长期与短期造血干细胞的分离方法

摘要

我们介绍了一种利用Hoxb5报告系统分离长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的逐步实验方案。

摘要

自我更新能力和多谱系分化潜能通常被认为是造血干细胞（HSCs）的定义性特征。然而，大量研究表明，HSC细胞室中存在功能异质性。近期的单细胞分析报道了在HSC细胞室中具有不同细胞命运的HSC克隆，这些克隆被称为偏向性HSC克隆。目前对导致这些异质性或可重复性差的结果背后的机制仍知之甚少，尤其是在通过传统免疫染色方法移植纯化的HSC组分时，其自我更新持续时间的相关机制尚不明确。因此，建立一种可重复的方法来分离长期HSC（LT-HSCs）和短期HSC（ST-HSCs）， 即根据其自我更新持续时间来定义这两类细胞，对于解决这一问题至关重要。通过无偏倚的多步骤筛选，我们鉴定出一个转录因子Hoxb5，它可能是小鼠造血系统中LT-HSCs的特异性标志物。基于这一发现，我们构建了Hoxb5报告基因小鼠品系，并成功分离出LT-HSCs和ST-HSCs。本文详细描述了利用Hoxb5报告系统分离LT-HSCs和ST-HSCs的实验方案。该分离方法将有助于研究人员更深入地理解HSC细胞室中自我更新机制及其异质性的生物学基础。

引言

造血干细胞（HSCs）具有自我更新能力和多向分化潜能，位于造血 hierarchy 的顶端^1,2。1988年，Weissman 及其同事首次证明可通过流式细胞术分离小鼠 HSCs³。随后，有研究报道，通过一组细胞表面标志物组合定义的细胞亚群——Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1⁺CD150⁺CD34^−/loFlk2⁻——包含小鼠体内全部的 HSCs^4,5,6,7,8。

免疫表型定义的（Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1⁺CD150⁺CD34^−/loFlk2⁻）造血干细胞（以下简称 pHSCs）曾被认为在功能上是均一的。然而，近期的单细胞分析表明，pHSCs 在自我更新能力^9,10 和多能性^11,12 方面仍存在异质性。具体而言，在 pHSC 群体中似乎存在两种具有不同自我更新能力的细胞亚群：长期造血干细胞（LT-HSCs），具有持续的自我更新能力；以及短期造血干细胞（ST-HSCs），具有短暂的自我更新能力^9,10。

迄今为止，区分长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的自我更新能力的分子机制仍不清楚。根据这两种细胞群体的自我更新能力对其进行分离，并揭示其潜在的分子机制，具有重要意义。已有多种报告系统被用于富集长期造血干细胞^13,14,15；然而，不同报告系统所定义的长期造血干细胞纯度存在差异，迄今为止尚未实现长期造血干细胞的完全特异性纯化。

因此，建立一种分离LT-HSC和ST-HSC的系统将加速对pHSC组分中自我更新能力的研究。在LT-HSC和ST-HSC的分离过程中，一项采用多步骤、无偏筛选的研究鉴定出一个在pHSC组分中呈异质性表达的单个基因Hoxb5¹⁶。此外，对Hoxb5报告基因小鼠的骨髓分析显示，pHSC组分中约有20%–25%为Hoxb5^pos细胞。利用Hoxb5^pos pHSC与Hoxb5^neg pHSC进行的竞争性移植实验表明，仅有Hoxb5^pos pHSC具备长期自我更新能力，而Hoxb5^neg pHSC在短期内即丧失自我更新能力，提示Hoxb5可识别pHSC组分中的LT-HSC¹⁶。

本文中，我们演示了使用Hoxb5报告系统分选长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的逐步实验方案。此外，我们介绍了一种竞争性移植实验，用于评估Hoxb5^pos/neg 表型造血干细胞（pHSCs）的自我更新能力（图1）。该Hoxb5报告系统使我们能够前瞻性地分离LT-HSCs和ST-HSCs，有助于深入理解LT-HSC特异性特征。

方案

所有所述动物实验均已获得理化学研究所生物系统动力学研究中心的批准。

1. 受体小鼠的预处理

1. 准备8至10周龄的雄性C57BL/6同源小鼠作为受体小鼠。受体小鼠的数量取决于实验方案。我们通常为每种条件准备10至20只小鼠。
   1. 给予小鼠添加恩诺沙星（170 mg/L）的无菌水喂养。由于经照射的受体小鼠极易感染，应尽可能保持笼具清洁。
      注意：抗生素补充应在照射前24小时开始，并持续至移植后3周，以预防感染。
2. 全身照射
   1. 全身照射可破坏受体小鼠的骨髓细胞，以确保供体细胞成功植入。将受体小鼠转移至照射专用笼中。在移植前12至16小时，以单次8.7 Gy剂量进行致死性全身照射。
      注意：辐射剂量和时间可能因设备而异。致死性辐射剂量应根据研究者所使用的照射仪和小鼠品系进行确认。
   2. 全身照射后，将小鼠放回原有笼具中。

2. 供体骨髓细胞的收集

1. 准备一只12周龄的雄性Hoxb5-tri-mCherry小鼠，通过暴露于CO₂后进行颈椎脱位，或采用当地动物伦理委员会批准的方法处死小鼠。
   注意：每只小鼠所用试剂的体积将在后续步骤中说明。
2. 在无菌条件下去除皮肤，暴露骨骼（股骨、胫骨、骨盆、肱骨）。剪除主要肌肉组织，取出骨骼（股骨、胫骨、骨盆、肱骨），并将其置于含有无Ca²⁺和Mg²⁺、预冷的PBS的无菌细胞培养皿中。
3. 使用镊子、小剪刀和擦拭纸去除骨骼上的肌肉和纤维组织，以防止污染。操作时注意避免骨骼断裂。若骨骼发生断裂，应予以丢弃，以维持无菌状态。
4. 用70%乙醇（EtOH）对研钵和研杵进行消毒，并使其完全干燥。随后用细胞染色缓冲液（含2%热灭活FBS、2 mM EDTA、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的无Ca²⁺和Mg²⁺ PBS）平衡。
5. 将骨骼放入研钵中，加入3 mL细胞染色缓冲液。用研杵轻轻研磨使骨骼破碎。通过轻柔吹打分散细胞团块，并将细胞悬液经100 µm细胞滤筛过滤至50 mL离心管中。
6. 重复步骤2.5，直至溶液变澄清。通常重复三次即可。

3. 通过磁性分选分离 c-kit⁺ 细胞

1. 用于磁性分选的抗体染色
   1. 将样品在 400 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 1 mL 细胞染色缓冲液中。加入 10 µL 大鼠 IgG（5 mg/mL）以减少非特异性抗体结合，使用 P1,000 移液器轻轻吹打混匀。冰上孵育 15 分钟。
   2. 加入浓度为 4 µg/mL 的 c-Kit 抗体（克隆号 2B8），用 P1,000 移液器混匀。冰上孵育 15 分钟。
   3. 加入 5 mL 细胞染色缓冲液，充分混匀。将样品在 400 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 500 µL 细胞染色缓冲液中。
   4. 加入 35 µL 抗 APC 微珠以富集 c-Kit⁺ 细胞，用 P1,000 移液器混匀。冰上孵育 15 分钟。
   5. 加入 4–5 mL 细胞染色缓冲液。将样品在 400 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 1 mL 细胞染色缓冲液中。
2. 磁性分选 c-Kit⁺ 细胞
   1. 按照制造商说明书进行细胞分选。简而言之，先用 3 mL 细胞染色缓冲液预平衡磁性分选柱。将样品（1 mL）经 40 µm 细胞滤网过滤后加载至磁性分选柱上。
   2. 用 3 mL 细胞染色缓冲液洗涤三次。每次需待分选柱储液区完全排空后再加入下一次洗涤缓冲液。
   3. 将磁性分选柱置于预冷的 15 mL 离心管上方，加入 5 mL 细胞染色缓冲液。用力推动柱塞将细胞冲洗下来。将穿流液置于冰上保存。
      ​注意：若发生样品意外丢失，我们将保留穿流液直至实验结束。

4. 造血干细胞染色

1. 将步骤 3.2.3 中制备的样品在 400 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液。
2. 向沉淀中加入 CD34 抗体（克隆号 RAM34），终浓度为 50 µg/mL，在冰上孵育 60 分钟。
   注意：建议在 CD34 抗体孵育的第一小时内同步制备辅助细胞，以缩短整体处理时间。
3. 根据 表 1 配制抗体主混合液。向样品中加入 100 µL 主混合液，在冰上孵育 30 分钟。CD34 抗原抗体（克隆号：RAM34）需要 90 分钟才能实现充分染色。
4. 加入 4–5 mL 细胞染色缓冲液。在 400 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液。向沉淀中加入链霉亲和素-BUV737，终浓度为 3 µg/mL，在冰上孵育 30 分钟。
5. 加入 4–5 mL 细胞染色缓冲液。在 400 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 400 µL 细胞染色缓冲液中。将样品置于冰上保存。

5. 支持细胞的制备

1. 准备 CD45.1⁺ CD45.2⁺ 12周龄的同源近交系小鼠；理想情况下，其年龄应与供体小鼠相同。通过二氧化碳处死小鼠₂ 暴露后通过颈椎脱位处死，或采用当地动物伦理委员会批准的方法。
   注意：在提供的示例中，CD45.1⁺ CD45.2⁺ 通过将B6.CD45.1同源小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，在本实验室繁育同源小鼠¹⁶.
2. 在无菌条件下，取双侧股骨和胫骨，置于含有 Ca 的无菌细胞培养皿中²⁺- 和 Mg²⁺用镊子和小剪刀从骨骼上修剪掉肌肉和纤维组织，使用无菌的冰冷 PBS。
3. 用锋利且无菌的剪刀剪去骨骼的两端。使用一支装有冰冷细胞悬浮缓冲液（Ca²⁺- 和 Mg²⁺用含有2%热灭活FBS、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的无菌PBS冲洗骨髓，将其冲入含细胞悬浮缓冲液的无菌细胞培养皿中。通过轻柔吹打分散细胞团块。
4. 使用 P1,000 移液器将细胞悬液通过 40 µm 细胞滤网过滤。用血细胞计数板对细胞悬液中的细胞数量进行计数，并制备含有 1 x 10⁶ 个细胞的骨髓细胞悬液。⁶ cells/mL
5. 转移200 µL骨髓细胞悬液（2 × 10⁶细胞/200 µL）至1.5 mL微量离心管中⁵ 将细胞加入96孔圆底板中，冰上保存备用。
   注意：建议使用圆底培养板，以便于收集细胞。

6. Hoxb5^pos 或 Hoxb5^neg pHSC 分选

1. 设门方案
   1. 将步骤 4.5 中制备的样品 400 µL 转移至带有 35 µm 细胞筛网扣盖的圆底聚苯乙烯试管中。配制死细胞染色试剂，并根据制造商说明书在分析前加入样品中。
   2. 打开流式细胞仪，按照制造商说明书启动分析软件。然后点击加载（Load），开始采集数据。
      注意：建议使用配备五根激光器和 70 µm 喷嘴的流式细胞仪，以提高分选细胞的纯度。
   3. 排除双联体、死细胞和谱系标记阳性细胞后，圈选 Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1⁺ 细胞群。接着排除 Flk2⁺ 细胞群。随后在 CD150⁺CD34^−/low 细胞群中圈选 Hoxb5^pos 或 Hoxb5^neg pHSCs（图 2）。首次实验时需进行光谱重叠补偿。
      注意：Hoxb5 阳性细胞预计占 Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1⁺CD150⁺CD34^−/lowFlk2⁻ 细胞群的 20%–25%。
2. Hoxb5^pos 或 Hoxb5^neg pHSCs 的分选
   1. 在 1.5 mL 低蛋白结合管中加入 600 µL 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS，补充 10% 热灭活的 FBS。
   2. 将上述 1.5 mL 低蛋白结合管置于分选收集装置上，使用步骤 6.1.3 中设定的设门策略，将 Hoxb5^pos 或 Hoxb5^neg pHSCs 分选至该 1.5 mL 管中。首次分选时采用分选精度模式中的得率优先模式。
   3. 将步骤 5.5 中制备好饲养细胞的 96 孔板置于自动细胞沉积单元（ACDU）载物台上。将步骤 6.2.2 中准备的 1.5 mL 低蛋白结合管置于流式细胞仪的上样口。
   4. 使用步骤 6.1.3 中设定的设门策略，将 Hoxb5^pos 或 Hoxb5^neg pHSCs 分选至含有饲养细胞的 96 孔板中。分选 10 个 Hoxb5^pos 或 Hoxb5^neg pHSCs 以检测其自我更新能力。
      注意：建议进行二次分选以提高纯度。第二次分选时推荐选择纯度优先的分选精度模式。
   5. 通常情况下，经过两次分选后可获得 500–1,000 个 Hoxb5^pos pHSCs 和 1,500–4,000 个 Hoxb5^neg pHSCs。分选后应尽快进行移植操作，以提高细胞活力（理想情况下在 1–2 小时内完成）。

7. 移植

1. 将步骤 6.2.4 中制备的 HSC 分选 96 孔板置于冰上。在无菌条件下操作该 HSC 分选 96 孔板，最好在细胞操作台中进行。
2. 使用含 2% 异氟烷的气体麻醉诱导舱对受体小鼠进行麻醉。当动物完全麻醉后，将其取出并侧卧放置。为确保麻醉充分，需确认其对有害刺激无反应。
3. 确认麻醉适当后，应尽快进行眶后注射，以防止小鼠恢复意识。眶后注射过程耗时少于 30 秒。
   ​注意：由于注射时间较短，本实验在操作过程中未使用眼用软膏。但如果操作时间较长，建议使用眼用软膏。
4. 轻轻吹打 HSC 分选 96 孔板中的细胞使其混匀。使用 30 G 胰岛素注射器吸取分选板中的供体细胞，并将其注入受体小鼠的眶后静脉丛。推荐注射体积为 ≤200 µL。
5. 观察小鼠直至其清醒并在洁净笼具中自由活动。确认其恢复后，将其放回饲养笼中。

8. 外周血分析

1. 从尾静脉采集 50 µL 外周血，并用含 2 mM EDTA 的无 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ PBS 100 µL 重悬。将所有样品转移至 96 孔板中。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
2. 加入 200 µL 红细胞裂解缓冲液，冰上孵育 3 分钟。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。
3. 加入 200 µL 细胞染色缓冲液。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
4. 根据 表 2 配制抗体混合液。加入 50 µL 抗体混合液，冰上孵育 30 分钟。
5. 加入 150 µL 细胞染色缓冲液。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
6. 加入 200 µL 细胞染色缓冲液。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。用 200 µL 细胞染色缓冲液重悬细胞，并根据生产商说明书在分析前加入死细胞染色试剂。
7. 按照先前所述方法¹⁶ ，使用流式细胞仪分析外周血嵌合率。在移植后 4 周、8 周、12 周和 16 周采集血液，以追踪多谱系重建情况。代表性流式细胞术图示见 图 3。

结果

此前，自我更新能力通常通过竞争性移植实验进行测定，其中认为只有当在受体外周血中观察到多谱系的供体细胞时，供体造血干细胞（HSCs）才保留了其自我更新能力¹⁷。此外，已有若干研究报告将长期造血干细胞（LT-HSCs）定义为在第二次骨髓移植后数月仍能持续产生外周血细胞的细胞^10,18。因此，为了比较其自我更新能力，从Hoxb5报告小鼠中分离出的10个Hoxb5^pos或Hoxb5^neg初代造血干细胞（pHSCs）与2 × 10⁵个全骨髓细胞一同移植至致死剂量 irradiated 的初级受体小鼠体内。随后，在初次移植16周后，将初级受体小鼠骨髓中分离出的1 × 10⁷个骨髓细胞移植至致死剂量 irradiated 的次级受体小鼠体内，以评估其长期自我更新能力（图1）。图2

讨论

传统上，人们通过细胞表面标志物来分离造血干细胞（HSCs），以研究其功能，例如自我更新能力和多向分化潜能^19,20,21。然而，基于免疫表型定义的HSC群体（Lineage⁻c-Kit⁺Sca-1⁺CD150⁺CD34^−/loFlk2⁻）实际上包含两种不同的HSC亚群：长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）^9,10。因此，目前尚未实现对真正意义上的HSC——即LT-HSCs——的特异性分析。因此，利用Hoxb5报告系统分离LT-HSCs的方法将极大促进对自我更新能力分子机制的探索。

本...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL 8联管，凸盖	SSIbio	3230-00
0.5M EDTA pH 8.0	Iinvtrogen	AM9260G
100 µm 细胞筛	Falcon	352360
30G 胰岛素注射器	BD	326668
40 µm 细胞筛	Falcon	352340
5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞筛 snap cap	FALCON	352235
7-AAD 活性染色液	BioLegend	420404
96孔U型底板	FALCON	351177
Anti-APC-MicroBeads	Milteny biotec	130-090-855
带捕集瓶的抽吸装置	Biosan	FTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)	BioLegend	103232
B220-Biotin (RA3-6B2)	BioLegend	103204
B220-BV786 (RA3-6B2)	BD Biosciences	563894
B6.CD45.1 同源小鼠	Sankyo Labo Service	N/A
Baytril 10%	BAYER	341106546
BD FACS Aria II 特殊订购系统	BD	N/A
Brilliant 染色缓冲液	BD	566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)	BioLegend	101222
CD11b-Biotin (M1/70)	BioLegend	101204
CD11b-BUV395 (M1/70)	BD Biosciences	563553
CD11b-BV711 (M1/70)	BD Biosciences	563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)	Invitrogen	56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)	Invitrogen	56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)	BD Biosciences	560230
CD34-FITC (RAM34)	Invitrogen	11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)	BioLegend	100216
CD3ε -Biotin (145-2C11)	BioLegend	100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)	BioLegend	100341
CD45.1/CD45.2 同源小鼠	N/A	N/A	本实验室繁育
CD45.1-FITC (A20)	BD Biosciences	553775
CD45.2-PE (104)	BD Biosciences	560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)	BioLegend	100430
CD4-Biotin (GK1.5)	BioLegend	100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)	BioLegend	100730
CD8a-Biotin (53-6.7)	BioLegend	100704
15 ml 离心管	NICHIRYO	00-ETS-CT-15
50 ml 离心管	NICHIRYO	00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)	Invitrogen	47117182
D-PBS (-)，不含 Ca 和 Mg，液体	Nacalai	14249-24
胎牛血清	Thermo Fisher	10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)	eBioscience	46135182
FlowJo 版本 10	BD Biosciences	https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Gmmacell 40 Exactor	Best theratronics	N/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)	BioLegend	108422
Gr-1-Biotin (RB6-8C5)	BioLegend	108404
Hoxb5-tri-mCherry 小鼠（C57BL/6J 背景）	N/A	N/A	本实验室繁育
大鼠血清来源 IgG，技术级，>=80% (SDS-PAGE)，缓冲水溶液	Sigma-Aldrich	I8015-100MG
异氟烷	Pfizer	4987-114-13340-3
Kimwipes S200	NIPPON PAPER CRECIA	6-6689-01
LS 柱	Milteny biotec	130-042-401
裂解缓冲液	BD	555899
MACS  MultiStand	Milteny biotec	130-042-303
组织培养用多孔板（贴壁细胞用）6孔	IWAKI	3810-006
MidiMACS 分离器	Milteny biotec	130-042-302
小鼠 Pie 笼	Natsume Seisakusho	KN-331
多功能冷冻离心机	TOMY	EX-125
NARCOBIT-E (II)	Natsume Seisakusho	KN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)	BioLegend	108728
青霉素-链霉素混合溶液	nacalai	26253-84
瓷研钵 φ120mm 带研杵	Asone	6-549-03
Protein LoBind 1.5 mL 管	Eppendorf	22431081
Sca-I-BUV395 (D7)	BD Biosciences	563990
不锈钢手术刀片	FastGene	FG-B2010
链霉亲和素-BUV737	BD Biosciences	612775
SYTOX-red	Invitrogen	S34859
小鼠尾静脉固定器（标准型）	Braintree	TV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597)	BioLegend	109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)	BioLegend	116220
Ter-119-Biotin (TER-119)	BioLegend	116204
Terumo 5 ml 同轴鲁尔滑动注射器	TERUMO	SS-05LZ
Terumo 皮下注射针头 23G x 1	TERUMO	NN-2325-R