Summary
Bu çalışma, enüklee edilmiş kürelerin yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemesini sağlamak için 3D baskılı bir tutucu kullanan yeni bir deneysel protokolü açıklamaktadır. Bu protokol sayesinde, ex vivo kürelerden yaralı kornea epitelindeki hücresel kalsiyum sinyal aktivitesi gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.
Abstract
Kornea epitelyal yara iyileşmesi, epitel hücrelerinde eksprese edilen pürinerjik reseptörlerin aktivasyonu ile başlayan bir göç sürecidir. Bu aktivasyon, hücreden hücreye yayılan, yara yatağına hücresel hareketliliği başlatmak için gerekli olan ve etkili yara iyileşmesini teşvik eden kalsiyum mobilizasyon olaylarıyla sonuçlanır. Trinkaus-Randall laboratuvarı, ex vivo murin kürelerinde kornea yarasının iyileşme yanıtını gerçek zamanlı olarak görüntülemek için bir metodoloji geliştirdi. Bu yaklaşım, sağlam bir küreyi, belirlenmiş protokollere göre ötenazi yapılmış bir fareden çekirdeksizleştirmeyi ve dünyayı derhal bir kalsiyum gösterge boyası ile inkübe etmeyi içerir. Hücrenin diğer özelliklerini lekeleyen bir karşı boya, görüntülemeye yardımcı olmak ve hücresel yer işaretlerini göstermek için bu aşamada uygulanabilir. Protokol, aktini boyamak için SiR aktinini ve hücre zarını boyamak için koyu kırmızı plazma zarı boyası da dahil olmak üzere karşı boyama için kullanılan birkaç farklı canlı hücre boyasıyla iyi çalıştı. Bir yaraya verilen cevabı incelemek için, kornea epiteli 25 G'lik bir iğne kullanılarak yaralanır ve küreler 3D baskılı bir tutucuya yerleştirilir. 3D baskılı tutucunun boyutları, deney süresince dünyanın hareketsiz kalmasını sağlamak için kalibre edilir ve farklı boyutlardaki gözlere uyacak şekilde değiştirilebilir. Yara yanıtının canlı hücre görüntülemesi, konfokal mikroskopi kullanılarak zaman içinde doku boyunca çeşitli derinliklerde sürekli olarak gerçekleştirilir. Bu protokol, konfokal mikroskopta 20x hava hedefi kullanarak yüksek çözünürlüklü, yayın kalitesinde görüntüler üretmemizi sağlar. Bu protokol için başka hedefler de kullanılabilir. Ex vivo murin kürelerde canlı hücre görüntüleme kalitesinde önemli bir iyileşmeyi temsil eder ve sinirlerin ve epitelin tanımlanmasına izin verir.
Introduction
Kornea
Kornea gözün ön yüzeyini kaplayan, görmeyi sağlamak için ışığı kıran ve gözün içini hasardan koruyan berrak, avasküler bir yapıdır. Kornea çevreye maruz kaldığından, hem mekanik nedenlerden (çizilme) hem de enfeksiyondan kaynaklanan hasarlara karşı hassastır. Aksi takdirde sağlıklı bir hastada kornea yaralanması tipik olarak 1-3 gün içinde iyileşir. Bununla birlikte, limbal kök hücre eksikliği ve tip II diyabet gibi altta yatan koşulları olan hastalarda, kornea yarası iyileşme süreci büyük ölçüde uzayabilir1. Kornea oldukça innervatlı olduğundan, bu iyileşmeyen kornea ülserleri ve tekrarlayan kornea erozyonları çok ağrılıdır ve bunları yaşayan hastaların yaşam kalitesini büyük ölçüde azaltır1.
Hücre sinyalizasyonu
Aksi takdirde sağlıklı bir kornea yaralandığında, yaraya bitişik hücrelerdeki kalsiyum sinyal olayları, yara yatağına hücresel göçten önce gelir ve hızlı bir şekilde göç eder, buradayara izi 2,3 riski olmadan yaralanmayı kapatırlar. Bu sinyal olayları, canlı hücre görüntüleme2 kullanılarak kornea epitel hücre kültürü modellerinde iyi karakterize edilmiştir. Ön deneyler, diyabetik olmayan hücrelerde yaralanma sonrası diyabetik hücrelere kıyasla önemli ölçüde daha fazla kalsiyum sinyallemesi olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, ex vivo kürelerdeki hücre sinyal olaylarının karakterizasyonunun teknik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır.
Canlı hücre görüntüleme
Önceki çalışmalar, kornea yara iyileşmesinin in vitro hücre kültürü modellerinden kalsiyum sinyal olaylarını başarıyla kaydetmiştir 4,5,6. Bu sinyal olaylarının ex vivo dokuda yüksek kaliteli görüntülerini üretmek için bir metodoloji geliştirmek büyük ilgi çekicidir, çünkü bu olayların daha karmaşık ve gerçekçi bir sistemde incelenmesine izin verecektir. Önceki yaklaşımlar korneanın diseksiyonunu ve ardından UV kaynaklı PEG jeli 7,8,9'da immobilizasyonu içeriyordu. İmmobilizasyon, canlı doku ile çalışırken önemli ama zorlu bir adımdır, çünkü deney boyunca canlı ve hidratlı kalması gerekir. Ayrıca, immobilizasyon dokuya zarar vermemelidir. PEG çözeltisi dokuyu hareketsiz hale getirirken, üretilen görüntülerin çözünürlüğü ve kalitesi tutarlı değildi. Bu nedenle, daha az doku hasarı riski taşıyan daha yüksek kaliteli görüntüler üretmek için bozulmamış küreleri hareketsiz hale getirmek için 3D baskılı tutucular geliştirilmiştir.
Yaklaşım
Canlı hücre görüntüleme için bozulmamış ex vivo küreleri hareketsiz hale getirmek için benzersiz bir 3D baskılı tutucu geliştirilmiştir. Bu tutucu iki ana kaynaktan gelen hasarı önler: korneayı diseke etmeye gerek kalmadan enüklee edilmiş bir kürenin görüntülenmesini sağlar ve UV ışığına maruz kalmayı ortadan kaldırır. Bu hasar kaynakları olmadan, elde edilen görüntüler deneysel olarak yapılan çizik yaralanmalarına verilen cevabı daha doğru bir şekilde temsil ediyordu. Ayrıca, 3D baskılı tutucu, murin gözünün hassas boyutlarına göre kalibre edildi. Bu, PEG çözeltisinde immobilizasyondan çok daha iyi bir uyum sağladı ve doku hareketinin azalması nedeniyle daha düşük güçlü hedeflerde daha yüksek kaliteli bir görüntüye yol açtı. Tutucunun üst kısmına tutturulmuş bir kapak çubuğu, deney süresince dünyanın hareketsiz kalmasını ve hidrasyon ve canlılığı korumak için büyüme ortamı uygulandığında dünyanın yer değiştirmemesini sağlar. Tutucuyu hassas boyutlara basma yeteneği, yaş veya hastalık durumu nedeniyle farklı boyutlardaki murin gözleri için en uygun uyumu sağlamamızı sağlar. Bu teknoloji, boyutlarına göre farklı türlerin gözleri için tutucular geliştirmek için daha geniş çapta uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan denekleri içeren prosedürler, Oftalmik Bakım ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği ve Boston Üniversitesi IACUC protokolü (201800302) tarafından onaylanmıştır.
1. 3D baskılı tutucuların ve kapak çubuğunun tasarlanması
- Fare kürelerinin ortalama çapını hesaba katan 3B baskılı tutucuları ve kapak çubuğunu tasarlayın ve tasarımı 3B yazdırın (Şekil 1A, B).
- Bireysel farelerin farklı boyutlarını hesaba katmak için tutucunun iç duvarının çapını, dünyanın ortalama çapından biraz daha büyük tutun. Tutucunun yüksekliğini dünya çapının yaklaşık yarısında tutun ve 3D baskılı kapak çubuğu ile sabitlendiğinde dünyaya sıkıca oturmasını sağlayın.
- Tutucu kapak çubuğunu, tutucu çapının 1/4 ila 1/2'si genişliğinde tutucunun dış çapının uzunluğuna göre boyutlandırın. Kapak çubuğu, hidrasyon ve deneyin sonunda gözün çıkarılması için tutucuya sabitlendiğinde küreye erişime izin verecek şekilde boyutlandırılmıştır.
- Tutucuyu ve kapak çubuğunu yazdırın.
2. Örnek toplama
- Ötenazi fareler (bu çalışma için 9-12 haftalık ve 27 haftalık erkek C57BL / 6 fareler kullanılmıştır) kurumsal kılavuzlara uygun olarak belirlenmiş protokolleri kullanarak. Bu protokol için, karbondioksit ile ötenazi ve ardından kafa kesme işlemini gerçekleştirin.
- Fare kafasını çıkarın ve dokunun canlılığını korumak için hemen buzun üzerine yerleştirin. Doku hasarını önlerken diseksiyon aletleri kullanarak küreleri enüklee edin.
- Cımbız kullanarak dünyayı proptozlayın. Optik siniri, cımbız tarafından tutulduğu yerin hemen altındaki diseksiyon makası kullanarak kırpın.
NOT: Daha fazla önlem için, laminer akış başlığında aşağıdaki adımları uygulayın. - Düşük ışık koşullarına sahip 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde 1 saat boyunca kalsiyum göstergesi ve/veya hücre zarı lekesi içeren bir p35 hücre kültürü kabındaküreleri 2 mL ortamda inkübe edin. Düzgün boyama için kürelerin boyama ortamına batırıldığından emin olun.
- Burada yapılan deneyler için, kalsiyum göstergesi, Fluo4-(1:100)2 ve hücre zarı karşı boyası, koyu kırmızı plazma membran boyası (1:10.000)2, aşağıdaki büyüme takviyeleri ile 2 mL keratinosit serumsuz ortamda (KSFM) %1 (v/v) DMSO ve %0,1 (w/v) pluronik asit nihai konsantrasyonu ile: 25 μg/mL sığır hipofiz ekstresi, 0.02 nM epidermal büyüme faktörü, 0.3 mM CaCl2 ve penisilin-streptomisin (sırasıyla 100 ünite / mL ve 100 μg / mL).
NOT: Kuluçka koşulları ve süreleri, kalsiyum göstergesine, doku tipine ve numune hacmine bağlı olarak değişir. Pluronik asit kullanırken, dokuyu geçirgen hale getirdiği için dikkatli olunması önerilir. Bu protokol% 10 pluronik asit gerektirir. Daha düşük pluronik asit konsantrasyonlarının etkisiz olduğu deneysel olarak belirlenmiştir ve daha yüksek konsantrasyonlar dokuya zarar verme riski taşır.
- Burada yapılan deneyler için, kalsiyum göstergesi, Fluo4-(1:100)2 ve hücre zarı karşı boyası, koyu kırmızı plazma membran boyası (1:10.000)2, aşağıdaki büyüme takviyeleri ile 2 mL keratinosit serumsuz ortamda (KSFM) %1 (v/v) DMSO ve %0,1 (w/v) pluronik asit nihai konsantrasyonu ile: 25 μg/mL sığır hipofiz ekstresi, 0.02 nM epidermal büyüme faktörü, 0.3 mM CaCl2 ve penisilin-streptomisin (sırasıyla 100 ünite / mL ve 100 μg / mL).
3. Numune tutucuların hazırlanması
- Tutucuları, daha önce kullanılmamış tutkalla temiz bir cam tabanlı kapak kapağına yapıştırın. Bu protokolde kullanılan yapıştırıcı, steriliteyi sağlamak için tek kullanımlık kaplardan gelir ve her seferinde yeni, açılmamış bir kap kullanılır.
- Tutucuyu% 70 etanol içinde yıkayın. Tutucuya yapıştırıcı yerleştirin ve tutucuyu cam alt kapak kapağına yapıştırın. Tutkalın tutucunun iç alanında olmadığından emin olun, çünkü yapıştırıcı floresan yapabilir ve görüntülemeyi zorlaştırabilir.
- Tutkal katılaşana kadar bekleyin. Tutucunun kapak fişine karşı güvenli olduğunu onaylayın.
NOT: Bu makalede sunulan deneyler için cam tabanlı kapaklı P35 hücre plakaları kullanılmıştır. Diğer cam tabanlı slaytlar ve / veya plakalar, deneyin ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir.
4. Göz kürelerinin yaralanması
- Küreleri steril göz damlalıkları kullanarak boyama çözeltisinden çıkarın, ilgilenilen bölgeye doku hasarını önlemeye özen gösterin. Fazla lekeyi çıkarmak için küreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca steril fosfat tamponlu salin kullanarak yıkayın ve küreleri mikroskopa taşımak için ortama yerleştirin.
- İlgilenilen bölgede steril bir 25 G iğne kullanarak küreleri yaralayın.
- Steril bir göz damlalığı kullanarak, dünyayı gözün arkasından alın ve tutun. Bu, dünyayı sabit tutacak, yuvarlanmasını önleyecek ve tutarlı yaraların oluşmasına izin verecektir. Bu kurulumu kullanarak, optik sinir göz damlalığı nozulunun içinde olacak ve kornea dışa dönük olacaktır.
- Çizik yarası için, steril bir 25 G iğneyi açıkta kalan kornea boyunca yavaşça hareket ettirin. Delinme yarası için, iğneyi doğrudan merkezi korneaya hafifçe bastırın. Yaranın korneayı delmediğinden emin olun.
NOT: Deney için bir yara yanıtı veya yaralı ortam gerekmiyorsa bu adımı atlayın. Önceki çalışmalar, bu yöntem kullanılarak yapılan murin kornealarına hem çizik yaralarının hem de delinme yaralarının hem çap hem de derinlik10 bakımından tutarlı olduğunu göstermiştir. Bağımsız küreler arasındaki yara boyutlarının doğrulanması, bir ilgi alanı analizi kullanılarak gerçekleştirildi.
5. Tutucuya numune yerleştirme
- Kornea veya limbal bölgesi, tutucunun iç bölgesindeki örtü kapağının üzerine yerleştirin ve 3D baskılı kapağı kullanarak stabilize edin (Şekil 1C-H).
- Dünyanın doğru konumlandırıldığını ve ilgilenilen alanın cam kapak fişi ile temas halinde olduğunu onaylayın. Dünya tutucuya yerleştirildikten sonra, dünyayı çıkarmaya çalışmayın, çünkü bu doku hasarına neden olabilir.
- 3D baskılı kapağı tutkal kullanarak tutucuya yapıştırın ve stabilizasyonu sağlayın. Kapak çubuğunun küreye değil, tutucuya yapıştığından emin olun.
NOT: Protokol ters çevrilmiş bir mikroskopta kullanılmak üzere yazıldığı için görüntülenecek alan aşağıya yerleştirilir. Protokol, daha küçük bir iç yarıçapa sahip tutucular ve kapak çubuğunun çıkarılması kullanılarak dik mikroskoplar için uyarlanabilir. Bu, daha az dünya istikrarı ile sonuçlanacaktır.
6. Örnek görüntüleme
- Mikroskop ve çevre odasını açın ve odanın nemlendirildiğini doğrulayın. Deney süresince çevre odasını 35 °C ve %5 CO2'ye ayarlayın.
NOT: Dehidrasyonu önlemek ve dünyayı optimum sıcaklıklarda tutmak için bu prosedür için çevre odacıklı mikroskoplar tercih edilir, ancak gerekli değildir. - Canlı hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak kapak kaymasını, tutucuyu ve stabilize edilmiş küreyi çevre odası ve görüntüsü içindeki mikroskop sahnesine yerleştirin9.
- Dehidrasyonu önlemek ve doku canlılığını korumak için kapak kayması üzerine ilave büyüme ortamı ekleyin. Kuyuda, tutucudaki dünyayı örtmek için yeterli ortam olduğundan emin olun. Görüntüleme süresine bağlı olarak, deney boyunca gerektiğinde taze ortam ekleyin.
- Canlı hücre görüntüleme tekniklerini ve protokollerini kullanarak deneylere başlayın. Uzun süreli deneylerde dokuyu korumak ve doku hasarını önlemek için düşük güçlü lazer ayarları kullanın. Uzun çalışma mesafeleri için uygun hedefleri kullanın. Bu makaledeki deneyler 20x hedefi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Lazerin gücü ve kazancı, deneysel süre, yer ve görüntüleme düzlemi, deneysel parametrelere bağlı olarak değişkenlerdir. Süresi 1 saat ile 4 saat arasında değişen bozulmamış küreler üzerinde yapılan görüntüleme deneyleri geçmiş yayınlarda başarıyla gerçekleştirilmiştir10. - Verileri tercih edilen dosya biçiminde kaydedin ve kaydedin. Mikroskop tarafından kullanılan yazılım, veri kaydı için .czi dosyaları üretir.
- Küreleri, protokolün sonundaki standart kurumsal protokollere göre elden çıkarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol sürekli olarak yayın kalitesinde veri ve görüntü üretmek için kullanılmıştır10. Elde edilen görüntüler önceki yaklaşımlara kıyasla önemli bir iyileşmeyi temsil etmektedir (Şekil 2). 3D baskılı tutucu kullanılarak, kornea katmanları boyunca görüntüler yakalanabilir ve farklı z-düzlemlerinde kalsiyum mobilizasyonu gözlemlenebilir (Şekil 3). Bu yaklaşım, genç ve yaşlı farelerde bir yarada apikal ve bazal hücre katmanları arasındaki hücre hücresi sinyalini karşılaştırmak için kullanılmıştır10.
Geliştirilmiş stabilite, kürelerin daha önce mümkün olandan çok daha uzun süre görüntülenmesini de sağlamıştır. Bu, yara yatağına hücresel göç çalışmalarının önceki yeteneklerin ötesinde birkaç saat uzatılmasına izin vermiştir. Bu genişletilmiş zaman çizelgesi ile, kornea yaralanmasından sonra genç ve yaşlı fareler arasındaki yara iyileşme yanıtı sırasında hücresel davranışta önemli farklılıklar gözlenebilir10. Bu protokol için veriler 4 saat boyunca her 5 dakikada bir toplandı. Tutucuyu kullanırken, deney boyunca x, y veya z düzlemlerinde önemli bir sapma gözlenmedi (Şekil 4, Video 1).
Bu protokolün bir avantajı, korneanın farklı bölgelerinin, kürenin tutucuya yerleştirilmesine bağlı olarak görüntülenmesine izin vermesidir. Yakın tarihli bir yayında, bu özellikten hem merkezi korneada hem de kornea-limbal bölgede görüntü toplamak için yararlanılmıştır (Şekil 5)10. Merkezi korneada bir yaralanmanın, limbal bölge10'daki sinirlere bitişik hücrelerde kalsiyum sinyal olayları ürettiği bulunmuştur. Tutucunun çok yönlülüğü, görüntüleme deneyleri için dünyayı stabilize etmenin ötesine geçer ve birkaç farklı uygulama için kullanılmıştır. Korneanın tutucuya yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirilerek, genç ve yaşlı farelerde kornea epitelinin, bazal membranın ve stromanın sertliğini ölçmek için nanogirinti deneyleri yapıldı10,11.
Şekil 1: 3B baskılı tutucunun şematiği ve kurulumu. (A) Açıklamalı yükseklik ve genişlik boyutlarına sahip 3B baskılı tutucunun tasarımı. (B) 3D yazıcı yazılımından temsili CAD dosya görüntüsü. (C) Tutucunun, bir murin küresi içeren ekli kapakla birlikte temsili görüntüsü. (D) 3D baskılı tutucunun altına steril, tek kullanımlık yapıştırıcı uygulanır. (E) 3D baskılı tutucu, cam tabanlı bir p35 hücre kültürü kabına yapıştırılmıştır. (F) Enüklee edilmiş bir küre, steril bir göz damlalığı kullanılarak tutucuya kornea-aşağı yerleştirilir. (G) Kapak çubuğu, kürenin hareketsiz kalmasını sağlamak için 3D baskılı tutucunun üst kısmına yapıştırılmıştır. (H) Yapıştırılmış bir tutucuya ve küreye sahip cam tabanlı plaka mikroskop aşamasına yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dünyayı stabilize etmek ve çok katmanlı yapıların daha yüksek kaliteli görüntüleme verilerini elde etmek için özel 3D baskılı tutucuların kullanılması. (A) ve (B), sırasıyla 3D baskılı bir tutucu olmadan ve 3D baskılı bir tutucu ile stabilize edilmiş yaralı bir ex vivo kornea'nın tipik canlı görüntüleme verilerini temsil eder. Kalsiyum sinyal olayları (yeşil) ve hücre karşı boyası (koyu kırmızı plazma zarı boyası), korneanın apikal, bazal ve stromal katmanlarında (B) 'de açıkça tanımlanabilir, ancak (A) 'da tanımlanamaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: 3D baskılı tutucuda hareketsiz hale getirilmiş bir korneanın Z-yığını. Bir çizik yarasında kornea katmanlarından alınan bir z-yığınının temsili görüntüleri (beyaz bir yıldız işareti ile gösterilir). Numune, hücre zarlarını görselleştirmek için koyu kırmızı plazma zarı boyası ve kalsiyum sinyalini görselleştirmek için Fluo4-(yeşil) ile boyanır. (A) Yara yatağında apikal hücre tabakası, (B) apikal ve bazal hücreler, (C) bazal hücre tabakası ve (D) stroma görülebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Dünyanın x, y veya z yönlerinde çok az hareketini ortaya koyan bir korneanın temsili 4 saatlik zaman serisi deneyi. Görüntü, ex vivo murin kürenin merkezi korneasında bir çizik yara yaralanmasıdır (beyaz bir yıldız işareti ile gösterilir). Dünya, hücre zarlarını görselleştirmek için koyu kırmızı plazma zarı boyası ve kalsiyum sinyal olaylarını görselleştirmek için Fluo4-(yeşil) ile boyanmıştır. Dünya, 3D baskılı bir tutucu kullanılarak hareketsiz hale getirilmiştir. Görüntüler 1 saat arayla çekildi ve yaralanmadan 5 dakika sonra başladı. Deney boyunca bu görüntüleme kurulumu kullanılarak x, y veya z yönlerinde çok az sürüklenme gözlendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Bozulmamış bir küre üzerindeki görüntüleme konumlarının diyagramı. 3D baskılı tutucu, çeşitli yerlerde bozulmamış bir ex vivo kürenin görüntülenmesine izin verir. Tutucu, korneanın hem merkezi hem de limbal bölgelerinden görüntü toplamak için kullanıldı. Küreler, hücre zarlarını tespit etmek için koyu kırmızı plazma zarı boyası ve kalsiyum sinyalini tespit etmek için Fluo4-(yeşil) ile boyanır. (A) Çizik yarası sırasında merkezi korneanın temsili görüntüsü. (B) Merkezi korneada bir yaralanmadan sonra korneanın limbal bölgesinin temsili görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: 3D baskılı bir tutucuda 4 saat boyunca hareketsiz hale getirilmiş bir kürenin filmi. Bir küre, 3D baskılı tutucu ile hareketsiz hale getirildi ve hücre zarlarını görselleştirmek için koyu kırmızı plazma zarı boyası (kırmızı) ve kalsiyum sinyal olaylarını görselleştirmek için Fluo4-(yeşil) ile boyandı. Yaralanmadan 5 dakika sonra başlayarak 4 saat boyunca her 5 dakikada bir görüntü çekildi. Deney boyunca bu görüntüleme kurulumu kullanılarak x, y veya z yönlerinde çok az sürüklenme gözlendi. Oynatma hızı saniyede 30 karedir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, bozulmamış hayvan gözlerini stabilize etmek ve hareketsiz hale getirmek için 3D baskılı bir tutucu kullanan canlı bir hücre görüntüleme tekniğini tanımlar. Ex vivo kornea dokusunun önceki canlı hücre görüntüleme protokolleri ile tanınan birkaç önemli dezavantajı atlatmak için tasarlanmıştır. Bu protokol, bozulmamış kürelerin canlı hücre görüntülemesi için birçok avantaj sunar. Deneysel olarak indüklenen çizik yaralarına yara iyileşmesi tepkisine müdahale edebilecek gereksiz doku hasarını önemli ölçüde azaltır. Bu, diseksiyondan ve UV ışığına maruz kalmaktan kaynaklanan sinirlere ve epitele verilen hasarı içerir. Ayrıca, bu protokol, dokuyu deneylerin bozulmasına gerek kalmadan periyodik olarak büyüme ortamının uygulanmasına izin verecek şekilde hareketsiz hale getirerek doku hidrasyonunu ve canlılığını kolaylaştırır. Gözün tutucudaki yönünü değiştirerek, protokol dünyadaki farklı bölgelerin görüntülenmesini sağlar. Bu protokolle birlikte konfokal mikroskopinin kullanılması, dünyanın farklı düzlemlerinin görüntülenmesine izin vererek doku yapıları arasındaki etkileşimlerin gözlemlenmesine izin verir. Protokol çok yönlüdür ve farelerden ve diğer türlerden çeşitli boyutlardaki kürelere uyarlanabilir. Tutucular ve kapaklar görüntüleme kuyularından kolayca çıkarılabilir, sterilize edilebilir ve yeniden kullanılabilir. 3D baskı protokolü verimli ve zaman etkilidir, aynı anda birçok tutucunun uygun şekilde oluşturulmasını sağlar. Küreler, numunelerin daha sonraki bir tarihte tekrar saklanması ve görüntülenmesi gerekiyorsa, tutucular içinde sabitlenebilir. Sabit doku, derin kırmızı plazma zar boyasını ve Fluo4-lekelerini fiksasyondan sonraki birkaç hafta boyunca tutar, bu da belirli bir protein (ler) için boyama yaparken belirteçler olarak kullanılabilir.
Önceki protokoller, gözün diseksiyonunu ve daha sonra 7,8,9'u görüntülemek için korneayı hareketsiz hale getirmek için UV ile aktive edilmiş bir PEG jelinin kullanılmasını gerektiriyordu. Bu tekniklerle dokuya verilen hasar, deneysel sonuçları karıştırabilir. Bu, yara iyileşmesinde yer alan hücresel ve doku süreçlerini incelerken dikkate alınması özellikle önemlidir, çünkü deneysel olarak uygulanan yaraların ötesindeki bu ek hasar, yara iyileşme yanıtını değiştirebilir 4,12. Duyusal kornea sinirlerinin girişi önceki protokolden etkilenecektir, çünkü diseksiyon işlemi sinirleri trigeminal ganglion13'teki hücre gövdelerinden koparır. Ayrıca, korneanın diseksiyonu kendisi bir yaralanma yanıtına neden olur, çünkü bir yaralanmadan salınan çözünür faktörler yara iyileşme yanıtından sorumludur4. Bu yeni prosedür, küreleri bozulmadan görüntüleyerek bu zayıflıkları ele almaktadır. Bu metodolojiyi kullanarak, göze verilen hasar, enükleasyon üzerine optik sinirin kesilmesiyle sınırlıdır ve kornea içindeki hücre canlılığını uzun süre korur. Birlikte, bu iyileştirmeler yara yanıtının daha iyi bir simülasyonunu oluşturur.
İmmobilizasyon, canlı doku ile çalışırken önemli ama zorlu bir adımdır, çünkü deney boyunca canlı ve hidratlı kalması gerekir. Kornea ve küreler UV kaynaklı PEG jeli ile sabitlenebilirken, prosedür dokuyu tutucu8'e yerleştirdikten sonra UV ışınlaması gerektirir. PEG'i polimerize etmek için gereken ışınlamanın hücresel duyarlılığı azalttığı gözlendi. Ayrıca, PEG görüntülerin çözünürlüğünü düşürdü ve hücre sinyalini gözlemlemek için AiryScan işlevi gerekliydi. Bu yeni protokolde, tutucunun boyutları kürelere tam olarak uyacak şekilde optimize edilmiştir ve kapak çubuğu ek bir hareketsizlik katmanı sağlar. Tutucu ve kapak çubuğu, yara iyileşme sürecinin gerçek zamanlı görüntüleriyle daha yüksek kaliteli, daha yüksek çözünürlüklü görüntüler üreten PEG kullanma ihtiyacını ortadan kaldırır. Yukarıda belirtilen sorunlara bir çözüm, canlı hücre görüntülemeden tamamen vazgeçmek ve yaralanmadan sonra önceden belirlenmiş zamanlarda paraformaldehitteki küreleri (% 4) sabitlemek olacaktır. Ancak sabit doku ile kalsiyum sinyalizasyonu gibi devam eden hücresel süreçler ve bu süreçlerin dokudaki fiziksel değişiklikler üzerindeki etkileri gözlenemez. Kornea epitelindeki hücreler arasındaki iletişim olaylarını kaydetmek ve ölçmek isteyen gruplar için, doku fiksasyonunun getirdiği sınırlar bu tekniği bu amaçlar için pratik hale getirmez.
Bu yeni protokolün iki temel adımı vardır: (1) ötenazi ve acil dünya enükleasyonu ve (2) dünyanın tutucu içinde konumlandırılması ve yönlendirilmesi. Optik sinirin kesilmesi ve yerkürenin enükleasyonu, iç ve dış yapıları korumak için bir ayraç yerleştirmeden gözün desteklenmesiyle dikkatlice yapılmalıdır. Konumlandırma ve yönlendirme, ilgilenilen alanların görüntülenmesi ve mümkün olan en geniş görüş alanının yeterli ayrıntıyla odaklanmasını sağlamak için gereklidir. Kapak çubuğunu tutucuya uygulamadan önce kürenin doğru yerleştirilmesi gerekir.
Protokolün çeşitli değişkenleri, deneysel parametrelerin gereksinimlerine bağlı olarak ayarlanabilir. Tutucular, farklı hacimlerdeki küreleri barındırmak için farklı boyutlarda basılabilir. Tutucu çapı ve kürenin boyutuna göre yüksekliği ile ilgili parametreler, boyut aralıkları arasında aynı kalır. Kullanıcı z-düzleminde sürüklenme yaşarsa, potansiyel neden dokunun hareketsiz hale getirilmemesi ve tutucunun yeniden üretilmesi olabilir. Bozulmamış kürelerin boyanması, deneysel parametrelere, kullanılan lekelere ve ilgili doku için en uygun ortam ve konsantrasyonlara bağlı olarak ayarlanabilir. Deney süresi, doku canlılığı korunduğu sürece ayarlanabilir. Dokunun 1 saat sürekli görüntülenmesini içeren kısa süreli deneyler ve 4 saat boyunca düzenli aralıklarla dokunun görüntülenmesini içeren uzun süreli deneylerin her ikisi de başarıyla gerçekleştirilmiştir. Bu deneyler ters çevrilmiş bir mikroskop üzerinde gerçekleştirildi ve bu protokol benzer bir görüntüleme kurulumuyla optimum kullanım için tasarlandı. Dünya stabilize edildikten ve tutucu içinde konumlandırıldıktan sonra, kürenin çıkarılması doku hasarına neden olabilir; Bu nedenle, kapak çubuğunu takmadan önce dünyanın en uygun şekilde konumlandırılması ve yönlendirilmesi esastır. Küreler, protein lokalizasyonunun daha ileri analizi için hala tutucuların içindeyken % 4 paraformaldehit içinde sabitlenebilir. Ön veriler, koyu kırmızı plazma membran boyasının ve Fluo4-boyamasının her ikisinin de fiksasyon işlemi boyunca tutulduğunu göstermiştir.
Bu protokolün önceki protokollere göre birçok avantajı olmasına rağmen, bu deneysel yaklaşımın birkaç sınırlaması vardır. Bir dezavantajı, kornea epiteline zarar vermeden küreyi tutucudan çıkarmanın zor olmasıdır. Bu nedenle, küre daha sonraki bir tarihte protein veya RNA lokalizasyon yöntemleri kullanılarak yeniden görüntüleme için tutucuya sabitlenmelidir. Bu, takip çalışmalarını sınırlayabilir. Uzun süreli görüntüleme protokolleri sırasında bu protokolün bir diğer dezavantajı, hidrasyonun sürdürülmesi gerektiğidir. Medyayı düzenli aralıklarla manuel olarak yeniden uygulama ihtiyacı, birisinin deneyin kapsamı için görüntüleme işlemini aktif olarak izlemesini gerektirir. Bu, genişletilmiş görüntüleme protokolleri için lojistik olarak zor olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklanacak çıkar çatışmamız yok.
Acknowledgments
NIH'ye aşağıdaki hibe desteği için teşekkür ederiz: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) ve 5T32GM008541-24 (KS). Ayrıca Massachusetts Lions Göz Araştırma Fonu ve New England Kornea Nakli Fonu'na da teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
