Summary
本协议描述了小鼠主动脉束带诱导压力超负荷心脏肥大的新技术。对于捆扎，使用具有固定内径的橡胶圈。这项新技术有望为未来的实验提供更少的方差和更可重复的数据。
Abstract
小鼠主动脉束带是心脏压力超负荷诱导的心脏肥大和诱导心力衰竭最常用的实验模型之一。以前使用的技术是基于围绕主动脉弓的螺纹缝合线，绑在钝的 27 G 针上以产生狭窄。这种方法取决于外科医生手动拧紧螺纹，因此会导致直径尺寸的巨大差异。Melleby等人描述的一种新改进的方法承诺手术后差异更小，可重复性更高。新技术O形环主动脉束带（ORAB）使用防滑橡胶环代替带线的缝合线，从而减少了压力过载的变化和心脏肥大的可重复表型。在手术过程中，O形圈放置在头臂动脉和左颈动脉之间。超声心动图可确认成功收缩。1 天后，正确放置环会导致横主动脉在 O 形环诱导的狭窄上的流速增加。2 周后，通过射血分数降低和壁厚增加来证明心脏功能受损。重要的是，除了直径大小的差异较小外，与横主动脉收缩 （TAC） 相比，ORAB 与较低的术中和术后死亡率相关。因此，ORAB代表了一种优于常用TAC手术的方法，导致更可重复的结果，并可能减少所需的动物数量。
Introduction
虽然在发育、运动和怀孕期间可以观察到生理性心脏肥大，但病理性心脏肥大对动脉高血压、瓣膜性心脏病或基因突变等血流动力学应激状况有反应。最初，心脏经历重塑，其特征是心肌细胞大小增加和心室壁增厚以维持心脏功能1，2。另一方面，病理性心脏重塑与心律失常、猝死和高死亡率的风险增加有关。最后，随着时间的推移，它会导致心室扩张，收缩功能严重下降，并最终进展为心力衰竭（HF），这与高发病率，死亡率和社会成本有关3。因此，迫切需要了解分子背景，以便制定新的治疗策略4。
主动脉束带是一种模拟压力超负荷诱导的小鼠左心室 （LV） 肥大和心力衰竭的模型5。使用这种方法，可以检查 体内压力超负荷诱导的心脏重塑的病理机制。Rockman等人报告了小鼠的第一次主动脉束带手术6。压力超负荷是由主动脉（头臂动脉和左颈总动脉之间）周围基于线缝的结扎引起的。为了形成直径为 0.4 mm 的狭窄，在 27 G 针和主动脉周围放置一条缝合线。结扎后，取下针头6，7。
即使针头直径是固定的，线的松紧度也高度依赖于外科医生，因此会影响心脏肥大的诱导表型。此外，在基于线/缝合的方法中，手术后狭窄直径的程度不同，与死亡率的高差异相关8，9。此外，训练这种方法具有挑战性，特别是在找到拧紧螺纹的正确水平和一致性方面。最后，在训练开始时，由于主动脉或其他组织损伤的破坏，以及幸存动物狭窄程度的高度变化，会发生高术中和术后死亡率。
最近，Melleby等人描述了主动脉束带的优化程序10。他们提出了ORAB（O形环主动脉束带）方法，该方法通过使用固定内径为0.71 mm，0.66 mm和0.61 mm的防滑橡胶O形圈，在狭窄方面差异较小，压力过载水平高度可重复。简而言之，O形圈被切开，放置在上升拱形周围，然后用螺纹再次关闭。使用这些O形圈的其他科学家报告了诱导的心脏肥大9的变异性较小。他们还观察到术中和术后死亡率，以及诱导的肥厚表型9，11的更好的可重复性和更少的方差。本文以分步协议描述了这种独特策略的过程。本报告中分享的专业知识将帮助其他科学家改进他们在这一领域的技术。
为了在6周后诱导心脏肥大导致心力衰竭，建议将12周龄的C57BL / 6N雄性小鼠进行手术。小鼠亚系C57BL / 6N和C57BL / 6J之间的主动脉束带后2周的比较显示C57BL / 6N小鼠的严重心功能障碍和相关死亡率增加。因此，这些更适合心力衰竭模型12。十二周龄的雄性和雌性小鼠具有暴露主动脉和用特殊仪器放置O形圈的最佳尺寸。
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Protocol
动物实验是在地区委员会的原则下进行的（石勒苏益格-荷尔斯泰因州能源部，国家能源协会，世界，自然和数字化，许可号：V242-21249/2020 [38-4/20]）。用于本研究的小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。将动物保持在标准条件下，光照12小时，夜间周期12小时;随意 提供水和食物。
1. 动物护理
- 将老鼠关在专门的笼子里，里面有床上用品、筑巢材料、藏身之处，并适当获得饮用水和食物。
- 对动物进行持续的专门兽医控制和治疗。
注意：对于外部供应商订购的小鼠，请在开始程序之前确保 7 天的适应。
2. O形圈的准备
注意：建议使用固定直径为 0.4 mm 的 O 形圈，以便在 2 周后诱发心脏肥大。诱导的心脏表型的范围和严重程度取决于O形圈直径的大小。
- 首先，使用剪刀或手术刀在显微镜下对O形圈进行一次切割（见 材料表），以便在主动脉周围放置（图1A，B）。
- 用与 8-0 连接的针刺穿靠近切口的每个环面不可吸收缝合并拉线。切开并在一侧留出2-3厘米，在另一侧留出2厘米，以在最后一步中将O形圈固定在主动脉周围（图1C，D）。
- 手术前，取结扎辅助工具（物种仪器，见 材料表）并将一个环侧的螺纹末端（保持更长时间）拉过收缩孔（图1E，F）。将带有附加O形圈的连接助剂放在一边，以便在下一步（步骤6）中放置。
- 为了用螺纹对环进行消毒，请将环放入酒精溶液中半小时。之后，将其放在纤维素上晾干。将干燥的戒指保存在封闭的浴缸或盒子中，直到使用。在手术过程中，将线拉过结扎辅助装置后，将环放在干净的表面上直至使用。
图 1：进行结扎 的 O 形圈准备。 （A）固定直径的O形圈用剪刀或手术刀在一侧剪开。（B） O形圈的图像。（C）每个O形圈侧面都用8-0刺穿茴萌线。（D）O形圈用两根螺纹刺穿。（E）将O形圈一侧的螺纹拉过连接助剂的孔。（F）放置前的最终位置：一侧的线通过结扎助剂的孔放置，而另一侧的线保持松动。 请点击此处查看此图的大图。
3.小鼠的用药前和手术场的准备
- 为了在手术期间接受足够的镇痛，在进行手术前20分钟腹膜内注射镇痛药丁丙诺啡（0.1mg / kg，见 材料表）。
注意：对于本研究，止痛药的使用遵循实验动物科学学会（GV-SOLAS）的建议。 - 术前后，在诱导室中麻醉小鼠，用2%-4%异氟醚与0.5-1.0L / min的100%O2混合。
- 剃掉镇静小鼠左侧胸部的皮毛。剃须后，将小鼠放回充满异氟醚的腔室中，等待足够的镇静剂，然后再对动物进行插管。
注意：镇静的正确时间点显示呼吸缓慢，但避免快速呼吸。根据异氟醚气体设置，需要2-3分钟才能达到正确的镇静水平。 - 手术前打开加热垫以保持动物的体温（37°C）。将加热垫连接到直肠探头（见 材料表）以自动保持小鼠的体温。
4.小鼠插管
- 准备所需的仪器（图2A）。手术前对喉镜进行消毒，将其放入酒精中约1-3分钟，然后将其干燥过夜。
- 在加热垫周围拉伸橡皮筋，将鼠标与门齿固定在板上。将镇静的鼠标仰卧放在加热垫上。
- 将橡皮筋放在动物的门牙上，以将颈部伸展到盘子上。
- 将光源聚焦在喉咙上，以便气管插管的气管开口有良好的可视性（图2B）。
- 用一只手轻轻打开嘴，放置插管辅助装置（手工喉镜，见 材料表）（图2A[3]）。
- 用另一只手和小镊子轻轻移动舌头以清除气管开口。
- 也用这只手将气管插管引入气管。另一方面，仍然握住插管辅助装置。对于插管，使用22 G插管（见 材料表）（图2A[1]）。
- 通过三通旋塞阀 将 气管插管位置连接到呼吸机（见 材料表），以便小鼠确认正确的气管插管位置（气管内）。
- 根据制造商的说明监测正确的通气（潮气量为200μL，呼吸频率在100-150次呼吸/分钟之间）（图2C）。
- 通过脚趾捏反射检查确认足够的麻醉深度（无反射反应）。
- 将麻醉设置转至2%异氟醚与0.5-1.0 L / min 100%O2混合。
- 在眼睛上涂抹眼药膏，以避免手术过程中干燥。
- 使用棉签，用市售的消毒剂溶液对手术区域进行3次消毒（见 材料表）。
图2：小鼠插管。 （A） 插管器械： （1）使用22 G静脉注射插管作为气管插管（无普通话）;（2）镊子;（3）手工喉镜（用木棍和胶带粘合的变形/扁平的套管）。（B）在定位的加热垫上进行插管。（C）连接到呼吸机的插管小鼠。 请点击此处查看此图的大图。
5. 环定位的手术和准备
注意：使用无菌材料和器械以避免感染。
- 用剪刀在木突和左腋窝之间的一条线中间做一个0.5-1厘米长的皮肤切口。使用镊子将肌肉层与下面的肋骨分开，并将两个牵开器（5毫米长，见 材料表）放入切口以暴露肋骨。
- 要开始左开胸术，请使用微型弹簧剪刀在第二和第三肋骨之间的肋间肌肉上进行一个小切口（~1-2毫米）。打开胸腔，用45°角镊子展开切口。
- 将三个胸部牵开器（1.0-2.5 mm长）放入切口以打开胸腔以改善可视化。
- 要露出主动脉弓，请尝试抬起并用细尖 45° 角镊子轻轻地将胸腺和脂肪组织与主动脉弓分开。
6.用O形圈结扎横主动脉
- 用一只手用 45° 角的镊子露出主动脉弓。用另一只手定位通过一侧的螺纹 与 连接助剂连接的O形圈（步骤2）。
- 使用主动脉弓下的结扎辅助工具将线从尾侧传递到头臂动脉和左颈总动脉之间的横主动脉的颅侧（图3A）。
- 用镊子小心地将结扎辅助剂和主动脉弓之间的两根线都取走。缩回并取下结扎辅助剂，并通过拉动两侧的螺纹将O形圈轻轻定位在拱形周围（图3B）。
- 成功定位后，用线和手术结固定 O 形圈。再做一个以避免打开每侧的结（图 3C）。
图 3：执行 O 形圈植入 。 （A）主动脉弓由三个1.0-2.5毫米的牵开器暴露。一个环侧的两个长线都穿过主动脉下方。（B） 通过轻轻推动环并拉动螺纹来放置 O 形圈。（C）O形圈在正确的位置，每侧用尾线打结一根颅线。 请点击此处查看此图的大图。
7. 缝合和术后恢复
- 从切口取出三个胸部牵开器（2.5 mm 长）。
- 如果需要，通过用温热的 0.9% 等渗盐溶液填充胸部来消除胸部残留的空气。
- 要暴露胸部切口进行缝合，请再次取两个牵开器（5 mm长）以将皮肤保持在侧面。
- 用两个或三个6-0不可吸收的缝合线关闭胸部（见 材料表），并捏掉呼吸机的流出量2秒以重新充气肺部。
- 取下两个牵开器，用三到五条4-0-可吸收缝合线闭合皮肤。
- 关闭异氟醚并监测。当动物开始自我呼吸时，胡须在移动，并且可以触发脚趾捏反射，拔管小鼠。将鼠标放在其护理单元的加热灯下方的左侧并观察它，直到它完全清醒。
- 在动物恢复足够的意识之前，不要让动物无人看管。
注意：接受过手术的动物应该有自己的护理单元（笼子），以便更好地恢复。 - 如果需要，使用曲马多（1 mg/mL）在饮用水中治疗7天，并在手术后腹腔注射丁丙诺啡（0.1 mg/kg，每日3次）进行疼痛管理，持续3天。
注意：遵循当地动物伦理委员会关于术后镇痛的建议。 - 每天称量水瓶以检查药物，并观察动物的行为。
8. 确认成功收缩和环的正确位置
- 手术后一天，通过测量狭窄处的最大流速，使用超声验证狭窄。
- 对于测量，将超声心动图与超声系统和频率为30 MHz的换能器探头一起使用（见 材料表）。
- 如上所述，使用面罩在1.5%-2%异氟醚和0.5-1.0 L / min的100%O2保持麻醉。
- 将麻醉动物仰卧放在加热垫上。将加热垫与直肠探头连接，以将体温保持在37°C±1°C，并使用四个鼠标爪传感器用心电图监测心率（见 材料表）。
- 为了获得更好的可视化效果，请使用脱毛霜。
- 成功执行的ORAB导致通过超声测量的狭窄上的流速增加（~2，400 mm / s）（图4C）。对于此测量，将换能器头放在右侧胸骨侧，以通过二维 （2D） 成像（“B 模式”）定位主动脉弓。
- 使用彩色多普勒观察主动脉中的血流，并用脉冲波多普勒测量狭窄处的血流速度。
注意：假手术小鼠（无收缩的对照手术）显示血流速度为~600-900mm / s。此外，成功的ORAB还导致小鼠右颈动脉（~150 mm / s）（RC，图 4A）和左颈动脉（~300 mm / s）LC，图4B）之间的速度流比增加。
- 使用彩色多普勒观察主动脉中的血流，并用脉冲波多普勒测量狭窄处的血流速度。
- 通过二维 （2D） 成像（B 模式）可视化左右颈动脉内侧动脉。将换能器头水平放置在颈部左右两侧，成 45° 角，并使用脉冲波多普勒确定血流速度。
注意：在假手术小鼠中，两条动脉的速度流动相似。
图 4：使用颈动脉中的脉搏波多普勒速度测量确认横主动脉结扎。 （A）右颈动脉的代表性脉冲波多普勒速度信号。（B）狭窄导致右颈动脉的流速高于左侧。（C）收缩引起的狭窄导致降主动脉流速超过2，400毫米/秒。假鼠的流速为600-900毫米/秒。 请点击这里查看此图的大图。
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Representative Results
通常，主动脉束带类似于人类主动脉瓣狭窄并诱导小鼠心脏肥大。成功的手术的特点是心脏组织重塑反映在心脏肥大和心脏功能下降5，6。
手术后1天直接，通过超声心动图13可以在体内确定横主动脉O形环收缩的影响。通过脉冲波多普勒超声测量的主动脉狭窄的血流速度增加，显示了主动脉瓣狭窄的成功诱导（图 4C）。此外，如上所述，我们确定左右颈内动脉之间的血流速度比作为ORAB的功能标志物（图4A，B）。
放置0.4mmO形圈两周后，可以通过超声心动图确定心脏肥大的成功诱导。二维 （2D） 时间运动模式 （M 模式） 显示可视化的心脏结构在心动周期中的变化。手术后两周，可以观察到舒张期左心室（LV）后壁（LVPW）和室间隔（IVS）直径增加（图5B）。此外，通过测量左心室射血分数 （LVEF） 降低，可以记录心脏功能的进行性恶化。
图 5：术后 2 周通过超声心动图确认诱导的心脏肥大。 （A）手术后2周假手术小鼠的代表性M型图像。（B） 手术后 2 周 ORAB 手术小鼠的 M 模式成像，舒张期左心室后壁 （LVPW） 和室间隔 （IVS） 直径增加。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
基于线/缝合的主动脉束带已被用于诱导小鼠压力超负荷的心脏肥大。这是一种研究体内心脏重塑和疾病进展的病理机制的既定方法 。 局限性在于狭窄程度的差异相对较高，因此重塑也是如此。最近引入的ORAB技术首先由Melleby等人描述10 通过使用橡胶O形圈优化了传统方法。
该技术最有价值的好处是O形圈的固定直径，这导致狭窄程度的变化较小，因此，手术后心脏肥大的表型更具可重复性。另一个优点是这种方法的学习速度更快，更容易放置。使用基于线/缝合线的过程，在主动脉周围找到合适的结扎程度通常需要时间和经验。相比之下，由于固定直径或O形圈，这与O形圈方法不同。
开胸手术是ORAB技术的关键点，这对动物来说是痛苦的，但对于O形环结扎是必要的。为了达到更好的恢复并避免肺不张的发生，重要的是要预防肺损伤并通过呼吸机监测通气。对于基于线/缝合线的方法，有机会采用微创技术。在这个过程中，组织用一对镊子铺开，仅用于将线放在主动脉周围 7，13。然而，这种手术的缺点仍然是结扎可能导致主动脉受伤。
最近，Nakao等人9报告 了一种与ORAB方法类似的技术。所谓的O形环诱导的横动脉收缩（OTAC）是通过不插管的迷你立体切开术进行的。与本研究类似，结果显示出高重现性。然而，对小鼠的胸骨切开术对动物来说可能比用牵开器扩散组织更痛苦。
独特的ORAB技术是对基于线/缝合线的技术的改进。使用O形圈的固定直径，狭窄和随后的心脏肥大的可变性较低，从而产生更可重复的结果。此外，该程序的训练需要更少的小鼠。这种方法的低死亡率表明它是埋线/缝合TAC模型的潜在优越替代方案。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了联邦电影和研究部（BMBF）对L.L.、N.F.和O.J.M.（IVOLADMT-HF;FKZ 01KC2006A）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
References
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