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Biology

विखंडन, समरूपीकरण और सीरियल निस्पंदन के संयोजन का उपयोग करके बोवाइन अंडाशय से छोटे प्रीएंट्राल फॉलिकल्स का अलगाव

Published: September 27, 2022 doi: 10.3791/64423
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Animal Science, University of California Davis

Summary

प्रीएंट्राल फॉलिकुलोजेनेसिस के अध्ययन को आगे बढ़ाने के लिए एकल अंडाशय से कूप अलगाव के कुशल तरीकों की आवश्यकता होती है। यहां प्रस्तुत एक ऊतक चॉपर और होमोजेनाइज़र का उपयोग करके गोजातीय अंडाशय से कूप अलगाव के लिए एक सुव्यवस्थित, यांत्रिक प्रोटोकॉल है। यह विधि एक अंडाशय से बड़ी संख्या में व्यवहार्य प्रीएंट्राल रोम के संग्रह की अनुमति देती है।

Abstract

स्तनधारी फॉलिकुलोजेनेसिस की पूरी प्रक्रिया को समझना पशुधन, मनुष्यों और लुप्तप्राय प्रजातियों में सहायक प्रजनन प्रौद्योगिकियों में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है। अनुसंधान ज्यादातर छोटे प्रीएंट्राल रोम के अलगाव में कठिनाई के कारण एंट्रल और बड़े प्रीएंट्राल रोम तक सीमित रहा है, खासकर बड़े स्तनधारियों जैसे गोजातीय प्रजातियों में। यह काम एक गोजातीय अंडाशय से बड़ी संख्या में छोटे प्रीएंट्राल रोम को पुनः प्राप्त करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। अलग-अलग गोजातीय अंडाशय के कॉर्टेक्स को एक ऊतक चॉपर का उपयोग करके 500 μm क्यूब्स में काटा गया और 10 मिमी जांच का उपयोग करके 9,000-11,000 आरपीएम पर 6 मिनट के लिए समरूप किया गया। बड़े मलबे को पनीर कपड़े का उपयोग करके होमोजेनेट से अलग किया गया था, इसके बाद 300 μm और 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से सीरियल निस्पंदन किया गया था। 40 μm छन्नी में रखी गई सामग्री को एक खोज पकवान में धोया गया था, जहां रोम की पहचान की गई थी और माध्यम की एक बूंद में एकत्र किया गया था। एकत्र किए गए रोम की व्यवहार्यता का परीक्षण ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग के माध्यम से किया गया था। यह विधि लगभग 90 मिनट में एक गोजातीय अंडाशय से बड़ी संख्या में व्यवहार्य छोटे प्रीएंट्राल रोम के अलगाव को सक्षम बनाती है। महत्वपूर्ण रूप से, यह विधि पूरी तरह से यांत्रिक है और ऊतक को अलग करने के लिए एंजाइमों के उपयोग से बचती है, जो रोम को नुकसान पहुंचा सकती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त रोम का उपयोग डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है जैसे कि आरटी-क्यूपीसीआर के लिए आरएनए का अलगाव, विशिष्ट प्रोटीन का इम्यूनोलोकलाइजेशन और इन विट्रो कल्चर।

Introduction

डिम्बग्रंथि के रोम अंडाशय की कार्यात्मक इकाइयाँ हैं, जो युग्मक (अंडाणु) के उत्पादन के साथ-साथ प्रजनन समारोह और समग्र स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण हार्मोन के उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं। भ्रूण के विकास के दौरान या प्रजातियों1 के आधार पर नवजात अवधि में अंडाशय में आदिम रोम बनते हैं, और वे एक महिला के डिम्बग्रंथि रिजर्व का गठन करते हैं। कूपिक विकास आदिम रोम के सक्रियण के साथ शुरू होता है जो आराम करने वाले पूल को छोड़ देता है और बढ़ते चरण में प्रवेश करता है। प्रीएंट्राल फॉलिकुलोजेनेसिस, जिसमें एंट्रम विकास से पहले सभी कूप चरण शामिल हैं, एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है जिसके लिए अंडाणु और आसपास के ग्रैनुलोसा कोशिकाओं में तुल्यकालिक रूपात्मक और चयापचय परिवर्तनों की आवश्यकता होती है, जो इन दो सेलप्रकारों 2,3 के बीच तंग संचार द्वारा संचालित होती है। प्रीएंट्राल रोम किसी भी समय अंडाशय में पाए जाने वाले कूपिक इकाइयों के बहुमत का गठन करतेहैं। फॉलिकुलोजेनेसिस के प्रीएंट्रल चरणों के माध्यम से विकास एंट्रल विकास 5,6 की तुलना में कई सप्ताह लंबा होने का अनुमान है, और यह समय अंडाणु और दैहिक कोशिकाओं के लिए विकास के अंतिम चरण (यानी, एंट्रल चरण) में प्रवेश करने के लिए पर्याप्त परिपक्वता प्राप्त करने और ओव्यूलेशन, निषेचन और भ्रूण के विकासके लिए तैयार करने के लिए आवश्यक है।

डिम्बग्रंथि प्रीएंट्राल फॉलिकुलोजेनेसिस के बारे में वर्तमान ज्ञान का अधिकांश हिस्सा माउस मॉडल 10,11,12,13 से आता है, जो एक छोटे और कम रेशेदार अंडाशय से बड़ी संख्या में इन रोम को पुनर्प्राप्त करने में आसानी के कारण होता है। यद्यपि गोजातीय अंडाशय से बड़ी संख्या में प्रीएंट्राल रोम के अलगाव की रिपोर्ट लगभग 30 साल14 साल पुरानी है, इन प्रारंभिक चरण के रोम के विकास को विनियमित करने वाली प्रक्रियाओं के बारे में अधिक पूर्ण समझ अप्राप्य बनी हुई है, बड़े पैमाने पर पर्याप्त संख्या में व्यवहार्य प्रीएंट्राल रोम को पुनः प्राप्त करने के लिए अनुकूलित, कुशल और दोहराने योग्य तरीकों की कमी के कारण, विशेष रूप से विकास के शुरुआती चरणों में। मनुष्यों में सहायक प्रजनन में भविष्य के उपयोग के लिए डिम्बग्रंथि रिजर्व को संरक्षित करने में बढ़ती रुचि के साथ, गायें उनकी अधिक समान डिम्बग्रंथि संरचना के कारण एक आकर्षक मॉडल बन जातीहैं। हालांकि, गोजातीय अंडाशय माउस अंडाशय16 की तुलना में कोलेजन में स्पष्ट रूप से समृद्ध है, जिससे माउस के लिए वर्णित तरीकों का उपयोग करके यांत्रिक अलगाव बहुत अक्षम हो जाता है। प्रजनन संरक्षण तकनीकों का विस्तार करने के प्रयासों में एंट्रल चरण में प्रीएंट्राल रोम का पूर्ण इन विट्रो विकास शामिल है, इसके बाद संलग्न अंडाणुओं की इन विट्रो परिपक्वता (आईवीएम), इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ), और भ्रूण उत्पादन और स्थानांतरण17 शामिल हैं। इस प्रकार, यह पूरी प्रक्रिया केवल चूहों18 में हासिल की गई है। मवेशियों में, विट्रो में कूप विकास की ओर प्रगति संस्कृति की शुरुआत में परिवर्तनीय कूप चरणों के साथ-साथ प्रोटोकॉल17,19 के बीच संस्कृति की परिवर्तनशील लंबाई के साथ कुछ रिपोर्टों तक सीमित है।

गोजातीय अंडाशय से प्रीएंट्राल रोम की फसल के लिए साहित्य में वर्णित विधियों ने ज्यादातर यांत्रिक और एंजाइमैटिक तकनीकों का उपयोग किया है, या तो अलग या संयोजन 2,14,17,20 में। गोजातीय प्रीएंट्राल फॉलिकल अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल की पहली रिपोर्ट ने पूरे अंडाशय20 को संसाधित करने के लिए एक ऊतक होमोजेनाइज़र और सीरियल निस्पंदन का उपयोग किया। इस अध्ययन के बाद यांत्रिक और एंजाइमेटिक प्रक्रियाओं के संयोजन की रिपोर्ट थी जो कोलेजनेज14 का उपयोग करती थी। डिम्बग्रंथि के ऊतकों को पचाने के लिए कोलेजनेज का उपयोग करते समय एक आवर्तक विषय कूप तहखाने झिल्ली के नुकसान के लिए संभावित जोखिम है, जो कूप व्यवहार्यता 14,21,22,23 से समझौता कर सकता है। इसलिए, यांत्रिक तरीकों के विभिन्न संयोजनों को नियोजित किया गया है, जैसे कि ऊतक चॉपर का उपयोग और बार-बार पिपेटिंग या होमोजिनाइजेशन 20,24,25,26 के साथ संयुक्त ऊतक हेलीकॉप्टर। एक अन्य यांत्रिक तकनीक जिसे वर्णित किया गया है, डिम्बग्रंथि के ऊतकों से सीधे प्रीएंट्राल रोम को विच्छेदित करने के लिए सुइयों का उपयोग करती है, जो विशेष रूप से बड़े (>200 μm) द्वितीयक रोम को अलग करने के लिए उपयोगी है। हालांकि, यह प्रक्रिया समय लेने वाली है, छोटे प्रीएंट्राल रोम को अलग करने के लिए अक्षम है, और गोजातीय अंडाशय 19,27,28 में प्रयास किए जाने पर कौशल-निर्भर है।

साहित्य में वर्णित विभिन्न तकनीकों का लाभ उठाते हुए, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एकल गोजातीय अंडाशय से प्रीएंट्राल रोम के अलगाव को सरल, सुसंगत और कुशल तरीके से अनुकूलित करना है जो एंजाइमेटिक समाधानों में इनक्यूबेशन से बचता है। प्रीएंट्राल फॉलिकल्स को अलग करने के तरीकों में सुधार करने से फॉलिकुलोजेनेसिस के इस चरण की समझ को बढ़ाने का अवसर मिलेगा और एंट्रल चरण में प्रीएंट्राल फॉलिकल्स विकसित करने के लिए प्रभावी संस्कृति प्रणालियों के विकास को सक्षम किया जा सकेगा। गोजातीय प्रजातियों जैसे बड़े स्तनपायी से प्रीएंट्राल रोम के अलगाव के लिए यहां वर्णित विस्तृत प्रक्रियाएं शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण होंगी, जो एक गैर-मुराइन प्रजातियों में प्रारंभिक फॉलिकुलोजेनेसिस का अध्ययन करने का लक्ष्य रखती हैं जो मनुष्यों के लिए ट्रांसलेटेबल है।

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Protocol

बोवाइन (बोसटॉरस) अंडाशय को एक स्थानीय बूचड़खाने से प्राप्त किया गया और संग्रह के 6 घंटे के भीतर प्रयोगशाला में ले जाया गया। सुविधा में संसाधित जानवरों की बड़ी संख्या के कारण, जानवरों के एस्ट्रस चक्र की आयु, नस्ल और चरण अज्ञात हैं। क्योंकि इन प्रयोगों में किसी भी जीवित जानवर का उपयोग नहीं किया गया था, एक अनुमोदित पशु देखभाल और उपयोग प्रोटोकॉल की आवश्यकता नहीं थी।

1. उपकरण और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. बेंच पेपर के साथ एक लैब बेंच के 2 फीट चौड़े खंड को कवर करें।
  2. एक स्केलपेल हैंडल, बाँझ स्केलपेल ब्लेड, हेमोस्टैट, विच्छेदन बल की जोड़ी, 20 एमएल ल्यूर-लॉक सिरिंज, 18 जी सुई, दो 200 एमएल बीकर, 500 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क, 104 मिमी व्यास प्लास्टिक फ़नल, प्लास्टिक कटिंग बोर्ड, चीज़क्लॉथ की एक22 सेमी 2 परत (उपयोग से पहले ऑटोक्लेविंग द्वारा चीज़क्लॉथ को निष्फल किया जा सकता है) प्राप्त करें। एक 300 μm सेल छन्नी, और एक 40 μm सेल छन्नी (सामग्री की तालिका देखें)।
  3. सभी उपकरणों को बेंच पेपर पर स्थानांतरित करें।
  4. स्केलपेल ब्लेड को स्केलपेल हैंडल पर स्लॉट करने के लिए हेमोस्टैट का उपयोग करें। ब्लेड के कोण वाले आधार को हैंडल पर कोण संकेतक से संरेखित करें, फिर ब्लेड को हैंडल के नाली में स्लाइड करें।
  5. फ़नल को एर्लेनमेयर फ्लास्क में रखें और चीज़क्लॉथ के साथ खोलने वाले फ़नल को कवर करें।
  6. प्रति अंडाशय एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को पानी या मोती स्नान सेट में संसाधित करने के लिए 38.5 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. 38.5 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड वार्मर सेट पर संसाधित किए जा रहे प्रति अंडाशय एक 100 मिमी x 15 मिमी वर्ग पेट्री डिश रखें।
  8. 1 लीटर पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनस्ट्रेप; 10,000 यू / एमएल पेनिसिलिन और 10,000 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन) को 1 लीटर 1x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में जोड़ें। अंडाशय प्रसंस्करण से कम से कम 2 घंटे पहले पीबीएस + पेनस्ट्रेप को पानी या मोती स्नान सेट में गर्म करें।
    नोट: पीबीएस + पेनस्ट्रेप समाधान अंडाशय को धोने के लिए अनिवार्य है जब पृथक रोम को सुसंस्कृत किया जाएगा, और माइक्रोबियल संदूषण को कम करने के लिए किसी भी डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए अभी भी इसकी सिफारिश की जाती है।
  9. संसाधित अंडाशय निस्पंदन एकत्र करने के लिए, फॉलिकल वॉश मीडियम (एफडब्ल्यूएम) का उपयोग करें जिसमें हैंक के लवण के साथ टीसीएम 199 शामिल है ( सामग्री की तालिका देखें) जिसमें 3 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 25 एमएम एचईपीईएस बफर, 100 यूआई पेनिसिलिन / 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 mM सोडियम पाइरूवेट (NaPyr), और 100 nM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA) शामिल हैं।
    1. बाँझ टीसीएम 199, एक 250 एमएल बोतल, और एक 100 एमएल स्नातक सिलेंडर को जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में स्थानांतरित करें। बोतल में TCM199 के 194 एमएल स्थानांतरित करें।
    2. बीएससी से टीसीएम 199 के बीकर को हटा दें और एक हलचल प्लेट में लाएं। बोतल में 600 मिलीग्राम बीएसए, 1.19 ग्राम एचईपीईएस बफर, और एक आटोक्लेव स्टिर बार जोड़ें और घुलने तक हिलाएं।
    3. एक बार बीएसए और एचईपीईएस बफर पूरी तरह से घुल जाने के बाद, माध्यम में 1 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड (एनएओएच) जोड़ें जब तक कि यह 7.6-7.8 के पीएच तक न पहुंच जाए, जैसा कि पीएच मीटर द्वारा मापा जाता है।
    4. बीएससी में स्थानांतरित करने से पहले मध्यम की बोतल, एक वैक्यूम निस्पंदन उपकरण, चार 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब, और पेनस्ट्रेप, नैपायर और एनईएए की बोतलों को 70% इथेनॉल के साथ पोंछें।
    5. TCM199 + 3 mg/mL BSA + 25 mM HEPES की बोतल में पेनस्ट्रेप (10,000 U/mL पेनिसिलिन और 10,000 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन), 100 mM NaPyr और 100x NEAA के 2 एमएल जोड़ें। अंतिम माध्यम को बाँझ-फ़िल्टर करें और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में एलिकोट करें। माध्यम को 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. अंडाशय प्रसंस्करण से कम से कम 1 घंटे पहले 38.5 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए मोती स्नान में प्रति दो अंडाशय मध्यम की एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को गर्म करें।

2. ऊतक चॉपर सेटअप

  1. सुनिश्चित करें कि ऊतक चॉपर ( सामग्री की तालिका देखें) प्लग इन और चालू है।
  2. निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार स्लाइस मोटाई को 500 μm, ब्लेड बल नियंत्रण नॉब को 20 ° और गति नियंत्रण नॉब को 90 ° पर सेट करें।
  3. प्लेट धारक में एक 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश डालें और प्लेट धारक को अपने मंच पर डालें।
  4. चॉपिंग आर्म को उतना ही ऊंचा उठाएं जितना कि यह मैनुअल ऑपरेटिंग नॉब को घड़ी की ओर मोड़कर जाएगा।
  5. फोर्सप्स का उपयोग करके, चॉपिंग आर्म में डाले गए स्क्रू पर एक दोधारी रेजर ब्लेड ( सामग्री की तालिका देखें) रखें। ब्लेड को ब्लेड के ऊपर रखें और वॉशर और अखरोट के साथ सुरक्षित रखें। अखरोट को एक चौथाई ढीला छोड़ दें।
  6. मैन्युअल ऑपरेटिंग नॉब को तब तक घुमाएं जब तक कि चॉपिंग आर्म ब्लेड को पेट्री डिश पर सपाट न कर दे। अखरोट को अखरोट के साथ बाकी रास्ते में कस लें।
  7. चॉपिंग आर्म को उतना ही ऊंचा उठाएं जितना यह मैनुअल ऑपरेटिंग नॉब का उपयोग करके जाएगा। टेबल रिलीज़ नॉब को बाईं ओर ले जाएं जब तक कि यह जगह में न आ जाए।

3. अंडाशय की तैयारी

  1. प्रयोगशाला में अंडाशय को गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) बाँझ पीबीएस + पेनस्ट्रेप में स्थानांतरित करें।
    नोट: जानवर से हटाने के बाद जैसे ही संभव हो, कूप अलगाव के लिए अंडाशय को संसाधित करने की सिफारिश की जाती है। इस प्रोटोकॉल में, कटाई के 6 घंटे के भीतर अंडाशय संसाधित किए गए थे। अंडाशय को लगभग 38.5 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ 0.9% खारा घोल युक्त थर्मासेस में बूचड़खाने से प्रयोगशाला में ले जाया गया था।
  2. यदि संभव हो, तो छोटे (≤ 4 सेमी x 3 सेमी x 3 सेमी) अंडाशय का चयन करें जिसमें छोटे (3-5 मिमी) एंट्रल रोम, कोई बड़ा (≥8 मिमी) एंट्रल रोम नहीं है, और कोई प्रमुख कॉर्पस ल्यूटियम नहीं है (चित्रा 1)। इन मानदंडों को यह सुनिश्चित करने के लिए अनुशंसित किया जाता है कि गैर-कूप मलबे की न्यूनतम मात्रा, जैसे कि स्ट्रोमल कोशिकाएं और बाह्य मैट्रिक्स, परिणामस्वरूप वर्ग डिश में शामिल हैं जिसमें पृथक रोम होते हैं।
    नोट: एंट्रल रोम को अंडाशय की सतह पर गोलाकार, द्रव से भरे वेसिकुलर संरचनाओं के रूप में पहचाना जा सकता है। कॉरपोरेट ल्यूटिया को अंडाशय की सतह से निकली लाल, नारंगी या पीले कठोर संरचनाओं के रूप में पहचाना जा सकता है।
  3. अंडाशय से किसी भी अतिरिक्त संयोजी ऊतक और वसा को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  4. एक बीकर में 70% इथेनॉल में अंडाशय को 30 सेकंड के लिए धोएं।
  5. प्रत्येक धोने के लिए ताजा पीबीएस + पेनस्ट्रेप का उपयोग करके, गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस + पेनस्ट्रेप के बीकर में अंडाशय को 2 मिनट के लिए 3 गुना धोएं।
  6. प्रसंस्करण के लिए तैयार होने तक अंडाशय को गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस + पेनस्ट्रेप में रखें।
    नोट: प्रयोगशाला और अंडाशय स्रोत के बीच की दूरी परिवर्तनशील हो सकती है। इसलिए, कूपिक व्यवहार्यता के रखरखाव को सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल को समय पर पूरा करना महत्वपूर्ण है।

Figure 1
चित्र 1: गोजातीय अंडाशय की शारीरिक रचना। गोजातीय अंडाशय में उपकला परत में संलग्न दो मुख्य क्षेत्र होते हैं। कॉर्टेक्स, जिसमें डैश्ड लाइन के बाईं ओर ऊतक शामिल होता है, में आदिम चरण से लेकर एंट्रल चरण तक डिम्बग्रंथि के रोम होते हैं। नग्न आंखों से देखने के लिए प्रीएंट्राल रोम बहुत छोटे होते हैं; एंट्रल रोम को तारांकन के साथ चिह्नित किया जाता है। मज्जा, जिसमें डैश लाइन के दाईं ओर ऊतक शामिल होता है, में रक्त वाहिकाएं, लसीका वाहिकाएं और तंत्रिकाएं होती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. काटने की प्रक्रिया

नोट: एक समय में केवल एक अंडाशय को संसाधित करें। तापमान में कमी से बचने के लिए अंडाशय को जल्दी से संसाधित करें, जो कूप व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है।

  1. बेंच पेपर (चित्रा 2 ए) पर कटिंग बोर्ड पर एक अंडाशय को स्थानांतरित करें और टिशू चॉपर (चित्रा 2 बी) तैयार करें।
  2. फोर्सप्स और स्केलपेल का उपयोग करके, अंडाशय को आधे में काट लें और प्रत्येक आधे से मज्जा को हटा दें, केवल कॉर्टेक्स को लगभग 1 मिमी की मोटाई पर छोड़ दें जैसा कि चित्रा 2 सी में दिखाया गया है।
    1. अंडाशय को एक लिगामेंट अटैचमेंट साइट से विपरीत अनुलग्नक साइट तक आधे अनुदैर्ध्य रूप से काटें।
    2. कटिंग बोर्ड पर अंडाशय के एक आधे हिस्से को संसाधित करने के लिए रखें और अंडाशय के दूसरे आधे हिस्से को गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस + पेनस्ट्रेप में वापस रखें।
    3. उजागर मज्जा के ऊपर की ओर होने के साथ, अंडाशय की वक्रता के साथ कॉर्टेक्स को काटे बिना अंडाशय की सतह से लगभग 2 मिमी दूर स्लाइस करें।
    4. स्लाइस को गहरा करने के लिए एक गाइड के रूप में अंडाशय की वक्रता के साथ स्लाइस का उपयोग करें, अभी भी मज्जा से कॉर्टेक्स को अलग करने के लिए अंडाशय की वक्रता का पालन करें।
    5. कॉर्पस ल्यूटियम की सीमा के साथ काटकर अंडाशय से किसी भी कॉर्पोरेट ल्यूटिया को विच्छेदित और त्याग दें।
    6. अंडाशय को आधा पलटें ताकि उपकला ऊपर की ओर हो और मज्जा को कॉर्टेक्स से दूर काटने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। अंडाशय के टुकड़े के किनारे के आसपास किसी भी शेष सफेद संयोजी ऊतक को ट्रिम करें जो स्नायुबंधन से जुड़ा हुआ था।
    7. एक बार जब मज्जा का अधिकांश हिस्सा हटा दिया जाता है, तो कॉर्टेक्स को लगभग 1 मिमी मोटाई तक काटने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। शेष मज्जा को दूर करने के लिए छोटे, आगे-पीछे की गति के साथ स्केलपेल में हेरफेर करें।
      नोट: मज्जा अंडाशय का आंतरिक भाग है जिसमें बड़ी रक्त वाहिकाएं होती हैं। कॉर्टेक्स अंडाशय का बाहरी हिस्सा है, जो सीधे सबसे बाहरी सतह उपकला के नीचे स्थित है। गोजातीय अंडाशय में कॉर्टेक्स लगभग 1 मिमी मोटा होता है, और इस प्रकार अंडाशय को 1 मिमी की मोटाई तक काटने से मज्जा हट जाएगा।
  3. कॉर्टेक्स को टुकड़ों में काटें जो 2.5 सेमी x 2.5 सेमी से बड़ा नहीं है। कॉर्टेक्स के टुकड़ों को गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस + पेनस्ट्रेप में तब तक रखें जब तक कि काटने के लिए तैयार न हो।
  4. कम से कम 50 मिलीलीटर गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस + पेनस्ट्रेप के साथ एक बीकर भरें और प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट प्राप्त करें।
  5. कॉर्टेक्स के एक टुकड़े को ऊतक चॉपर पर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और ऊतक को गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस + पेनस्ट्रेप की तीन या चार बूंदों के साथ गीला करें।
  6. ऊतक के टुकड़े को बल की एक जोड़ी के साथ स्थिर रखें और ऊतक चॉपर शुरू करने के लिए एक बार रीसेट बटन दबाएं। बल के साथ ऊतक को स्थिर करना जारी रखते हुए पेट्री डिश को एक हाथ से स्थिर करें। ब्लेड को बल से टकराने से बचने के लिए आवश्यकतानुसार ऊतक के साथ छोड़े गए बल को स्थानांतरित करें। परिणामी स्ट्रिप्स लंबाई में लगभग 500 μm होंगे।
  7. एक बार जब कॉर्टेक्स के पूरे टुकड़े को स्ट्रिप्स में काट दिया जाता है, तो ब्लेड को पेट्री डिश से ब्लेड उठाने के लिए ब्लेड होल्डर नॉब का उपयोग करें और ब्लेड से किसी भी ऊतक को हटाने के लिए फोर्सप्स का उपयोग करें।
  8. प्लेट धारक को 90° घुमाएं।
  9. रीसेट बटन को एक बार दबाएं। ब्लेड के रास्ते में ऊतक स्ट्रिप्स को धकेलने के लिए फोर्सप्स का उपयोग करते समय पेट्री डिश को एक हाथ से स्थिर करें।
  10. ब्लेड को पूरी तरह से ऊतक स्ट्रिप्स के माध्यम से पास करें। ब्लेड होल्डर नॉब का उपयोग पेट्री डिश से ब्लेड को उठाने के लिए करें और ब्लेड से किसी भी ऊतक को हटाने के लिए फोर्सप्स का उपयोग करें।
  11. कटा हुआ ऊतक (ऊतक का अंतिम आकार: 500 μm x 500 μm x 1 mm क्यूब्स) को पूर्व-गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में धोने के लिए ट्रांसफर पिपेट और गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस + पेनस्ट्रेप का उपयोग करें। कटा हुआ ऊतक (38.5 डिग्री सेल्सियस) रखने के लिए शंक्वाकार ट्यूब को पानी या मोती स्नान पर वापस करें।
  12. चॉपिंग आर्म से अखरोट को हटाने के लिए नटड्राइवर का उपयोग करें, और वॉशर और ब्लेड को हटा दें। बल का उपयोग करके, ब्लेड को चॉपिंग आर्म से हटा दें, इसे पलट दें ताकि अप्रयुक्त किनारा पेट्री डिश का सामना कर रहा हो, और इसे वापस चॉपिंग आर्म पर रखें। ब्लेड कसक, वॉशर और अखरोट को बदलें, और चरण 2.5-2.7 में वर्णित तालिका रिलीज नॉब को रीसेट करें।
  13. अंडाशय से कॉर्टेक्स के सभी शेष टुकड़ों के लिए चरण 4.5-4.12 दोहराएं, प्रत्येक अत्याधुनिक का उपयोग करने के बाद ब्लेड को नए लोगों के साथ बदलें।
  14. सभी इस्तेमाल किए गए ब्लेड को एक कठोर दीवार वाले, प्लास्टिक शार्प कंटेनर में निपटाएं।

5. होमोजेनाइजेशन प्रक्रिया

  1. सुनिश्चित करें कि होमोजेनाइज़र इकाई ( सामग्री की तालिका देखें) प्लग इन है और गति दूसरी पट्टी (9,000-11,000 आरपीएम) पर सेट है। निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार इकाई में 10 मिमी जनरेटर जांच डालें।
  2. 1 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें और एक अंडाशय (चरण 4.11) से कटे हुए कॉर्टेक्स ऊतक वाले 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जांच डालें और ट्यूब को 25 एमएल लाइन में भरने के लिए पर्याप्त पीबीएस + पेनस्ट्रेप डालें। जिस गहराई तक जांच डाली जाती है, वह कक्ष के तल से मापी गई तरल की ऊंचाई का 1/3 होना चाहिए। भंवर को कम करने के लिए जांच को केंद्र से थोड़ा दूर रखें।
  3. टाइमर शुरू करें और होमोजेनाइज़र चालू करें। सुनिश्चित करें कि जांच का निचला हिस्सा ट्यूब को नहीं छूता है और होमोजिनाइज़र चालू होने पर ट्यूब को स्थिर रखता है।
  4. होमोजेनाइजेशन के 1 मिनट के बाद, ट्यूब से जांच को हटा दें। फोर्सप्स का उपयोग करके, वेंटिंग छेद और रोटर चाकू और रोटर ट्यूब के बीच की जगह को बंद करने वाले किसी भी संयोजी ऊतक को हटा दें। यदि कॉर्टेक्स के कोई भी टुकड़े जांच में फंस गए हैं, तो उन्हें बल के साथ हटा दें और उन्हें वापस ट्यूब में रखें।
  5. कुल 6 मिनट के समरूपीकरण के लिए चरण 5.2-5.4 एक अतिरिक्त 5x दोहराएं।
  6. ऊतक को गर्म रखने के लिए पानी या मोती स्नान में होमोजिनाइज्ड ऊतक के साथ ट्यूब रखें (38.5 डिग्री सेल्सियस)। अंतिम अंडाशय को संसाधित करने के बाद, निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार जनरेटर जांच को तुरंत अलग, साफ और सुखाएं।

6. निस्पंदन प्रक्रिया

  1. एरलेनमेयर फ्लास्क में डाले गए चीज़क्लॉथ से ढके फ़नल में बिखरे हुए ऊतक डालें। ट्यूब की सामग्री को गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस + पेनस्ट्रेप का उपयोग करके फ़नल में कुल्ला करें जब तक कि ट्यूब में कोई ऊतक टुकड़े न रहें।
  2. ऊतक के टुकड़ों के चारों ओर चीज़क्लॉथ को घुमाकर और निचोड़कर ऊतक के टुकड़ों को कपड़े के छेद से गुजरने के लिए मजबूर करें जब तक कि चीज़क्लॉथ से सभी अतिरिक्त तरल पदार्थ और ऊतक को हटा न दिया जाए।
  3. फ़नल के ऊपर चीज़क्लॉथ को फिर से खोलें, एक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके पीबीएस + पेनस्ट्रेप के साथ चीज़क्लॉथ को कुल्ला करें, और फिर से कपड़े के माध्यम से किसी भी अवशिष्ट ऊतक के टुकड़े निचोड़ें।
  4. 200 एमएल बीकर पर 300 μm सेल छन्नी रखने के लिए हेमोस्टैट का उपयोग करें। सेल छन्नी के माध्यम से एर्लेनमेयर फ्लास्क में छानना डालें। फ्लास्क की सामग्री को गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस + पेनस्ट्रेप का उपयोग करके सेल स्ट्रेनर में कुल्ला करें जब तक कि कोई ऊतक टुकड़ा न रह जाए।
    1. यदि सेल स्ट्रेनर ऊतक से भरा हो जाता है, तो धीरे से बीकर के खिलाफ सेल स्ट्रेनर को टैप करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी तरल बीकर में फ़िल्टर हो गए हैं, और फिर सेल स्ट्रेनर को उल्टा घुमाएं और बेंच पेपर पर बड़े ऊतक मलबे को टैप करें। बीकर के ऊपर सेल छन्नी को वापस करें और इसके माध्यम से छानना जारी रखें। आवश्यकतानुसार दोहराएं जब तक कि एर्लेनमेयर फ्लास्क से सभी छान नहीं गए हैं।
  5. एक दूसरे 200 एमएल बीकर पर 40 μm सेल छन्नी रखने के लिए हेमोस्टैट का उपयोग करें। सेल छन्नी के माध्यम से पहले 200 एमएल बीकर में छानना डालें। बीकर की सामग्री को गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस + पेनस्ट्रेप का उपयोग करके सेल छन्नी में कुल्ला करें जब तक कि कोई ऊतक टुकड़ा न रह जाए। 40 μm सेल छन्नी की सामग्री को न छोड़ें।
  6. 18 ग्राम सुई को 20 एमएल सिरिंज में फिट करें। सिरिंज को एफडब्ल्यूएम से भरें। एक चौकोर पेट्री डिश पर 40 μm सेल छन्नी को उल्टा घुमाएं और डिश में सेल छन्नी की सामग्री को धोने के लिए सिरिंज का उपयोग करें। सिरिंज को फिर से भरें और आवश्यकतानुसार सेल छन्नी को कुल्ला करें जब तक कि कोई ऊतक टुकड़ा न रह जाए।
    नोट: आमतौर पर, 25 एमएल एफडब्ल्यूएम 40 μm सेल छन्नी की सामग्री को पूरी तरह से कुल्ला करने के लिए पर्याप्त है।

Figure 2
चित्र 2: अंडाशय प्रसंस्करण और प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो के लिए वर्कस्पेस सेटअप। (A) चॉपिंग से पहले अंडाशय काटने और अंडाशय होमोजेनेट को फ़िल्टर करने के लिए बेंच सेटअप। (बी) होमोजिनाइज़र चरण के कंपन को कम करने के लिए स्टायरोफोम समर्थन के साथ ऊतक चॉपर और होमोजेनाइज़र स्थापित किया गया। (सी) एक पूरे अंडाशय के प्रसंस्करण के लिए वर्कफ़्लो को दर्शाने वाला योजनाबद्ध। अंडाशय को अतिरिक्त संयोजी ऊतक से काट दिया जाता है और फिर आधे में काट दिया जाता है, और मज्जा को तब तक हटा दिया जाता है जब तक कि कॉर्टेक्स का ~ 1 मिमी मोटा टुकड़ा न रह जाए। कॉर्टेक्स को 2.5 सेमी x 2.5 सेमी टुकड़ों में काटा जाता है और 500 μm के कट अंतराल पर सेट एक ऊतक चॉपर में काटा जाता है। टुकड़ों को तब समरूप किया जाता है, और होमोजेनेट को चीज़क्लॉथ के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है, जिसके बाद 300 μm और 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से निस्पंदन होता है। 40 μm सेल छन्नी की सामग्री को एक चौकोर पेट्री डिश में धोया जाता है, जिसे स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके रोम के लिए खोजा जाता है। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

7. रोम की खोज और संग्रह

  1. स्क्वायर पेट्री डिश (चरण 6.6) को 38.5 डिग्री सेल्सियस पर सेट गर्म चरण के साथ स्टीरियोस्कोप में स्थानांतरित करें। स्टीरियोस्कोप आवर्धन को खोजकर्ता की वरीयता के आधार पर 1.25x और 3.2x के बीच सेट किया जाना चाहिए।
  2. पिपेट एफडब्ल्यूएम की 10 μL बूंदों को 60 मिमी पेट्री डिश में डालते हैं और सूखने से रोकने के लिए बूंदों को खनिज तेल के साथ कवर करते हैं। पेट्री डिश को मीडिया ड्रॉप्स के साथ 38.5 डिग्री सेल्सियस पर सेट वार्मिंग प्लेट पर रखें।
    नोट: रोम एकत्र करने के लिए एक 4-वेल प्लेट का उपयोग किया जा सकता है। एक या दो कुओं में 500 μL वॉश मीडिया जोड़ें। वार्मिंग प्लेट पर 38.5 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. एक माइक्रोपिपेट प्लंजर और टिप प्राप्त करें।
    नोट: एक ग्लास 1-5 μL माइक्रोपिपेट ( सामग्री की तालिका देखें) की सिफारिश की जाती है क्योंकि रोम ग्लास पिपेट का पालन करने की संभावना कम होती है और समाधान के बीच स्थानांतरित होने पर खो जाती है। यह रोम के आसान और अधिक सटीक सूक्ष्म मैनिपुलेशन की अनुमति देने के लिए एक छोटा उपकरण भी है।
  4. स्क्वायर पेट्री डिश से रोम की पहचान करें और माइक्रोपिपेट का उपयोग करके मीडिया (एफडब्ल्यूएम) बूंदों में स्थानांतरित करें। कई रोम ऊतक मलबे में एम्बेडेड होने की संभावना है और नीचे वर्णित दो तरीकों में से एक का उपयोग करके पुनर्प्राप्त किया जा सकता है।
    नोट: रोम पूर्ण गोले के बजाय आयताकार होते हैं, और आम तौर पर एक अंडाणु होता है, जो कूप के केंद्र की ओर गहरे विरोधाभासों में एक ठोस सफेद सर्कल के रूप में प्रस्तुत होता है (चित्रा 3 ए-सी)। विकृत अंडाणुओं के साथ भ्रमित रोम से बचने के लिए ध्यान रखें। अंडाणु एकदम सही गोले होते हैं और एक मोटी, स्पष्ट झिल्ली (ज़ोना पेलुसीडा) से घिरे होते हैं। 10x (या अधिक) के आवर्धन के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग रोम की निकट परीक्षा के लिए किया जा सकता है (चित्रा 3 डी)।
    1. माइक्रोपिपेट या फाइन (27 जी) सुइयों की नोक का उपयोग करके मलबे से रोम को सावधानीपूर्वक अलग करें।
    2. वैकल्पिक रूप से, मलबे से रोम को हटाने के लिए डिश में मलबे को कई बार उठाने और बाहर निकालने के लिए रबर बल्ब के साथ एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
  5. कूप व्यवहार्यता को संरक्षित करने में मदद करने के लिए पेट्री डिश की खोज करने के लिए जल्दी से काम करें, 30 मिनट से अधिक समय नहीं लें।
  6. प्रति 10 μL ड्रॉप पर अधिकतम पांच रोम रखें, क्योंकि उच्च घनत्व रोम के एक साथ पालन करने की संभावना को बढ़ा सकता है।

8. ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण व्यवहार्यता परीक्षण

नोट: निम्नलिखित सभी चरणों के लिए पेट्री डिश या 4-वेल प्लेट के ढक्कन का उपयोग करें, क्योंकि रोम वास्तविक पकवान के प्लास्टिक की तुलना में ढक्कन के प्लास्टिक से कम चिपकते हैं।

  1. पीबीएस के 50 एमएल में 100 मिलीग्राम पीवीपी को भंग करके पीबीएस + 0.2% पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन (पीवीपी) तैयार करें।
    नोट: पीवीपी का उपयोग यहां पकवान से जुड़े रोम की संभावना को कम करने के लिए किया जाता है।
  2. मीडिया ड्रॉप से सभी रोम (औसत 40) को पीबीएस + 0.2% पीवीपी की 50 μL बूंद में स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोपिपेट का उपयोग करें।
  3. रोम 2x को क्रमिक रूप से पीबीएस + 0.2% पीवीपी की ताजा 50 μL बूंदों में स्थानांतरित करके धोएं।
  4. रोम को पीबीएस + 0.2% पीवीपी की 285 μL बूंद में स्थानांतरित करें।
  5. पीबीएस + 0.2% पीवीपी (0.05% ट्रिपैन ब्लू की अंतिम सांद्रता) की 285 μL बूंद में ट्राइपैन ब्लू का 15 μL जोड़ें और 200 μL पिपेट टिप सेट का उपयोग करके 100 μL तक बूंद को सावधानीपूर्वक मिलाएं।
    नोट: यदि ट्रिपैन व्यवहार्यता परीक्षण के लिए 4-वेल प्लेट का उपयोग कर रहे हैं, तो एक कुएं में पीबीएस + 0.2% पीवीपी का 475 μL और ट्रिपैन ब्लू का 25 μL जोड़ें।
  6. ट्रिपैन ब्लू ड्रॉप में 1 मिनट के लिए रोम को इनक्यूबेट करें, और फिर रोम को पीबीएस + 0.2% पीवीपी के 50 μL ड्रॉप (या 500 μL वेल) में स्थानांतरित करें।
  7. चरण 8.3 के अनुसार रोम को पीबीएस + 0.2% पीवीपी के ताजा 50 μL बूंदों (या 500 μL प्रति अच्छी तरह से) के साथ धोएं।
  8. पीबीएस + 0.2% पीवीपी में तीन धोने के बाद भी नीले दिखाई देने वाले किसी भी रोम को छोड़ दें, क्योंकि ये गैर-व्यवहार्य हैं। कोई भी रोम जो तीन धोने के बाद नीले रंग को बनाए नहीं रखता है, व्यवहार्य है और इसका उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस, संस्कृति या अन्य प्रक्रियाओं (चित्रा 3 ई) के लिए किया जा सकता है। तरल नाइट्रोजन में रोम को स्नैप-फ्रीज करें और यदि आवश्यक हो तो आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. चरण 9 और 10 में वर्णित के रूप में रोम के आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करें।

Figure 3
चित्र 3: पृथक रोम और ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण परीक्षण( A-C) पृथक रोम को कई आवर्धन पर स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के माध्यम से चित्रित किया गया था। (ए) प्रारंभिक खोज डिश के भीतर मलबे के बीच अलग-अलग रोम। अलग-अलग रोम लाल रंग में घेरे हुए हैं। स्केल बार = 2,000 μm. (B) खनिज तेल से ढके कूप धोने के माध्यम की एक बूंद के भीतर पृथक रोम और मलबे। स्केल बार = 1,000 μm. (C) उच्च आवर्धन पर मलबे के बिना पृथक रोम। स्केल बार = 1,000 μm. (D) एक उल्टे ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित पृथक रोम। स्केल बार = 100 μm. (E) एक उल्टे ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप और 20x उद्देश्य का उपयोग करके चित्रित व्यवहार्य (बिना दाग वाले) और गैर-व्यवहार्य (नीले दाग) रोम की प्रतिनिधि छवियां। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

9. आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण

  1. आरएनए अलगाव अभिकर्मक का उपयोग करके व्यवहार्य रोम (चरण 8.8 से) से आरएनए को अलग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्लीनअप किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके आरएनए को शुद्ध करें और डीनेस के साथ इलाज करें।
  2. आरएनए को 14 μL RNase-मुक्त पानी के साथ मिलाएं और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित करें। सीडीएनए संश्लेषण तक आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीडीएनए संश्लेषण किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके प्राथमिक और प्रारंभिक माध्यमिक रोम से निकाले गए आरएनए की समान मात्रा से सीडीएनए संश्लेषण करें। प्रतिक्रिया मिश्रण को 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए और उसके बाद 42 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके प्रतिक्रिया को समाप्त करें।
  4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग करके संश्लेषित सीडीएनए (5 एनजी प्रति प्रतिक्रिया) और प्राइमरों (तालिका 1) के साथ आरटी-क्यूपीसीआर करें ( सामग्री की तालिका देखें)। थर्मल साइक्लिंग स्थितियों का उपयोग करें: पोलीमरेज़ सक्रियण के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, इसके बाद प्रवर्धन के 40 चक्र, जहां प्रत्येक चक्र में विकृतीकरण के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस और एनीलिंग / विस्तार के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस शामिल थे। चक्र सीमा (सीटी) मानों को निर्धारित करके आरटी-क्यूपीसीआर का विश्लेषण करें और / या एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों को देखें।
    नोट: इस अध्ययन में ग्रैनुलोसा सेल मार्कर एफएसएचआर और जर्म सेल मार्कर डीएजेडएल की प्रतिलेख अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया गया था। संदर्भ जीन एच 2 ए और एसीटीबी थे।
  5. तापमान को 65 डिग्री सेल्सियस से 0.5 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाकर हर 5 सेकंड में तापमान बढ़ाकर पिघल वक्र विश्लेषण चलाएं जब तक कि यह 95 डिग्री सेल्सियस तक नहीं पहुंच जाता।

10. इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण

  1. कमरे के तापमान (आरटी) पर 4% (v/v) पैराफॉर्मलडिहाइड (PFA) की 100° L गिरावट में 15 मिनट के लिए व्यवहार्य रोम (चरण 8.8 से) ठीक करें, इसके बाद PBS + 0.1% बीएसए + 0.1% ट्वीन 20 की 100 μL बूंदों में 3x धोएं।
  2. 1x PBS + 5% (v/v) सामान्य गधे सीरम (एनडीएस) से युक्त ब्लॉकिंग बफर में आरटी पर 1 घंटे के लिए रोम को ब्लॉक करें। ब्लॉक करने के बाद, रोम को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 μl खरगोश एंटी-ह्यूमन CX37 एंटीबॉडी या 4 μg / mL खरगोश आइसोटाइप IgG (नकारात्मक नियंत्रण) की बूंद में इनक्यूबेट करें।
  3. रोम छिद्रों को पीबीएस + 0.1% बीएसए + 0.1% ट्वीन 20 की 100 μL बूंदों में 3x धोएं, और फिर उन्हें अंधेरे में आरटी में 1 घंटे के लिए 2 μg / mL गधे-विरोधी खरगोश एलेक्साफ्लोर 488 द्वितीयक एंटीबॉडी की 100 μL बूंद में इनक्यूबेट करें।
  4. डीएनए लेबल करने के लिए बफर को अवरुद्ध करने में पतला 1 μg/mL Hoechst 33342 की 100 μL बूंद में अंधेरे में आरटी में 5 मिनट के लिए रोम को इनक्यूबेट करें।
  5. रोम को ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंटिंग मीडिया ( सामग्री की तालिका देखें) की 5 μL बूंद में स्थानांतरित करें और कवर स्लिप के साथ कवर करें। रात भर आरटी पर इलाज करने के लिए स्लाइड छोड़ दें, इसके बाद नेल पॉलिश के साथ सील करें। इमेजिंग तक उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. कवर फिसलने के 48 घंटे के भीतर सभी स्लाइड्स को चित्रित करें। डीएपीआई (उत्तेजना 380 एनएम और उत्सर्जन 450 एनएम) और एफआईटीसी (उत्तेजना 470 एनएम और उत्सर्जन 525 एनएम) फिल्टर के तहत एक उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके इमेजिंग करें।
  7. दोनों चैनलों के लिए एक्सपोजर समय तय करें। खरगोश आइसोटाइप नकारात्मक नियंत्रण के आधार पर एफआईटीसी (सीएक्स 37) एक्सपोजर समय समायोजित करें। खरगोश आइसोटाइप-लेबल रोम की पहचान करने के लिए 20x उद्देश्य और DAPI चैनल सेट 50 ms एक्सपोज़र समय का उपयोग करें।
  8. एफआईटीसी चैनल के तहत इन रोम को चित्रित करें, और सभी पृष्ठभूमि ग्रीन सिग्नल को समाप्त करने तक एक्सपोजर समय को कम करें। इस एक्सपोजर समय पर ध्यान दें।
  9. आइसोटाइप एफआईटीसी चैनल के लिए निर्धारित एक्सपोजर समय और डीएपीआई चैनल के लिए 50 एमएस एक्सपोज़र समय का उपयोग करके सभी सीएक्स 37 एंटीबॉडी-लेबल रोम को चित्रित करें।
  10. सिग्नल तीव्रता को संसाधित करें, जैसा कि थ्रेशोल्डिंग के बाद औसत ग्रे क्षेत्र द्वारा मापा जाता है, कंप्यूटर छवि प्रसंस्करण प्रोग्राम29 का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. प्रत्येक कूप के लिए DAPI छवि की टिफ़ फ़ाइल को समायोजित करें ताकि पूरे कूप को रेखांकित किया जा सके। रुचि के क्षेत्र (आरओआई) के रूप में पूरे कूप का चयन करने के लिए प्रोग्राम के विश्लेषण कण फ़ंक्शन का उपयोग करें।
    2. संबंधित कूप के लिए एफआईटीसी छवि की टिफ फ़ाइल खोलें और एफआईटीसी छवि के शीर्ष पर डीएपीआई छवि से उत्पन्न आरओआई को ओवरले करें। एफआईटीसी छवि के औसत ग्रे क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए कार्यक्रम के माप फ़ंक्शन का उपयोग करें, जो सिग्नल तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है।

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Representative Results

अवलोकन और महत्वपूर्ण कदम
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, छोटे गोजातीय प्रीएंट्राल रोम को प्रयोगात्मक रूप से प्रासंगिक संख्याओं में एकल अंडाशय से मज़बूती से अलग किया जा सकता है। कुल 30 प्रतिकृतियों से, प्रति प्रतिकृति औसतन 41 रोम प्राप्त किए गए थे, जिसमें 11 से 135 रोम (चित्रा 4 ए) की सीमा थी। 14 प्रतिकृतियों में, रोम को विकास के चरण के लिए चित्रित किया गया था जैसा कि पहले वर्णित किया गया था26 स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे 1 μm माइक्रोस्कोप अंशांकन स्लाइड का उपयोग करके कूप व्यास को मापकर। इस विधि का उपयोग करते हुए, कुल 476 रोम को प्राथमिक (40-79 μm मापने वाले रोम), प्रारंभिक माध्यमिक (80-119 μm), या द्वितीयक (≥120 μm) रोम (चित्रा 4B) के रूप में वर्गीकृत किया गया था। 40 μm निस्पंदन चरण के कारण आदिम रोम को बाहर रखा गया था। कूप व्यवहार्यता का मूल्यांकन ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण परीक्षण का उपयोग करके किया गया था जैसा कि पहले30 वर्णित है। पृथक रोम को संक्षेप में पीबीएस में 0.05% (वी / वी) ट्रिपैन ब्लू में 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था, जिसमें 0.2% पीवीपी था, इसके बाद पीबीएस + पीवीपी के साथ तीन वॉश और स्टीरियोस्कोप के तहत परीक्षा की गई थी। वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, 100% पृथक रोम सभी प्रतिकृतियों में व्यवहार्य थे। कुल मिलाकर, पेट्री डिश की खोज से तुरंत पहले तक अंडाशय संग्रह से यांत्रिक अलगाव प्रक्रिया में लगभग 30-45 मिनट लगते हैं। रोम की खोज और पहचान करने में 30 मिनट से अधिक समय नहीं लगता है, जिसके परिणामस्वरूप एक प्रक्रिया होती है जिसमें प्रति अंडाशय कुल 1-1.25 घंटे लगते हैं।

इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि डिम्बग्रंथि ऊतक ठीक से समरूप है। होमोजेनाइजेशन समय को 5 मिनट से 6 मिनट तक बढ़ाने से अलग किए गए रोम की संख्या में वृद्धि हुई (पी < 0.05)। 6 मिनट के होमोजेनाइजेशन का उपयोग करके 30 परीक्षणों से प्रति अंडाशय औसतन 41 रोम को अलग किया गया था, जो 5 मिनट के होमोजेनाइजेशन समय के साथ 22 परीक्षणों से प्राप्त प्रति अंडाशय 13.8 रोम के औसत से लगभग तीन गुना वृद्धि है (चित्रा 5)। एक और महत्वपूर्ण कदम होमोजेनाइजेशन गति है, जो 9,000-11,000 आरपीएम के भीतर रहना चाहिए। उच्च गति से पैदावार में कमी आती है, संभवतः अत्यधिक क्षति और / या रोम के टूटने के कारण। रबर बल्ब के साथ ग्लास पाश्चर पिपेट के माध्यम से खोज डिश की सामग्री को कई बार पारित करके निस्पंदन चरणों के बाद कूप अलगाव में और सुधार किया जा सकता है। पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, रोम मलबे से हटा दिए जाते हैं, और पकवान में अधिक रोम देखे जा सकते हैं।

यदि अलगाव के बाद रोम को सुसंस्कृत किया जाना है, तो माइक्रोबियल संदूषण को कम करना महत्वपूर्ण है। पूरे अंडाशय से किसी भी अतिरिक्त संयोजी ऊतक और वसा को ट्रिम करके और फिर धोने के चरणों की एक श्रृंखला करके संदूषण को रोका जा सकता है। माइक्रोबियल लोड को कम करने के लिए छंटनी किए गए अंडाशय को संक्षेप में 70% इथेनॉल में धोया जाना चाहिए, इसके बाद 70% इथेनॉल को धोने और किसी भी संभावित सूक्ष्मजीवों को हटाने के लिए गर्म (38.5 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस + पेनस्ट्रेप समाधान में कई धोए जाने चाहिए। ये धुलाई कूप व्यवहार्यता से समझौता किए बिना की जा सकती है। संदूषण को रोकने के लिए, निष्फल उपकरणों के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट या स्वच्छ बेंच के अंदर पूरे अलगाव प्रोटोकॉल को करना संभव है।

आरएनए अलगाव और आरटी-क्यूपीसीआर
एक ही चरण के रोम और अलग-अलग अलगाव से पूल किए गए थे, और एमआरएनए अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए कुल 46 प्राथमिक और 34 प्रारंभिक माध्यमिक रोम का उपयोग किया गया था। आरएनए को पूल किए गए रोम (प्राथमिक रोम = कुल आरएनए के 259 एनजी और प्रारंभिक माध्यमिक रोम = कुल आरएनए के 91 एनजी) से अलग किया गया था और सीडीएनए संश्लेषण के लिए उपयोग किया गया था। रोम में ग्रैनुलोसा सेल मार्कर एफएसएचआर19 और जर्म सेल मार्कर डीएजेडएल की प्रतिलेख अभिव्यक्ति का मूल्यांकन आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, प्राथमिक और प्रारंभिक माध्यमिक रोम दोनों ने एफएसएचआर और डीएजेडएल प्रतिलेख व्यक्त किए, मानव रोम31 में एक पिछली रिपोर्ट की पुष्टि की और यह प्रदर्शित किया कि एफएसएचआर विकास के प्राथमिक चरण में गोजातीय रोम में व्यक्त कियाजाता है 32 (चित्रा 6 ए, बी)।

कॉनेक्सिन 37 का इम्यूनोफ्लोरेसेंट स्थानीयकरण
प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्थानीयकरण पूरे रोम में किया जा सकता है। यहां, इस तकनीक का उपयोग प्राथमिक और प्रारंभिक माध्यमिक दोनों चरणों में पृथक प्रीएंट्राल रोम में गैप जंक्शन प्रोटीन कॉनेक्सिन 37 (सीएक्स 37) को स्थानीयकृत करने के लिए किया गया था। सीएक्स 37 कूप के अंडाणु और ग्रैनुलोसा कोशिकाओं के बीच संचार के लिए महत्वपूर्ण है और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण33 में गोजातीय प्रजातियों में कूप विकास के सभी चरणों में दोनों सेल प्रकारों में पहचाना गया है। ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण परीक्षण के बाद, व्यवहार्य रोम को पीएफए में तय किया गया था और खरगोश विरोधी मानव सीएक्स 37 एंटीबॉडी या खरगोश आइसोटाइप आईजीजी (नकारात्मक नियंत्रण) के साथ इनक्यूबेट किया गया था, इसके बाद गधे-विरोधी खरगोश एलेक्साफ्लोर 488 द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन किया गया था। डीएनए लेबल करने के लिए होचस्ट 33342 का उपयोग किया गया था। डीएपीआई और एफआईटीसी फिल्टर के तहत उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रोम को चित्रित किया गया था, और सिग्नल तीव्रता की मात्रा निर्धारित की गई थी। सीएक्स 37 को ओप्लाज्म के लिए स्थानीयकृत पाया गया था, हालांकि विशेष रूप से अंडाणु नाभिक से अनुपस्थित था, और ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की झिल्ली (चित्रा 7)। ये परिणाम सीएक्स 37 के ज्ञात स्थानीयकरण के अनुरूप हैं, जो ग्रैनुलोसा कोशिकाओं33 के अंडाणु और झिल्ली के लिए है। सेल संचार और कूप विकास के लिए महत्वपूर्ण माने जाने वाले प्रोटीन का इम्यूनोलोकलाइजेशन, जैसे कि सीएक्स 37 (यहां दिखाया गया है) और एफएसएचआर32 प्रीएंट्रल रोम के विकास, कूप विकास, संरचना और गुणवत्ता पर हस्तक्षेप के प्रभावों का अध्ययन करने के साथ-साथ विवो-प्राप्त और इन विट्रो-सुसंस्कृत रोम में तुलना करके संस्कृति प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

जीन अग्रेषण अनुक्रम (5'-3') रिवर्स अनुक्रम (5'-3') उत्पाद का आकार (बीपी)
FSHR सीसीसी एएसी टीसीजी एटीजी एजीसी टीजीए एटीसी टी कैट एजीसी टैग जीसीए जीजीजी एएसी जीजी 132
DAZL जीसीसी सीएसी एएए एजीए एएटी सीटीजी टीजीजी ए एसीटी टीएए जीसीए सीटीजी सीसीसी जीएसी टीटी 156
H2A GAG GAG CTG AAC AAG CTG TTG टीटीजी टीजीजी सीटीसी टीसीए जीटीसी टीटीसी 104
ACTB सीटीसी टीटीसी कैग सीसीटी टीसीसी टीटीसी सीटी जीजीजी कैग टीजीए टीसीटी सीटीटी टीसीटी जीसी 178

तालिका 1: आरटी-क्यूपीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों की सूची।

Figure 4
चित्र 4: पृथक प्रीएंट्राल रोम की संख्या और विकास चरण। (A) 6 मिनट ऊतक समरूपीकरण (n = 30 प्रतिकृति) का उपयोग करके प्रति प्रतिकृति पृथक प्रीएंट्राल रोम की कुल संख्या। रोम की औसत संख्या सलाखों के पार लाल रेखा द्वारा दर्शायी जाती है। (बी) 14 प्रतिकृतियों में, पृथक रोम के विकास चरण को दर्ज किया गया था। पाई चार्ट पृथक कुल रोम (एन = 476) के अनुपात के रूप में विकास चरणों के वितरण को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: 5- बनाम 6-मिनट होमोजेनाइजेशन की तुलना। 6 मिनट के लिए डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के समरूपीकरण ने 5 मिनट के लिए समान गति से समरूपीकरण की तुलना में अधिक संख्या में प्रीएंट्राल रोम उत्पन्न किए (एन = 22 5 मिनट के लिए प्रतिकृति और 6 मिनट के लिए 30 प्रतिकृतियां; पी < 0.01)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: पृथक प्रीएंट्राल रोम में व्यक्त प्रतिलेख का रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन मात्रात्मक पीसीआर। प्राथमिक और प्रारंभिक माध्यमिक प्रीएंट्राल रोम ने ग्रैनुलोसा कोशिकाओं (एफएसएचआर), रोगाणु कोशिकाओं (डीएजेडएल), और संदर्भ जीन (एच 2 ए और एसीटीबी) के मार्करों के लिए एमआरएनए प्रतिलेख व्यक्त किए। (ए) संबंधित बेस जोड़ी (बीपी) उत्पाद आकार के साथ प्रत्येक जीन के लिए पीसीआर उत्पादों का एगारोस जेल। (बी) संदर्भ जीन एसीटीबी के सापेक्ष एफएसएचआर और डीएजेडएल प्रतिलेख की अभिव्यक्ति निर्धारित की गई थी। एनटीसी = गैर-टेम्पलेट नियंत्रण, सीटी = चक्र सीमा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: पृथक प्रीएंट्राल रोम में सीएक्स 37 का इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्थानीयकरण। प्राथमिक (ए) और प्रारंभिक माध्यमिक (बी) गोजातीय प्रीएंट्राल कूप में सीएक्स 37 इम्यूनोलोकलाइजेशन की प्रतिनिधि छवियां। (सी) प्रारंभिक द्वितीयक गोजातीय प्रीएंट्राल कूप में नकारात्मक नियंत्रण खरगोश आइसोटाइप लेबलिंग की प्रतिनिधि छवि। बाएं पैनल: डीएनए लेबलिंग (DAPI)। मध्य पैनल: प्राथमिक एंटीबॉडी खरगोश एंटी-ह्यूमन सीएक्स 37 लेबलिंग (एफआईटीसी)। दायां पैनल: DAPI और FITC का विलय हो गया। स्केल बार = 50 μm. (D) कूप विकास चरण के अनुसार औसत CX37 सिग्नल तीव्रता (n = 21 प्राथमिक और 11 प्रारंभिक द्वितीयक रोम दो प्रतिकृतियों में)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल में गोजातीय अंडाशय से प्रारंभिक चरण प्रीएंट्राल रोम, विशेष रूप से प्राथमिक और प्रारंभिक माध्यमिक चरणों में पुनः प्राप्त करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का विवरण दिया गया है। यह प्रोटोकॉल पिछली रिपोर्ट 20,25,30,34,35,36 पर आधारित है और अनुकूलन प्रदान करता है जिसके परिणामस्वरूप एक व्यक्तिगत अंडाशय से रोम की सार्थक संख्या का अलगाव होता है। इस विधि का उपयोग करके पृथक प्रीएंट्राल रोम व्यवहार्य हैं और जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए प्रोटीन के इम्यूनोलोकलाइजेशन और आरएनए निष्कर्षण जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस अध्ययन में पृथक रोम की खेती का प्रयास नहीं किया गया था। हालांकि, वर्तमान में छोटे गोजातीय प्रीएंट्राल फॉलिकल्स की सफल दीर्घकालिक संस्कृति को प्राप्त करने के प्रयास चल रहे हैं, जो इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग होगा जो डिम्बग्रंथि फॉलिकुलोजेनेसिस की समझ में सुधार करने, विष विज्ञान परीक्षण करने और प्रजनन संरक्षण के लिए रोम में सफलतापूर्वक हेरफेर करने के तरीके तैयार करने में मदद करेगा।

इन प्रयोगों के डेटा से पता चलता है कि डिम्बग्रंथि कॉर्टिकल ऊतक और कूप रिलीज के उचित फैलाव के लिए 6 मिनट का होमोजेनाइजेशन महत्वपूर्ण है (चित्रा 4)। अतिरिक्त कदम जो ऊतक के पूरी तरह से समरूपीकरण में योगदान करते हैं, वे मज्जा से कॉर्टेक्स का प्रारंभिक विच्छेदन है जो कॉर्टेक्स (~ 1 मिमी) की उचित मोटाई सुनिश्चित करता है, अतिरिक्त संयोजी ऊतक को ट्रिम करता है, और कॉर्टेक्स को छोटे टुकड़ों में काटता है। ये कदम होमोजेनाइज़र जांच और खोज प्लेट में अनावश्यक मलबे को बंद करने से रोकते हैं। अवांछित आकार और चरण के मलबे और रोम को छोड़कर सेल स्ट्रेनर छिद्र आकार महत्वपूर्ण है; इस प्रोटोकॉल के मामले में, अंतिम चरण 40 μm सेल छन्नी की सामग्री एकत्र कर रहा है ताकि आदिम रोम को बाहर किया जा सके, जो आमतौरपर मवेशियों में <40 μm व्यास के होते हैं। अंत में, खोज डिश में मलबे से रोम को हटाने के लिए पाश्चर पिपेट का उपयोग करने की सिफारिश मलबे से रोम को मैन्युअल रूप से विच्छेदित करने के प्रयास पर की जाती है, क्योंकि बाद की तकनीक के लिए अधिक तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है और यदि अनुचित तरीके से किया जाता है, तो रोम को नुकसान पहुंचा सकता है।

हालांकि यह प्रोटोकॉल मौजूदा तरीकों की तुलना में सुधार प्रस्तुत करता है, लेकिन ऐसी सीमाएं हैं जिन पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, डिम्बग्रंथि कूप आबादी15 की विषम प्रकृति और जानवरों के अज्ञात इतिहास के कारण, जिनसे अंडाशय को पुनर्प्राप्त किया गया था, इस प्रोटोकॉल को करने के बाद अलग किए गए रोम की संख्या अत्यधिक परिवर्तनशील थी। एक कारक जिस पर विचार किया जाना चाहिए वह पशु आयु है, क्योंकि डिम्बग्रंथि रिजर्व को37 वर्ष की आयु के साथ कम होने के लिए जाना जाता है।

गोजातीय अंडाशय से छोटे प्रीएंट्राल रोम का अलगाव एकल-नमूना स्तर पर बुनियादी वैज्ञानिक प्रश्नों की जांच करने के अवसर प्रदान करता है, एक दृष्टिकोण जो पहले संचालित करना मुश्किल रहा है। उदाहरण के लिए, यहां मूल्यांकन किए गए सभी प्रीएंट्राल फॉलिकल चरणों ने सीएक्स 37 की अभिव्यक्ति दिखाई, जो अंडाणु-ग्रैनुलोसा सेल संचार के लिए एक महत्वपूर्ण प्रोटीन है। इसी तरह, एफएसएच रिसेप्टर की अभिव्यक्ति पहले व्यक्तिगत रूप से पृथक प्रीएंट्राल फॉलिकल्स32 में प्रदर्शित की गई है। ग्रैनुलोसा कोशिकाओं के अन्य विशिष्ट मार्कर, जैसे कि स्टेरॉयडोजेनिक एंजाइम CYP17 और CYP1938, प्रीएंट्राल रोम के जीन / प्रोटीन अभिव्यक्ति पैनल के लिए प्रासंगिक परिवर्धन होंगे, और भविष्य की परियोजनाओं का विषय होंगे। नियमित या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से संपूर्ण कूपिक संरचना का विज़ुअलाइज़ेशन हिस्टोलॉजिकल परीक्षा की तुलना में अधिक व्यापक है, जहां एक समय में कूप के केवल एक खंड का विश्लेषण किया जा सकता है। यह उन अध्ययनों में विशेष रूप से फायदेमंद है जो इम्यूनोस्टेनिंग या सीटू संकरण का उपयोग करना चाहते हैं, जहां अभिव्यक्ति के विस्तृत स्थानिक स्थानीयकरण की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, आरटी-क्यूपीसीआर30 के लिए संवेदनशील किट का उपयोग करके एकल-कूप जीन अभिव्यक्ति की जांच के लिए पृथक प्रीएंट्राल फॉलिकल्स का उपयोग किया जा सकता है। व्यक्तिगत रूप से और डिम्बग्रंथि के पर्यावरण के प्रभाव के बिना रोम का विश्लेषण करने की क्षमता प्रीएंट्राल फॉलिकुलोजेनेसिस की जटिलता को समझने में एक महत्वपूर्ण कदम है।

डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक का क्रायोप्रिजर्वेशनमहिला स्तनधारियों में प्रजनन क्षमता की सुरक्षा के लिए एक आशाजनक तकनीक बन गया है, जिसमें महिलाएं40 भी शामिल हैं। प्रीएंट्रल फॉलिकल्स का उपयोग करके प्रजनन क्षमता का संरक्षण और बहाली एक आकर्षक सहायक प्रजनन तकनीक के साथ-साथ फॉलिकुलोजेनेसिस41 का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक विधि प्रस्तुत करती है। ठंड और पिघलने के बाद, ऊतक को व्यवहार्य प्रीएंट्राल रोम की पुनर्प्राप्ति के लिए इस अलगाव प्रोटोकॉल के अधीन किया जा सकता है। यद्यपि पहले क्रायोप्रिजर्व किए गए ऊतक से रोम को पुनः प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल की संभावित क्षमता का विशेष रूप से मूल्यांकन नहीं किया गया था, दूसरों ने सफलता का प्रदर्शन किया है और इन विट्रो कल्चर42,43,44,45 के लिए जमे हुए-पिघले हुए ऊतक से अलग व्यवहार्य छोटे प्रीएंट्राल रोम का उपयोग किया है। इसके अलावा, ताजा पृथक प्रीएंट्राल रोम को व्यक्तिगत रूप से विट्रीफिकेशन के माध्यम से क्रायोप्रिजर्व किया जा सकता है और संरचनात्मक अखंडता बनाए रखा जा सकताहै।

गोजातीय जैसी बड़ी स्तनधारी प्रजातियों से प्रीएंट्राल रोम के कुशल अलगाव के लिए विवरण पर एक अपडेट साहित्य में गायब है। इसके अलावा, गोजातीय प्रीएंट्राल रोम को अलग करने के तरीके पर एक दृश्य और स्पष्ट मार्गदर्शिका की बहुत आवश्यकता है, क्योंकि प्रजनन क्षमता की कमी क्षेत्र में एक अड़चन रही है। हाल ही में, बस एट अल .36 ने एक यांत्रिक विधि का उपयोग करके गोजातीय प्रीएंट्राल रोम के अलगाव का वर्णन किया, जिसमें प्रति अंडाशय 6.1 प्राथमिक रोम की गणना औसत उपज थी। यहां वर्णित यांत्रिक अलगाव विधि के परिणामस्वरूप प्रति अंडाशय औसतन 41 प्रीएंट्राल रोम का अलगाव होता है, जिनमें से अधिकांश प्राथमिक चरण में होते हैं। इसलिए, यह तकनीक प्राथमिक कूप शरीर विज्ञान और विकास पर केंद्रित अध्ययनों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। प्राथमिक रोम बढ़ते पूल के पहले चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं और डिम्बग्रंथि प्रांतस्था में प्रचुर मात्रा में होते हैं। इसलिए, वर्णित तकनीक का उपयोग, जो इस विकास चरण को काटने के लिए अनुकूलित है, उपन्यास है और आदिम रोम के अधिक कठिन हेरफेर से बचते हुए डिम्बग्रंथि रिजर्व का लाभ उठाने के लिए विशेष रूप से वांछनीय हो सकता है। प्राथमिक रोम को अलग करने का एक अन्य लाभ आगे की संस्कृति के लिए प्राथमिक रोम के बाद के अलगाव के साथ आदिम रोम के प्रारंभिक सक्रियण के लिए डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति को जोड़ना होगा। अधिक प्रचुर मात्रा में प्राथमिक चरण से रोम की खेती में रुचि को देखते हुए, यहां प्रस्तुत विधि शोधकर्ताओं को उन रास्तों को आगे बढ़ाने के लिए प्रोत्साहित कर सकती है जिन्हें वे पहले प्राथमिक रोम को अलग करने की चुनौती के कारण टाल सकते थे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस परियोजना को आंशिक रूप से यूएसडीए मल्टी-स्टेट प्रोजेक्ट डब्ल्यू 4112 और एसएम को यूसी डेविस जेस्ट्रो शील्ड्स पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

लेखक सभी प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले गोजातीय अंडाशय प्रदान करने के लिए सेंट्रल वैली मीट, इंक की सराहना करना चाहते हैं। लेखक ों ने अंडाशय प्रसंस्करण और कूप अलगाव के साथ सहायता के लिए ओलिविया सिल्वरा को भी धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette Duran Wheaton Kimble 63A54 Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining
20 mL Luer-lock Syringe Fisher Scientific Z116882-100EA Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
#21 Sterile Scalpel Blade Fisher Scientific 50-365-023 Used to cut the ovaries and remove the medula
40 μm Cell Strainer Fisher Scientific  22-363-547 Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer
104 mm Plastic Funnel Fisher Scientific 10-348C Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over
300 μm Cell Strainer pluriSelect  43-50300-03 Used to filter the filtrate from the cheese cloth 
500 mL Erlenmeyer Flask Fisher Scientific FB500500 Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth 
Air-Tite Sterile Needles 18 G Thermo Fisher Scientific 14-817-151 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm Fisher Scientific 14-817-171 Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck
BD Hoechst 33342 Solution Fisher Scientific BDB561908 Fluorescent DNA stain
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030-100G  Component of follicle wash media
Cheese Cloth Electron Microscopy Sciences 71748-00 First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris
Classic Double Edge Safety Razor Blades Wilkinson Sword N/A Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Fisher Scientific A-21206 Secondary antibody for immunostaining
Eisco Latex Pipette Bulbs Fisher Scientific S29388 Rubber bulb to use with Pasteur pipettes
HEPES Buffer Sigma-Aldrich H3375 Component of follicle wash media
Homogenizer VWR 10032-336 Homogenize the ovarian tissue to release follicles 
ImageJ/Fiji NIH v2.3.1 Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization
McIlwain Tissue Chopper Ted Pella 10184 Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization
Microscope - Stereoscope Olympus SZX2-ILLT Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate
Microscope - Inverted Nikon Diaphot 300 Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles
Microscope - Inverted ECHO Revolve R4 Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles
Mineral Oil Sigma-Aldrich M8410-1L Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching
Non-essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-050 Component of follicle wash medium
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-001 Reagent for immunostaining blocking buffer
Nunc 4-well Dishes for IVF Thermo Fisher Scientific 144444 4-well dishes for follicle isolation and washing
Penicillin-Streptomycin Solution 100x Gibco 15-140-122 Component of follicle wash medium
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm Ted Pella 10184-04 Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP665-1 Washing buffer for ovaries and follicles
Plastic Cutting Board Fisher Scientific 09-002-24A Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Fisher Scientific BP431-100 Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other 
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue
Qiagen RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA column clean-up kit
R The R Foundation v4.1.2 Statistical analysis software
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody Abcam ab181701 Cx37 primary antibody for immunostaining
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific K1691 cDNA synthesis kit
Rstudio RStudio, PBC v2021.09.2 Statistical analysis software
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) Fisher Scientific SS266-1 Used to increase media pH to 7.6-7.8
Sodium Pyruvate (NaPyr) Gibco 11360-070 Component of follicle wash medium
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm  Thermo Fisher Scientific 60872-310 Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles 
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix BioRad 1725271 Mastermix for PCR reaction
Steritop Threaded Bottle Top Filter Sigma-Aldrich S2GPT02RE Used to sterilize follicle wash medium
SYBR-safe DNA gel stain Thermo Fisher Scientific S33102 Staining to visual PCR products on agarose gel
TCM199 with Hank’s Salts Gibco 12-350-039 Component of follicle wash medium
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Detergent for immunostaining permeabilization buffer
Trizol reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 RNA isolation reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15-250-061 Used for testing viability of isolated follicles
Tween 20 Detergent for immunostaining wash buffer
Warmer Plate Universal WTA 20931 Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope
Wiretrol II Calibrated Micropipets Drummond 50002-005 Glass micropipettes to manipulate follicles

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References

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जीव विज्ञान अंक 187
विखंडन, समरूपीकरण और सीरियल निस्पंदन के संयोजन का उपयोग करके बोवाइन अंडाशय से छोटे प्रीएंट्राल फॉलिकल्स का अलगाव
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McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., … More

McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration. J. Vis. Exp. (187), e64423, doi:10.3791/64423 (2022).

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