposição de curvas representativas para refletir o grau de divergência em relação à linha de base em suínos sépticos. A curva de sepse (vermelha) mostrou clearance mínimo de FITC-sinistrina, indicando LRA. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos. (A ) Meia-vida FITC-sinitrina e ( B) Gráficos de TFG em leitões machos simulados e sépticos ventilados mecanicamente (teste t não pareado). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Creatinina sérica em leitões machos simulados e sépticos ventilados mecanicamente. (teste ANOVA One-way). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este trabalho descreve os passos práticos para a determinação da função renal em suínos utilizando os monitores de TFG transdérmica miniaturizados e FITC-sinistrina em um modelo de suíno neonatal anestesiado e ventilado mecanicamente. Trabalhos prévios estabeleceram protocolos experimentais de TFG transdérmica em roedores 11,12,14, mas não existem protocolos em suínos.
Recentemente, tem havido um impulso para explorar modelos animais alternativos para resolver doenças intratáveis e aliviar a carga de doença renal em seres humanos. Infelizmente, muitas dessas abordagens tiveram limitações translacionais devido ao tamanho, diferenças anatômicas e fisiológicas. A anatomia renal e a fisiopatologia dos roedores apresentam grandes diferenças quando comparadas aos humanos37. Como os sistemas humano e suíno compartilham características anatômicas e funcionais semelhantes, o modelo suíno pode ser um modelo fisiopatológico mais realista de doenças humanas38,39. Os porcos são agora amplamente utilizados para delinear a fisiopatologia e no desenvolvimento de drogas. Com a publicação do genoma suíno, juntamente com a produção transgênica bem-sucedida de modelos específicos de doenças, o modelo suíno deve assumir um papel mais crítico na pesquisa translacional40,41.
A depuração da inulina continua sendo o meio mais aceito de determinação da TFG, mas é impraticável em grandes modelos animais devido à necessidade de infusão contínua de inulina, cateterismo da bexiga e sua natureza demorada e incômoda42. A creatinina sérica e o nitrogênio ureico no sangue (ureia) são comumente utilizados para medir a função renal em estudos pré-clínicos, mas como a creatinina é secretada nos túbulos e a ureia é cada vez mais reabsorvida na desidratação, esses marcadores têm se mostrado pobres na estimativa da função renal 5,43. Crucialmente, verificou-se que a secreção de creatinina tubular causa superestimação da TFG quando utilizada como marcador de função renal em suínos6. Além disso, devido ao seu habitus corporal, um aumento na creatinina é mais provável de ser visto em grandes modelos animais quando comparado aos roedores. Um estudo em camundongos revelou um aumento de 1,5 vezes na creatinina sérica 6 h após a ligadura cecal44. Anteriormente, mostramos um aumento da creatinina em suínos neonatais às 6 h pós-FLP28. Neste estudo, mantivemos os animais por um período mais longo, ~ 12 horas após a ligadura cecal para permitir tempo suficiente para LRA significativa e um subsequente aumento na creatinina. Como em nosso estudo anterior, confirmamos a indução de sepse por um aumento nos níveis séricos de PCR, um marcador de inflamação e sepse. Neste estudo, e como mostram trabalhos anteriores, a gravidade da sepse após a FLP é dependente do tempo de ligadura e do número de punções44.
Um protocolo para medir a TFG em suínos usando Iohexol já foi validado em suínos37, mas, em contraste, o procedimento de TFG transdérmica é uma melhoria acentuada. É menos incômodo, evita repetidas amostras de sangue ou urina e oferece uma janela em tempo real para a função renal e a possibilidade de medições repetidas e seriadas no mesmo animal45. Este estudo fornece orientações práticas para a determinação da TFG transdérmica em suínos.
Conforme estabelecido por outros grupos, as etapas mais críticas são a correta fixação do dispositivo ao animal e a injeção em bolus de FITC-sinistrina. O dispositivo de medição deve estar bem fixado à superfície da pele para evitar artefatos de movimento no traço. Como os porcos são menos peludos do que os roedores, o uso de um creme depilatório não é necessário. Um barbear limpo com um clipper pode ser tudo o que é necessário. Isso minimiza o aumento associado à depilação na meia-vida da FITC-sinistrina, cujo mecanismo é desconhecido12. Para a fixação adequada, um adesivo de dupla face e fita adesiva são necessários para manter o dispositivo no lugar. Os locais ideais de colocação do dispositivo são a parede torácica lateral e a região abdominal ventral. Essas áreas se correlacionaram com menos artefatos de movimento.
Ao injetar a FITC-sinistrina, a dose correta e inteira deve ser injetada em um movimento fluido na veia. Quando a injeção é interrompida e reiniciada, ela cria vários "mini-picos" na curva de folga. A veia da cauda é rotineiramente usada para pequenos roedores, mas a veia auricular da orelha oferece uma rota mais acessível e proeminente nos porcos. Uma cânula pode ser colocada na veia da orelha para múltiplas medições em porcos conscientes. Uma distinção importante a ser observada no tempo de amostragem é que, ao contrário dos roedores (~1-2 h), os porcos duram mais (~4 h), o que se aproxima do tempo que leva para a FITC-sinistrina ser eliminada da circulação. Até onde sabemos, este é o primeiro artigo detalhando a TFG transdérmica via depuração FITC-sinitrina em suínos. Portanto, não existem citações para referência. O tempo de medição utilizado ~4h foi alcançado, através de consultas com o fabricante. Esse tempo de amostragem é comparável a um estudo prévio validando a TFG transdérmica em outros mamíferos não roedores14.
Na avaliação da TFG transdérmica em leitões, existem alguns fatores que devem ser considerados. Sabe-se que os modelos de um compartimento superestimam significativamente aTFG 46; utilizamos o modelo cinético de três compartimentos, que é mais preciso, proporcionando comunicação tridirecional do marcador injetado por via intravenosa entre o plasma, o espaço extracelular e os componentes mais profundos46. Além disso, estes são leitões ventilados mecanicamente sob anestesia muito profunda por ~ 12 h. Como a anestesia influencia a função renal47,48, pode valer a pena levar isso em consideração em procedimentos que exigem sedação longa ou em que manobras experimentais requerem anestesia adicional juntamente com o monitoramento da TFG. Finalmente, e talvez o mais crucial, os leitões neonatais têm sistemas renais ainda em desenvolvimento com néfrons imaturos que funcionam em uma fração do animal adulto49. Assim, demonstram menor TFG e função renal50.
Como indicado anteriormente, a TFG transdérmica em suínos não é uma medida absoluta das concentrações de sinitrina no sangue. É apenas uma estimativa do decaimento na fluorescência ao longo do tempo12. O uso de um fator de conversão tenta mitigar isso, expressando TFG em mL/min. No entanto, como o fator de conversão é dependente do espaço extracelular, que por sua vez depende do peso corporal34,35,36, é possível que existam grandes variações se o peso não for controlado, ou se o espaço extracelular não for definido com precisão51,52.
Além disso, a pigmentação da pele parece afetar o clearance transdérmico da FITC-sinistrina12,31. Em nossos estudos, descobrimos que os porcos pigmentados apresentaram diminuição do sinal. Em um exemplo, não detectamos sinal em um porco de cor intensamente escura. No entanto, uma vez que o sinal de fundo tende a ser reduzido em animais pigmentados12, descobrimos que os valores de TFG foram amplamente comparáveis. Uma solução para isso é optar por áreas de cor mais clara da pele ao colocar o dispositivo. Uma vez que esses suínos foram amplamente utilizados em um modelo cirúrgico de doença, com várias formas de iluminação e fontes de calor envolvidas, deve-se levar em conta possíveis artefatos de movimento nos traços de TFG via luz refletida absorvida da pele circundante12. Uma solução para isso pode ser minimizar a luz infravermelha durante a gravação ou cobrindo os dispositivos em folha.
Em resumo, este estudo oferece um método simples e confiável para medir a taxa de filtração glomerular em suínos neonatais utilizando a medida transdérmica da depuração FITC-sinistrina. Além disso, nossos dados apoiam a utilidade do sistema na avaliação da função renal em ambientes de lesão renal aguda.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde R01 DK120595 e R01 DK127625 concedidos ao Dr. Adebiyi. O conteúdo deste artigo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Agradecemos ao Dr. Daniel Schock-Kusch, diretor do site da MediBeacon GmbH, por seus conselhos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alpha - Chloralose | Sigma-Aldrich | C0128-25G | Used for maintanining anesthesia |
| Black braided silk 3-0 | Surgical Specialties | SP117 | Silk tie for blood vessel traction and ligation |
| Centrifugation machine AccuSpin 8C | Fischer Scientific | 75-008-821 | Used to extract plasma from whole blood sample |
| Endotracheal Tube 3.0 uncuffed | Progressive Medical International | 1109021995 | Inserted through tracheostomy |
| FITC-Sinistrin 1.0 g | MediBeacon Inc. | FTCF S001 | Store at room temp and protect from light |
| GEM Premier 3000 Blood gas analyzer | Instrumentation Laboratory | 5700 | For bedside blood gas analysis |
| Heating Pad medium size 20 in x 29 in | Adroit Medical Systems | V029 | Connects to heat therapy pump |
| HTP-Heat Therapy Pump | Adroit Medical Systems | HTP | Allows you to set temperature as needed. |
| IDEXX Catalyst One | IDEXX Laboratories | 89-92525-00 | Plasma creatinine analysis |
| Invasive blood pressure catheter 3.5Fr | Millar | SPR-524 | Inserted in femoral artery |
| IV adminstration set with flow regulator | True Care | TCRTCBINF033G | Used to connect IV fluid bag to vein catheter |
| Ketamine | Covetrus | 68317 | Used for induction of Anesthesia |
| MediBeacon analysis software version 3.0 | MediBeacon Inc. | N/A | Software program used for analysing data to obtain sinistrin clearance half life and curve |
| Millex-GV Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGVR33RS | Syringe filter for chloralose injection |
| Neonate/Infant Ventilator | Sechrist Millennium | 20409 | Connected to air supply to provide ventilation through endotracheal tube |
| Phenobarbital Sodium + Phenytoin Sodium (Euthasol) | Covetrus | 72934 | Used for euthanasia |
| Ringer Lactate 500 mL bag | Baxter | 2B2323Q | Maintanence fluid infusion |
| Sterile Gloves | Henry Schein | 104-5920 | Used by operator during surgery |
| Sterile Gown | Halyard Health | 95021 | Used by operator during surgery |
| Steril Towel | Medline | 42131704 | Used as drape to maintaine sterile field when operating |
| Suture 3-0 silk reverse cutting needle | Ethicon | NC1842168 | Used for suturing abdominal wall layers |
| Transdermal Mini GFR Monitor | MediBeacon Inc. | TDM004 | Battery and USB connector included in package |
| Transdermal monitor adhesive patch | MediBeacon Inc. | PTC-SM001 | Doubl sided adhesive patch for GFR probe |
| Umbilical Tape 1/8 in x 20 yds | Fisher Scientific | NC9303017 | To secure endotracheal tube |
| Venous Catheter size PE/5 | Micro medical tubing | BB31695 | For femoral vein cannulation |
| Xylazine | Covetrus | 61035 | Used for induction of anesthesia |
References
- Pasala, S., Carmody, J. B. How to use... serum creatinine, cystatin C and GFR. Archives of Disease in Childhood Education and Practice Edition. 102 (1), 37-43 (2017).
- Smith, H. W. The Kidney: Structure and Function in Health and Disease. , Oxford University Press, USA. (1951).
- Gutman, Y., Gottschalk, C. W., Lassiter, W. E. Micropuncture study of inulin absorption in the rat kidney. Science. 147 (3659), 753-754 (1965).
- Ellery, S. J., Cai, X., Walker, D. D., Dickinson, H., Kett, M. M. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in small rodents: through the skin for the win. Nephrology. 20 (3), 117-123 (2015).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
- Wendt, M., Waldmann, K. H., Bickhardt, K. Comparative studies of the clearance of inulin and creatinine in swine. Zentralblatt fur Veterinarmedizin. Reihe A. 37 (10), 752-759 (1990).
- Schwartz, G. J., Brion, L. P., Spitzer, A. The use of plasma creatinine concentration for estimating glomerular filtration rate in infants, children, and adolescents. Pediatric Clinics of North America. 34 (3), 571-590 (1987).
- Boer, D. P., de Rijke, Y. B., Hop, W. C., Cransberg, K., Dorresteijn, E. M. Reference values for serum creatinine in children younger than 1 year of age. Pediatric Nephrology. 25 (10), 2107-2113 (2010).
- Guignard, J. P., Drukker, A. Why do newborn infants have a high plasma creatinine. Pediatrics. 103 (4), 49 (1999).
- Friedemann, J., Schock-Kusch, D., Shulhevich, Y. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in conscious laboratory animals: state of the art and future perspectives. Reporters, Markers, Dyes, Nanoparticles, and Molecular Probes for Biomedical Applications IX. 10079, 63-71 (2017).
- Herrera Pérez, Z., Weinfurter, S., Gretz, N. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents. Journal of Visualized Experiments. (109), e53767 (2016).
- Scarfe, L., et al. Transdermal measurement of glomerular filtration rate in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58520 (2018).
- Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
- Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734 (2014).
- Almond, G. W. Research applications using pigs. The Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice. 12 (3), 707-716 (1996).
- Bassols, A., et al. The pig as an animal model for human pathologies: A proteomics perspective. Proteomics Clinical Applications. 8 (9-10), 715-731 (2014).
- Ayuso, M., Irwin, R., Walsh, C., Van Cruchten, S., Van Ginneken, C. Low birth weight female piglets show altered intestinal development, gene expression, and epigenetic changes at key developmental loci. FASEB Journal. 35 (4), 21522 (2021).
- Pierson, R. N. Progress toward pig-to-human xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1871-1873 (2022).
- Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1889-1898 (2022).
- Reardon, S. First pig kidneys transplanted into people: what scientists think. Nature. 605 (7911), 597-598 (2022).
- Lu, T., Yang, B., Wang, R., Qin, C. Xenotransplantation: current status in preclinical research. Frontiers in Immunology. 10, 3060 (2019).
- Pattison, R. J., English, P. R., MacPherson, O., Roden, J. A., Birnie, M. Hypothermia and its attempted control in newborn piglets. Proceedings of the British Society of Animal Production. 1990, 81 (1972).
- Tucker, B. S., Petrovski, K. R., Kirkwood, R. N. Neonatal piglet temperature changes: effect of intraperitoneal warm saline injection. Animals. 12 (10), 1312 (2022).
- Alcalá Rueda, I., et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 278 (8), 3081-3090 (2021).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging, and Experimental Techniques, Third Edition. , CRC Press/Taylor & Francis Group. Boca Raton. (2016).
- Steinbacher, R., von Ritgen, S., Moens, Y. P. Laryngeal perforation during a standard intubation procedure in a pig. Laboratory Animals. 46 (3), 261-263 (2012).
- Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the Göttingen minipig: intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. Journal of Visualized Experiments. (52), e2652 (2011).
- Soni, H., Adebiyi, A. Early septic insult in neonatal pigs increases serum and urinary soluble Fas ligand and decreases kidney function without inducing significant renal apoptosis. Renal Failure. 39 (1), 83-91 (2017).
- Bütz, D. E., Morello, S. L., Sand, J., Holland, G. N., Cook, M. E. The expired breath carbon delta value is a marker for the onset of sepsis in a swine model. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 29 (4), 606-613 (2014).
- Turner, A. S., McIlwraith, C. W. Techniques in Large Animal Surgery. , Lea & Febiger. (1989).
- Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734 (2014).
- Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
- Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (10), 2997-3001 (2009).
- Peters, A. M. Expressing glomerular filtration rate in terms of extracellular fluid volume. Nephrology Dialysis Transplantation. 7 (3), 205-210 (1992).
- Groth, S., Christensen, A. B., Nielsen, H. CdTe-detector registration of 99mTc-DTPA clearance. European Journal of Nuclear Medicine. 8 (6), 242-244 (1983).
- Guyton, A. C., Hall, J. E. The body fluid compartments: extracellular and intracellular fluids; interstitial fluid and edema. Textbook of Medical Physiology. 9, 306-308 (2000).
- Luis-Lima, S., et al. Iohexol plasma clearance simplified by dried blood spot testing. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 33 (9), 1597-1603 (2018).
- Kobayashi, E., Hishikawa, S., Teratani, T., Lefor, A. T. The pig as a model for translational research: overview of porcine animal models at Jichi Medical University. Transplantation Research. 1 (1), 8 (2012).
- Swindle, M. M., et al. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
- Ibrahim, Z., et al. Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems. Xenotransplantation. 13 (6), 488-499 (2006).
- Judge, E. P., et al. Anatomy and bronchoscopy of the porcine lung. A model for translational respiratory medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (3), 334-343 (2014).
- Stevens, L. A., Levey, A. S. Measured GFR as a confirmatory test for estimated GFR. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (11), 2305-2313 (2009).
- Bankir, L., Yang, B. New insights into urea and glucose handling by the kidney, and the urine concentrating mechanism. Kidney International. 81 (12), 1179-1198 (2012).
- Ruiz, S., et al. Sepsis modeling in mice: ligation length is a major severity factor in cecal ligation and puncture. Intensive Care Medicine Experimental. 4 (1), 22 (2016).
- Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney International. 79 (11), 1254-1258 (2011).
- Frennby, B., Sterner, G. Contrast media as markers of GFR. European Radiology. 12 (2), 475484 (2002).
- Burchardi, H., Kaczmarczyk, G. The effect of anaesthesia on renal function. European Journal of Anaesthesiology. 11 (3), 163-168 (1994).
- Fusellier, M., et al. Influence of three anesthetic protocols on glomerular filtration rate in dogs. American Journal of Veterinary Research. 68 (8), 807811 (2007).
- Arant, B. S. Functional immaturity of the newborn kidney-paradox or prostaglandin. Homeostasis, Nephrotoxicity, and Renal Anomalies in the Newborn. , Springer. Boston, MA. 271-278 (1986).
- Gattineni, J., Baum, M. Developmental changes in renal tubular transport-an overview. Pediatric Nephrology. 30 (12), 2085-2098 (2015).
- Gu, X., Yang, B. Methods for assessment of the glomerular filtration rate in laboratory animals. Kidney Diseases. , 1-11 (2022).
- Mullins, T. P., Tan, W. S., Carter, D. A., Gallo, L. A. Validation of non-invasive transcutaneous measurement for glomerular filtration rate in lean and obese C57BL/6J mice. Nephrology. 25 (7), 575-581 (2020).
