Summary
Yakın kızılötesi femtosaniye lazer kullanılarak metafaz I sırasında fare oositlerinde sitoplazmik mikrotübül düzenleme merkezlerinin tükenmesini sağlayan optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Oosit mayozunun sadakati, gelişimsel olarak yetkin öploid yumurtaların üretilmesinde kritik öneme sahiptir. Memelilerde, oosit ilk mayotik bölünmenin faz I'inde uzun bir tutuklamaya maruz kalır. Ergenlikten sonra ve mayotik yeniden başladıktan sonra, nükleer membran sökülür (nükleer zarf parçalanması) ve iş mili esas olarak oosit merkezinde monte edilir. İlk merkezi iş mili konumlandırması, anormal kinetochore-mikrotübül (MT) ataşmanlarına ve anöploidiye karşı korunmak için gereklidir. Merkezi olarak konumlandırılmış iğ, kortekse doğru zamana duyarlı bir şekilde göç eder ve bu, küçük bir kutup gövdesini ekstrüzyon yapmak için gerekli bir işlemdir. Mitotik hücrelerde, iğ konumlandırması, sentrozom aracılı astral MTs ve hücre korteksi arasındaki etkileşime dayanır. Aksine, fare oositleri klasik sentrozomlardan yoksundur ve bunun yerine çok sayıda acentriolar MT organizasyon merkezi (MTOC) içerir. Metafaz I aşamasında, fare oositleri iki farklı MTOC setine sahiptir: (1) iğ kutuplarını (polar MTOC'ler) birleştirmek için kümelenmiş ve sıralanmış MTOC'ler ve (2) sitoplazmada kalan ve doğrudan iğ oluşumuna katkıda bulunmayan, ancak iğ konumlandırmasını ve zamanında iğ göçünü düzenlemede çok önemli bir rol oynayan metafaz sitoplazmik MTOC'ler (mcMTOC'ler). Burada, Cep192-eGfp muhabir farelerinden toplanan oositlerde endojen olarak etiketlenmiş mcMTOC'leri seçici olarak tüketmek için çoklu fotonlu bir lazer ablasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, memeli oositlerinde iğ pozisyonu ve migrasyonunun altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunur.
Introduction
Haploid gametler (sperm ve oosit) mayoz yoluyla üretilir, bu da bir tur DNA replikasyonunu ve ardından döllenmeden önce kromozom sayısının azaltılması için gerekli olan iki ardışık bölünmeyi gerektirir. Memelilerde, erken fetal yaşam boyunca, yumurta, germinal vezikül (GV) aşaması olarak adlandırılan bir aşama olan ilk mayotik bölünmenin faz I'inin diploten aşamasında (ergenliğe kadar) uzun bir tutuklamaya maruz kalır. Mayotik yeniden başlatmayı takiben, GV oosit nükleer zarf parçalanmasına (NEBD) maruz kalır ve iş mili esas olarak oosit merkezi 1,2,3'te monte edilir. Daha sonra, F-aktin tarafından tahrik edilen iğ, yüksek asimetrik bölünmeyi sağlamak için oosit merkezinden kortekse zamanında göç eder ve küçük bir polar gövdeye (PB) sahip bir yumurta ile sonuçlanır4,5,6.
Mitotik hücrelerde, sentrozomlar, perisentrin, γ-tübülin, Cep152 ve Cep1927 gibi peri-sentriyolar malzeme bileşenleri (PMC) ile çevrili bir çift sentriyollerden oluşur. Bu sentriol içeren sentrozomlar, bipolar iğ oluşumunun doğruluğuna katkıda bulunur8. Bununla birlikte, sentriyoller kemirgenler9 dahil olmak üzere çeşitli türlerde erken oogenez sırasında kaybolur. Bu nedenle, fare oositleri çok sayıda acentriolar mikrotübül (MT) düzenleme merkezi (MTOC) kullanarak sentriyol-bağımsız bir iğ montaj yolunu benimser9,10. Mayotik yeniden başlatma üzerine, perinükleer MTOC'ler üç ayrı yeniden yoğunlaşma, gerilme ve parçalanma adımından çok sayıda daha küçük MTOC'ye11,12 girer. Parçalanmış MTOC'ler daha sonra kümelenir ve bipolar bir iş mili 10,13,14 düzenlemek için sıralanır. Başka bir MTOC havuzu, NEBD sırasında sitoplazmada bulunur. Bu sitoplazmik MTOC'lerin bazıları göç eder ve iğ kutupları oluşturur (polar MTOC'ler, pMTOC'ler)10,11. Son zamanlarda, sitoplazmik MTOC'lerin metafaz sitoplazmik MTOC'ler (mcMTOC'ler) olarak adlandırılan, iğ kutbu oluşumuna katkıda bulunmayan, ancak metafaz I (Met I) sırasında yumurta sitoplazmasında kalan başka bir alt kümesi keşfedilmiştir. Çoklu foton lazer ablasyonu ile mcMTOC'lerin tükenmesi veya otofaji inhibisyonu ile sayılarının anormal şekilde arttırılması, iğ pozisyonunu ve migrasyonunu bozar ve metafaz II oositlerinde anöploidi insidansını arttırır15.
İlginç bir şekilde, mcMTOC'ler pMTOC'lerden birçok açıdan farklıdır15. Örneğin, esas olarak perinükleer MTOC'lerden kaynaklanan pMTOC'lerin aksine, mcMTOC'ler oosit korteksinden kaynaklanır. İş mili hala oosit merkezindeyken, mcMTOC'ler PB ekstrüzyon15 için iğin göç ettiği tarafa asimetrik olarak zıt olarak lokalize edilir. Astral benzeri MTs, nispeten büyük oosit hücresindeki kortekse ulaşamaz. Bu nedenle, bu mcMTOC'ler iş milini (astral benzeri MTOC'ler aracılığıyla ) kortekse sabitlemek için MT'leri çekirdeklendirir. Bu bulgular, mcMTOC çekirdekli MT kuvvetinin, kortekse doğru mil göçünü yönlendiren F-aktin aracılı kuvvete karşı koyduğu bir model önermektedir. Bu iki karşıt kuvvet arasındaki denge, merkezi iş mili konumlandırmasını ve zamanında iş mili göçünü düzenlemek için gereklidir15.
Bugüne kadar, incelenen tüm PMC proteinleri (perisentrin, g-tübülin, Cep192 ve Aurora kinaz A) her iki MTOC havuzuna lokalize olur: mcMTOC'ler ve pMTOC'ler15. Bu nedenle, pMTOC'leri rahatsız etmeden mcMTOC'leri seçici olarak rahatsız etmek için kimyasal veya genetik bir yaklaşım yoktur. Bu sınırlamalar, lazer ablasyon ile mcMTOC'leri seçici olarak hedefleyerek aşılabilir. Mikroablasyon için geliştirilen lazer tabanlı teknolojiler arasında, darbeli çok fotonlu femtosaniye lazerler, odak düzlemi ile sınırlı hassas etkileri, yakın kızılötesi ışığın yüksek penetrasyon derinliği ve hücreye karşı azaltılmış fototoksisite ve termal hasar nedeniyle büyük potansiyel göstermektedir16,17,18. Bu çalışma, ters çevrilmiş bir mikroskopla birleştirilmiş çoklu foton lazer kullanarak fare oositlerindeki mcMTOC'leri ablate etmek için seçici bir yaklaşımı açıklamaktadır.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Missouri Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (Hayvan Bakımı Kalite Güvencesi Referans Numarası 9695). Bu çalışmada 6-8 haftalık Cep192-eGFP muhabiri dişi fareler kullanılmıştır. Cep192-eGFP muhabir fareleri üretmek için, EGFP muhabir genini CF-1 fare genomuna entegre etmek için CRISPR / Cas9 aracılı homoloji yönelimli onarım kullanıldı. EGFP muhabiri, Cep192'nin (MTOC'lerin ayrılmaz bir bileşeni) C-ucunda kaynaştırıldı15. Fare kolonisini korumak için, homozigot Cep192-eGfp muhabir fareleri kullanıldı. Tüm hayvanlar, 21 ° C ve% 55 nemde, 12 saatlik açık / karanlık döngü ve yiyecek ve suya ad libitum erişimi ile kafeslerde (dört hayvana / kafese kadar) tutuldu.
1. Fare oosit koleksiyonu
- Kültür ortamını hazırlayın (Chatot, Ziomek ve Bavister, CZB19, Malzeme Tablosuna bakın) ve gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
NOT: CZB ortamı 1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir (ortam kompozisyonu için Ek Dosya 1'e bakınız). - CZB ortamını glutamin (1 mM) ve milrinon (2,5 mM) (CZB + M) ile destekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve inkübatöre yerleştirin.
NOT: Milrinon, faz I'de tutuklanan oositleri koruyan ve mayotik yeniden başlama20'yi önleyen bir fosfodiesteraz inhibitörüdür. - 3 mg/mL polivinilpirolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7.3) (Ek Dosya 1) ve milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M) içeren toplama ortamını (bikarbonatsız minimal esansiyel ortam, MEM) hazırlayın.
- Toplama ve kültür yemeklerini hazırlayın, sırasıyla 60 mm ve 35 mm Petri kaplarında dört mikrodamla (100 μL) toplama ortamı (MEM / PVP + M) ve iki mikrodamla (100 μL) kültür (CZB + M) ortamı yapın ve bunları mineral yağ ile örtün (bkz. Toplama kabını kaydırakta daha sıcak tutun ve kültür kabını inkübatöre 37 ° C ve% 5 CO2'de koyun.
- İntraperitoneal olarak 5 IU hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG, Materyaller Tablosuna bakınız) cinsel olarak olgun (6-8 haftalık) Cep192-eGFP muhabiri dişi farelere oosit toplanmasından 44-48 saat önce enjekte edin.
- Fareleri servikal çıkık ile kurban edin, yumurtalıkları tanımlayın ve çıkarın21 ve bunları 37 ° C'de önceden ısıtılmış toplama ortamı (MEM / PVP + M) içeren bir saat camına aktarın.
- Saat camının dibine 1 mL'lik bir şırıngaya dokunarak ve yumurtaları ortama bırakmak için bir araya getirilmiş dikiş iğnelerini kullanarak birkaç kez (yumurtalık başına ~ 40 kez) delerek yumurtalığı sabitleyin.
- Plastik bir transfer pipeti kullanarak, kümülüs-oosit komplekslerini (COC'ler) içeren tüm ortamları adım 1.7'den boş bir 100 mm plastik Petri kabına aktarın.
- Bir stereomikroskop altında, COC'leri bir Pasteur cam pipet kullanarak toplayın ve bunları MEM / PVP + M içeren toplama kabına aktarın.
- Dar bir Pasteur cam pipet (yaklaşık 100 μm çapında) kullanarak, oositleri nazik tekrarlayan pipetleme ile mekanik olarak denüde edin, ardından CZB + M kültür kabına aktarılmadan önce dört mikrodamla (100 μL) MEM / PVP + M (toplama kabı) içinde aktarın ve yıkayın.
- İnkar edilen oositleri 37 ° C'de 1 saat boyunca havada CO2'nin % 5'i ile inkübe edin.
2. Yumurta mikroenjeksiyonu
- 100 mm'lik plastik Petri kabı kapağına 250 μL'lik bir MEM/PVP + M damlası yerleştirin ve mineral yağ ile örtün.
NOT: Petri çanak kapağı, mikromanipülatörün ayarlanması için daha fazla alan sağlayan daha düşük bir kenara sahiptir. - Mikroenjeksiyon sistemini açın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Mikroenjeksiyon kabını mikroskobun ısınma aşamasına (37 °C) yerleştirin.
- Enjeksiyon iğnesini mikroyükleyici pipet uçlarını kullanarak 0,5 μL mCh-Cep192cRNA ile yükleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve enjeksiyon iğnesini mikromanipülatöre sabitleyin.
- Reddedilen oositleri (adım 1.11) 250 μL mikrodamlaya (adım 2.1) aktarın.
- 20x veya 40x objektif lens altında, enjeksiyon ve tutma iğnelerinin konumunu ve odağını oosit pozisyonuna göre ayarlayın (Şekil 1).
- Mikroenjeksiyon ünitesini kurun ve 5-10 pl mCh-Cep192 cRNA enjekte edebilmek için enjeksiyon basıncını (pi), kompanzasyon basıncını (p c) ve enjeksiyon süresini (ti) ayarlayın (MTOC'leri eksojen olarak etiketlemek için).
- Çekirdeğe dokunmadan yumurtaları dikkatlice enjekte edin.
- Tüm yumurtalar enjekte edildikten sonra, üç mikrodamla CZB + M içinde yıkayın, kültür kabına (CZB + M) aktarın ve mCh-Cep192 ekspresyonuna izin vermek için 37 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin.
3. Yumurta olgunlaşması
- Olgunlaşma ortamını, en az 3 saat boyunca 37 ° C'de havada% 5 CO2 bulunan bir inkübatörde önceden dengelenmiş CZB ortamına glutamin (1 mM) ekleyerek hazırlayın.
- 35 mm'lik bir Petri kabında olgunlaşma ortamının iki mikrodamlasını (100 μL) yapın ve bunları mineral yağ (olgunlaşma kabı) ile örtün.
- Milrinonu tamamen çıkarmak ve mayotik yeniden başlamaya izin vermek için faz I ile tutuklanmış oositleri 100 μL milrinon içermeyen CZB mikrodamlalarında en az üç kez yıkayın.
- Yumurtaları olgunlaşma kabına aktarın ve 37 ° C'de havada% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 5 saat (prometafaz I aşaması) inkübe edin.
4. Ablasyon ve görüntüleme için oosit hazırlığı
- Prometafaz I oositlerini (adım 3.4), mineral yağ ile kaplı 100 μL olgunlaşma ortamı (adım 3.1) içeren cam tabanlı bir kültür kabına aktarın.
5. Ablasyon için mikroskop hazırlığı
- Ablasyondan en az 30 dakika önce, sahne inkübatörü için sıcaklık kontrol cihazını açın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'ye ayarlayın.
- CO2 kontrol cihazını açın ve %5 CO2 olarak ayarlayın.
- 40x yağ daldırma apokromatik hedefi seçin ve daldırma yağından küçük bir damla uygulayın.
- Cam tabanlı kültür kabını oositlerle birlikte bir sahne üstü inkübatöre monte edin ve inkübatörü bir gaz kapağıyla örtün.
- Görüntü alma yazılımında ( bkz. Malzeme Tablosu), birden fazla aşama konumunun kaydedilmesini sağlayan bir seçenek belirleyin (örneğin; "İşareti tanımla ve deneyi bul"). İletilen ışık parlak alan aydınlatmasını kullanarak, bireysel oositleri ortalayın ve konumlarını kaydedin.
- Görüntü alma yazılımında, XYZ tarama modunu seçin, görüntü formatını 256 x 256 piksel olarak ayarlayın, yakınlaştırma faktörünü 2,5x - 3,0x olarak ayarlayın ve 600 Hz'lik bir tarama frekansı seçin. Bu, yaklaşık 1,6 μs'lik bir piksel bekleme süresine karşılık gelir.
- Lazer gücünün yaklaşık% 10'unda (örnek düzeyde 4.0 μW'a karşılık gelir) 488 nm uyarma lazer çizgisi ayarlayın ( bkz. Malzeme Tablosu) ve MTOC'lerden GFP sinyalini gözlemlemek için 500-550 nm'lik bir spektral bant genişliği kullanın. mCherry etiketli Cep192'den floresanın eşzamanlı gözlemi için, lazer gücünün yaklaşık% 8'inde (örnek seviyesinde 10.7 μW'ye karşılık gelir) 585 nm'lik bir uyarma lazer çizgisi ayarlayın ve 595-645 nm'lik spektral bant genişliğine ayarlanmış başka bir dedektör kullanın.
NOT: Oosit sınırlarını eşzamanlı olarak tespit etmek için konfokal mikroskobun iletilen ışık dedektörünü (TLD) kullanmak yararlıdır. - Canlı tarama modunu ve z-drive'ın manuel kontrolünü kullanarak, oositi MTOC'ler için tarayın.
- Bir mcMTOC algılandıktan sonra, etrafına kare bir ilgi alanı (ROI) çizin.
6. mcMTOC'lerin ablasyonu
- Bir femtosaniye lazeri 740 nm dalga boyuna ayarlayın.
NOT: Lazer dalga boyu mikroskop ve lazer koşullarına göre değiştirilebilir. - Lazer gücünü, numune düzleminde 60-70 mW güce karşılık gelen% 70-80'e ayarlamak için çoklu foton mikroskobunun elektro-optik modülatörünü kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Lazer bir femtosaniye darbe kompansatörü ile donatılmışsa, grup gecikme dağılımını (GDD) düzeltmek için kullanın. GDD düzeltmesi, verimli mcMTOC ablasyonu için gereken lazer gücü miktarını azaltır ve oositte fotohasarı en aza indirir. GDD kontrolü genellikle ticari çoklu foton mikroskoplarının görüntü yakalama yazılımı ile entegre edilir. - Adım 5.6'dakiyle aynı görüntü formatını, yakınlaştırma faktörünü ve tarama sıklığını kullanın. Çizgi ve kare ortalaması parametrelerini 1 olarak ayarlayın.
- Seçilen ROI'nin tek bir lazer taramasını yaparak mcMTOC'nin ablasyonunu gerçekleştirmek için yazılımdaki Tara düğmesine tıklayın.
- Çoklu foton lazer pozlamasından önce ve sonra çekilen GFP etiketli yapıların görüntülerini karşılaştırarak ablasyonun sonuçlarını gözden geçirmek için adım 5.7'deki kanal ayarlarını kullanın. Ablasyon başarılı olursa, hedeflenen mcMTOC'deki GFP floresansının yoğunluğu arka planda gözlenen seviyelere düşer.
- GFP etiketleme yapısının bazı parçaları kalırsa, mcMTOC'nin çeşitli z düzlemlerine odaklanarak adım 6.4'ü bir veya daha fazla kez tekrarlayın.
- Ablasyon verimliliğini mcMTOC ile ilişkili mCherry sinyallerinin (mCh-Cep192) tamamen kaybolmasıyla doğrulamak için adım 5.7'deki kanal ayarlarını kullanın.
- Bir yumurtanın tüm MTOC'leri (çeşitli odak düzlemlerinde) ablatlanana kadar adım 5.8 ila adım 6.7'yi tekrarlayın.
NOT: Bu protokol, çoklu foton lazer maruziyetini takiben mcMTOC tükenmesini doğrulamak ve GFP floresan kaybının GFP fotobeyazlatmadan kaynaklanma olasılığını dışlamak için bir strateji olarak mCh-Cep192 mikroenjeksiyonunu kullanır. Bununla birlikte, bu probun mikroenjeksiyonu isteğe bağlıdır ve ablasyon prosedürü için gerekli değildir.
Representative Results
Çoklu foton lazer ablasyonu, hücre içi yapıları seçici olarak ablate etmek için etkili bir yöntem sağlar. Bu çalışmada, fare oositlerindeki mcMTOC'leri seçici olarak tüketmek için çoklu foton lazer ablasyonu kullanılmıştır. Lazer ablasyon, hedeflenen mcMTOC'lerdeki endojen GFP floresansının arka planla karşılaştırılabilir bir seviyeye indirgenmesiyle gösterildiği gibi, mcMTOC'leri verimli bir şekilde tüketmiştir. Hedeflenen mcMTOC'lerdeki ekzojen mCh-Cep192 de lazer ablasyonunu takiben kaldırıldı. Oosit içindeki tüm mcMTOC'lerin tükenmesini sağlamak için mcMTOC'lerin lazer ablasyonu oosit içindeki farklı odak düzlemlerinde (mcMTOC'lerin bulunduğu yerde, Şekil 2) yapılmalıdır (Şekil 3).
Resim 1: Yumurta mikroenjeksiyonu. Bir faz I-arrested fare oositinin mCh-Cep192 cRNA ile mikroenjeksiyonu. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fare oositlerinde mcMTOC'lerin tükenmesi. Tek odak düzlemlerinin temsili görüntüleri. Beyaz kareler, çoklu foton lazer ablasyonundan önce ve sonra bir mcMTOC'yi gösterir. Ölçek çubuğu: 40 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bir fare oositinde mcMTOC'lerin farklı odak düzlemlerinde tükenmesi. Bir mcMTOC-ablated fare oositinin temsili maksimum projeksiyon görüntüleri. Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Chatot, Ziomek ve Bavister (CZB) ve bikarbonatsız minimal esansiyel ortam (MEM/PVP) bileşimleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
22,23,24,25 hücrelerindeki hücre iskeleti ile ilişkili yapıları bozmak için farklı yöntemler mevcuttur. Bununla birlikte, hücre canlılığından ödün vermeden hedeflenen yapıyı seçici olarak bozmak için etkili teknikler bulmak zordur. Burada sunulan çoklu fotonlu lazer ablasyon yöntemi, oosit canlılığını değiştirmeden oosit içindeki mcMTOC'lere seçici bir mekanik pertürbasyon indüklemek için etkili bir stratejidir.
Lazer ablasyon, mitoz ve mayoz22,23,26,27 sırasında kromozom ayrışmasını kontrol eden moleküler mekanizmaları anlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Somatikhücrelere kıyasla memeli oositlerinin nispeten büyük boyutu (>80 mm çapında) nedeniyle, hücre içi yapılarının ablasyonu bir meydan okumayı temsil eder. Ayrıca, metafaz I oositlerindeki ortalama mcMTOC hacmi ~ 20 μm15'tir ve bu da ek bir zorluğu temsil eder. Bu zorlukların üstesinden gelmek için daha derin doku penetrasyonu sağlayan etkili bir yöntem benimsenmelidir. Ablasyon için çoklu foton lazeri kullanmanın temel avantajı, hedef dışı etkileri en aza indirirken hücrenin derinliklerine ulaşma yeteneğidir29.
Lazer ablasyon yönteminin hedeflenen yapıyı tüketmek için etkinliğini ve verimliliğini doğrulamak için, hedeflenen yapıyı zaman içinde (ablasyondan önce ve sonra) tanımlamak için floresan etiketli bir protein kullanılması önerilir23. Lazer ablasyonunun tüm mcMTOC'yi bir yapı olarak tükettiğini fark etmek önemlidir ve daha küçük mcMTOC'lerin tükenmesi için yalnızca tek bir lazer maruziyeti gerektirmesine rağmen, daha büyük mcMTOC'ler farklı odak düzlemlerinde birden fazla lazer pozlaması gerektirebilir. Ayrıca, mcMTOC ablasyonunun etkinliğini daha da doğrulamak için bir kontrol ve mcMTOC-ablatlı oositlerin bir MTOC belirteci (γ-tübülin, perisentrin veya Cep192 gibi) ile sabitlenmesi ve immüno-etiketlenmesi önerilir. Kontrol oositlerinde, sitoplazmanın mcMTOC'lere bitişik ancak onlarla örtüşmeyen alanları lazere maruz kalacaktır.
Bu deney, oositler içindeki farklı odak düzlemleri arasında hareket ederken birkaç mcMTOC ablasyonu gerektirir. Bu nedenle, deney süresini en aza indirmek ve böylece yumurta canlılığını artırmak için deneyi gerçekleştirmeden önce bu tekniğin birkaç kez uygulanması şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca, oosit canlılığını etkilemeden mcMTOC'leri tüketmek için yeterli olan minimum lazer gücünü kullanmak önemlidir.
Bu tekniğin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, çoklu foton konfokal mikroskoplar normal konfokal mikroskoplardan nispeten daha pahalıdır. İkincisi, tüm mcMTOC'leri farklı odak düzlemlerinde rahatsız etmek, kimyasal veya genetik karışıklıklardan daha fazla zaman alıcıdır. Üçüncüsü, bu protokol tüm mcMTOC'leri mümkün olan en kısa sürede ortadan kaldırmak için teknik beceriler gerektirir. Bununla birlikte, bir kez ustalaşıldığında, çoklu foton lazerin kullanımı, mcMTOC'ler de dahil olmak üzere fare oositlerindeki çeşitli hücre içi yapıları bozmak için mükemmel bir strateji sağlar ve iğ konumlandırmasını düzenleyen moleküler mekanizmaların anlaşılmasına ve memeli oositlerinde zamanında göçüne katkıda bulunur.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, Balboula laboratuvarının tüm üyelerine değerli yardımları ve tartışmaları için teşekkür eder. Yazarlar, Melina Schuh'a mCherry-Cep192 yapısını nazikçe paylaştığı için teşekkür ediyor. Bu çalışma AZB'ye R35GM142537 (NIGMS, NIH) ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID | World precision instrument | TW100F-4 | Injection needles |
| Borosilicate glass | Fisherbrand | Cat# 13-678-20D | |
| Borosilicate glass capillarities | World Precision Instrument | Cat# TW100-6 | Holding needles |
| Bovine serum albumine | MilliporeSigma | Cat# A4503 | |
| Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope | Life Imaging Services GmbH | ||
| Calcium chlrode dihydrate | MilliporeSigma | Cat# C7902 | |
| CO2 controller | Pecon | # 0506.000 | |
| CO2 Cover HP | Pecon | # 0506.020 | |
| DL-Lactic acid | MilliporeSigma | Cat# L7900 | |
| DMi8 | Leica | N/A | Microscope |
| EDTA | MilliporeSigma | Cat# E5134 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | N/A | Microinjector |
| Femtotips Microloader | Fisher scientific | E5242956003 | |
| Gentamicin | MilliporeSigma | Cat# G1272 | |
| Gentamycin | MilliporeSigma | Cat# 1272 | |
| Glass bottom dish | Mat Tek Corporation | Cat# P35G-1.0-20-C | |
| Hepes | MilliporeSigma | Cat# H3784 | |
| Hepes Sodium Salt | MilliporeSigma | Cat # H3784 | |
| Hera Cell vios 160i | Thermo | N/A | CO2 incubator |
| Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B | Leica Microsystems, Inc | N/A | |
| L-Glutamine | MilliporeSigma | Cat#G8540 | |
| Magnesium sulfate dihydrate | MilliporeSigma | Cat# M7774 | |
| MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser | Spectra-Physics | N/A | |
| mCH-Cep192 cRNA | N/A | ||
| Medium Essential Medium Eagle - MEM | MilliporeSigma | Cat #M0258 | |
| Milrinone | MilliporeSigma | Cat# M4659 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | Cat# M5310 | |
| Minimum essential medium eagle (MEM) | MilliporeSigma | Cat# M0268 - 1L | |
| Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 | N/A | ||
| Petri dish (100 mm) | Fisherbrand | Cat# FB0875712 | |
| Petri dish (35 mm) | Corning | Cat# 430165 | |
| Petri dish (60 mm) | Falcon | Cat# 351007 | |
| Phenol Red | MilliporeSigma | Cat# P5530 | |
| Polyvinylpyrolidone | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Polyvinylpyrolidone (PVP) | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Potassium chloride | MilliporeSigma | Cat# P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | MilliporeSigma | Cat# P5655 | |
| Pregnant mare´s serum gonadotropin | Lee BioSolutions | Cat# 493-10-10 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Sewing needles | D.M.C | N/A | N° 5 * 16 Needles |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | Cat# S5761 | |
| Sodium chloride | MilliporeSigma | Cat# S5886 | |
| Stage-top heating insert P | Pecon | # 0426.300 | |
| Sterezoom S9i | Leica | N/A | Stereomicroscope |
| Syringe 1 mL | BD company | Cat# 309597 | |
| Taurine | MilliporeSigma | Cat# T0625 | |
| Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital | Pecon | # 0503.000 | |
| The Cube temperature controller for the cage incubator | Life Imaging Services GmbH |
References
- Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes. Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).
- Hashimoto, N., Kishimoto, T. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation. Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes. Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).
- Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes. Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).
- Schuh, M., Ellenberg, J. A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes. Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).
- Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. Pericentriolar material. Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).
- Hinchcliffe, E. H. The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other. Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes. Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).
- Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
- Clift, D., Schuh, M. A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes. Nature Communications. 6, 7217 (2015).
- Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis. Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Breuer, M., et al. HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells. Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).
- Londoño-Vásquez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes. Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).
- Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses. Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio Protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).
- Pavin, N., Tolic, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).
- Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study. Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).
- Bennabi, I., Manil-Segalen, M. Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).
- Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells. Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).
- Warzych, E., Lipinska, P. Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation. Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
