Dissecção do ducto biliar extra-hepático e da vesícula biliar em neonatos de camundongos com nove dias de idade

Resumo

Para a observação de distúrbios do ducto biliar neonatal murino, um ducto biliar intacto e uma preparação eficiente são necessários. Portanto, uma nova abordagem para isolar todo o sistema do ducto biliar extra-hepático em neonatos murinos foi desenvolvida com sucesso, mantendo a integridade do ducto biliar.

Resumo

A dissecção dos ductos biliares neonatais murinos tem sido descrita como difícil. O principal objetivo do procedimento cirúrgico padrão descrito é o isolamento do ducto biliar extra-hepático (EBD) em neonatos de camundongos sem danificar o ducto biliar durante a preparação. Devido à sua preparação excepcionalmente próxima em comparação com a linhagem celular de colangiócitos e a colheita de todo o sistema de ducto biliar extra-hepático (EBDS), a abordagem descrita é extremamente útil na pesquisa de modelos animais de distúrbios do ducto biliar recém-nascido, como a atresia biliar. Após a eutanásia, a cavidade peritoneal foi acessada e o sistema de ductos biliares, duodeno e fígado foram extraídos com a única ressecção em bloco (EbR). A amostra extraída é colocada em um tapete de espuma, e a EBD é dissecada de células contaminantes atraumaticamente sem o toque necessário. A dissecação de toda a EBDS é uma vantagem significativa deste método. Deve-se ter cuidado devido ao pequeno tamanho e quantidade de tecido do ducto biliar. Usando a técnica descrita, não há danos aos colangiócitos. Além disso, a pureza da técnica é reprodutível (n = 10). Portanto, amostras comparáveis de forma ideal podem ser colhidas. Além disso, nenhum tecido do ducto biliar é prejudicado, porque qualquer contato com o sistema do ducto biliar pode ser evitado durante a preparação, deixando o fluido biliar dentro da vesícula biliar. Mais importante ainda, durante a realização da vesícula biliar final e da dissecção do ducto biliar, microinstrumentos atrauratos foram usados apenas ligeiramente laterais do ducto biliar sem apertá-lo. Esta é a chave para uma amostra limpa e intacta, e essencial para uma investigação histológica mais aprofundada ou o isolamento de colangiócitos. Para resumir, a técnica de dissecção inovadora descrita permite que operadores especialmente inexperientes com o equipamento necessário isolem a EBDS da forma mais limpa possível.

Introdução

A gênese e a progressão de colangiopatias como atresia biliar, colangite esclerosante primária (colangite esclerosante) e colangite biliar primária (CBP) são desconhecidas ou incompletas ^1,2. A compreensão limitada da origem e progressão dessas doenças leva a uma escassez de opções terapêuticas³. O obstáculo mais difícil no estudo dos distúrbios do ducto biliar neonatal é obter uma compreensão molecular da fisiopatologia. Uma das chaves essenciais para uma melhor compreensão da patologia molecular é a melhor observação possível do tecido afetado. Para evitar a redução da comparabilidade....

Protocolo

Após a aprovação ética (N045/2021), foram observados neonatos de camundongos C57BL/6 machos e fêmeas até os 9 dias de idade. Os animais nasceram e foram fornecidos para fins experimentais pela instalação animal do Centro Médico Universitário de Hamburgo-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha. Os neonatos foram alojados em uma gaiola junto com seus animais pais. As condições ambientais foram controladas em temperatura (20-24 °C), ciclo claro-escuro de 12:12 h e umidade relativa do ar de 40%-70%.

1. Preparação experimental

1. Prepare o equipamento necessário para a operação cirúrgica, incluindo tesoura, pinça, etc. (ver

Resultados

A Figura 1A mostra a EBDS de um neonato murino, que foi dissecado com a técnica descrita. Microscopicamente, nenhum outro tecido hepático é visível. O tecido hepático foi removido durante as etapas finais de isolamento do protocolo e pode ser facilmente distinguido do tecido do ducto biliar em relação à cor e consistência. A Figura 1B mostra a amostra isolada em comparação com uma escala milimétrica. O comprimento da EBD (medido da vesícula biliar à papila duode.......

Discussão

Este artigo relatou e discutiu a criação e validação de uma nova abordagem cirúrgica para a remoção da EBDS de camundongos neonatais eutanasiados. Os achados microscópicos e histológicos revelam que a abordagem detecta rapidamente as EBDs e as disseca perto das margens do ducto, mesmo em camundongos neonatais. Apenas instrumentos cirúrgicos e um microscópio com ampliação de 20x são necessários para o protocolo descrito. Além disso, a abordagem permite o isolamento de toda a EBDS. A técnica é altamente eficiente, direta e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	usado como agente desidratante
30 G cânula	B Braun/Sterican, Melsungen Alemanha	4656300	cânula para hidratação da amostra
Ventilação de ar	C + P Mö belsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Alemanha	Tec-Ononmic AZ 1200	o uso de uma saída de ar ajuda a evitar a inalação de fixadores contendo formalina
Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Alemanha	2351744	solução salina; Recipiente: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, estéril
Pinça microcirúrgica maior	DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland	FD253R	reta, 180 mm (7"), ponta de plataforma, cabo redondo, largura: 0,800 mm, revestida com pó de diamante, não estéril, ferramenta opcional reutilizável para observação e todas as etapas da preparação, exceto a preparação final; Dividindo a pele do peritônio
Câmera " SmartCAM 5"	Basler and Vision Engineering, Send, Reino Unido	EVC131A	módulo de câmera Lynx Exo opcional: tipo de sensor: CMOS, resolução 2560 x 1920 pixels, tamanho do sensor: 1/2"; Usado para produção de vídeo e avaliação técnica
Máquina de desidratação/Processador de Tecidos Citadel 2000	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Alemanha	12612613	usado para desidratação automática, programa curto (aprox. 4,8 h)
Esponja de desidratação	Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha	Esponja TT56.1	para a etapa final de dissecação, outras esponjas/almofadas de espuma com um tamanho mínimo de poros de 60 poros por polegada também são adequadas, o uso de  duas almofadas de espuma por de incorporação é recomendado para cobrir a amostra por baixo e por cima para evitar o deslizamento através da perfuração dos de incorporação
Dulbecco´ s Fosfatado Tamponado Salino (PBS)	Gibco	14190-144	Não é agudo; t contêm Calzium ou Magnésio, 500 mL
de incorporação	Engelbrecht GmbH, Edermü nde, Alemanha	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Alemanha	41-6660-00	solução de coloração, pronta para usar
Tesoura Fina CeramaCut	FST, Heidelberg Alemanha	14959-09	Pontas: Sharp-Sharp, Liga / Material: Aço Inoxidável Revestido de Cerâmica, Serrilhado:, Sim; Característica: CeramaCut, Forma da ponta: Reta, Borda de corte: 22 mm, Comprimento: 9 cm; Incisão na pele, incisão da janela peritoneal
Graefe Forceps	FST, Heidelberg Alemanha	11051-10	Comprimento: 10 cm, Forma da ponta: curva, serrilhada, Largura da ponta: 0,8 mm, Dimensões da ponta: 0,8 x 0,7 mm, Liga /Material: Aço inoxidável
Hematoxilina	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Alemanha	41-5130-00	solução de coloração, pronta para uso
Microscópio Highresolotion	Vision Engineering, Enviar Reino Unido	EVO503	Capaz de ampliação de até 60x, apenas 6x a 20x de ampliação foram usados
Microscópio	Olympus Optical CO, Ltd., Hamburgo, Alemanha	BX60F5
Capa para Microscópio Glases	Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Alemanha	101244	60 mm de largura, feitas de lâminas de microscópio de vidro SCHOTT D 263
	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Alemanha	03-0060
Micrótomo	Leica, Nuß loch, Alemanha	SM2010R	Ferramenta para seccionamento (2 µ m-slices)
Seringa Omnifix-F de 1 mL	B Braun, Melsungen, Alemanha	Seringa 9161406V	sem cânula
Parafina	Sakura Finetec, Torrance, EUA	4511	Cera de Parafina Tissue-Tek Tek III, sem
DMSO Máquina de Incorporação de Parafina	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Alemanha	TES 99	A máquina de incorporação usada neste estudo continha os seguintes três módulos individuais: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. A amostra deve ser incluída em parafina diretamente após a desidratação, nenhum armazenamento provisório em uma geladeira deve ser realizado devido ao possível encolhimento e umidade na geladeira
Paraformaldeído (PFA)	Morphisto	1176201000	Prepare alíquotas de 1 mL em tubos cônicos Eppendorf de 2 mL para amostras de fígado e alíquotas de 0,5 mL em tubos cônicos Eppendorf de 1 mL para amostras de ducto biliar extra-hepático, 4% em PBS ph 7,4
Pinça Microcirúrgica Pequena	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bü tthard, Bayern, Alemanha	(00)165	Cabo redondo, reto, ponta de 0,3 mm, ferramenta para observação e todas as etapas da preparação, especialmente útil na preparação final
Régua de aço inoxidável	Agntho's AB, Lidingö, Suécia	30085-15	150mm com Régua Métrica & Tesoura
em Polegadas - Sharp-blunt para decapitação	FST, Heidelberg Alemanha	14001-14	Dispositivo para decapitação
Gabinete de aquecimento	Haraeus, Hanau, Alemanha	T 6060	as amostras fatiadas devem ser mantidas no gabinete de aquecimento para garantir a fixação da amostra nas lâminas do microscópio

Cirúrgica de Graduação