Estabelecendo um Modelo de Lesão da Medula Espinhal por Contusão de Camundongo Baseado em uma Técnica Minimamente Invasiva

Summary

Técnicas minimamente invasivas e um simples dispositivo laboratorial melhoram a reprodutibilidade do modelo de lesão medular, reduzindo os danos operatórios aos animais experimentais e permitindo a manutenção da morfologia anatômica. O método vale a pena porque os resultados confiáveis e o procedimento reprodutível facilitam as investigações dos mecanismos de reparação da doença.

Abstract

O uso de métodos minimamente invasivos para modelar a lesão medular (LME) pode minimizar as diferenças comportamentais e histológicas entre animais experimentais, melhorando assim a reprodutibilidade dos experimentos.

Esses métodos precisam de dois requisitos a serem cumpridos: clareza da via anatômica cirúrgica e simplicidade e conveniência do dispositivo laboratorial. Crucialmente para o operador, uma via anatômica clara proporciona uma exposição minimamente invasiva, o que evita danos adicionais ao animal experimental durante os procedimentos cirúrgicos e permite que o animal mantenha uma morfologia anatômica consistente e estável durante o experimento.

Neste estudo, o uso de uma nova plataforma integrada chamada plataforma coaxial SCI para lesão medular em pequenos animais para expor a medula espinhal em nível T9 de forma minimamente invasiva e estabilizar e imobilizar a vértebra de camundongos usando um estabilizador vertebral e, finalmente, um impactor de gravidade coaxial é usado para contornar a medula espinhal de camundongos para se aproximar de diferentes graus de lesão medular T9. Finalmente, os resultados histológicos são fornecidos como referência para os leitores.

Introduction

A lesão medular traumática (LM) predispõe facilmente o indivíduo a consequências graves¹; no entanto, não há tratamento efetivo no momento ^1,2. Os modelos de contusão animal são um dos principais métodos para estudar a LM ^3,4.

De 2004 a 2014⁴, ratos foram utilizados como organismos modelo em 289 dos 407 estudos (71%) e camundongos em 69 (16,9%). De fato, a proporção de experimentos com camundongos tem aumentado gradativamente ao longo dos anos devido às suas vantagens em relação a outros modelos, especialmente o grande potencial para estudos de regulação gênica ^3,4,5. Portanto, ferramentas mais compatíveis são necessárias para a realização de mais estudos utilizando o rato como modelo, devido à grande importância atribuída à consistência do modelo⁶. Os dispositivos comuns relatados em estudos anteriores baseiam-se basicamente no princípio de impacto da medula espinhal de Allen, por exemplo, o impactor básico de queda de peso ^7,8, o impactor ^1,9 da New York University (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) e o impactor Infinite Horizon (IH)^10,11 . O impactor de queda de peso e o impactor NYU/MASCIS compartilham o mesmo princípio de visar a medula espinhal alvo e soltar um peso fixo de diferentes alturas para fazer diferentes gravidades de lesão. O impactador IH cria a lesão medular de acordo com diferentes forças.

Por conveniência no uso do modelo de camundongo em estudos de LM e para estabelecer a base para métodos de tratamento eficazes, uma plataforma integrada de lesão por impacto na medula espinhal do camundongo, chamada de plataforma coaxial de lesão medular (SCICP), é desenvolvida. A plataforma é composta por quatro componentes principais: (1) uma mesa de operação animal projetada para uma posição adequada para ratos operados, que é muito compacta e oferece conveniência sem restrição de posição; (2) um micro-afastador em ambos os lados para segurar os músculos paravertebrais durante a operação; (3) um estabilizador vertebral para segurar a vértebra antes do procedimento de SCI (dois estabilizadores vertebrais estão disponíveis para operação em animais maiores, como ratos); (4) uma manga, uma ponta do pêntus, pesos e um pino de tração. As três partes devem ser montadas em um braço X-Y-Z removível. Para uma segmentação precisa, uma ponta do impactador é colocada na superfície da medula espinhal, e o braço X-Y-Z é suavemente descido até a altura esperada com a ajuda da marca entre a ponta do impactador e a manga. A ponta do impactor é feita de uma liga de alumínio de 0,12 g para evitar danos à medula espinhal atribuídos à grande compressão de peso antes do procedimento. O pino de tração é para segurar os pesos na parte superior da manga para preparar a queda de peso (Figura 1).

Em estudos anteriores, a divisão da força de impacto foi definida de acordo com os dados da força de impacto do dispositivo IH, que são 30 Kdyn, 50 Kdyn e 70 Kdyn, respectivamente ^6,10. Durante o processo de pesquisa, os graus seriados dos modelos de LM foram comprovados para serem estabelecidos com base no SCICP, que pode ser usado em vários estudos. Portanto, antes de iniciar oficialmente o experimento, as forças de impacto geradas por vários pesos de diferentes massas foram testadas usando um dispositivo de teste de pico de pressão. Como resultado, três modelos padronizados representativos de camundongos com LM foram selecionados como três graus diferentes de lesão, incluindo grupos graduados, leves, moderados e graves, respectivamente ^6,10, e os pesos foram liberados na mesma altura, com peso de 1,3 g para dano leve, 2,0 g para moderado e ^2,7 g para dano grave.

Como outro meio de garantir a operacionalidade e a precisão, uma abordagem operatória nova e minimamente invasiva é relatada. Através da pesquisa da anatomia de camundongos normais, um novo método para localizar o espaço interespinhoso de T12-T13 é encontrado. O método de localização da vértebra nas etapas de operação é fácil de dominar e preciso, o que garante uma localização precisa para operações minimamente invasivas.

Esperançosamente, esta técnica de lesão por contusão pode ajudar a pesquisa e a compreensão da lesão da medula espinhal, incluindo a compreensão da fisiopatologia, a avaliação do manejo e assim por diante.

Protocol

NOTA: Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar de Animais de Laboratório da Faculdade de Medicina Cheeloo da Universidade de Shandong (número de aprovação: 21L60) e foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH Publications No. 85-23, revisado em 1996).

1. Mecanismo da plataforma coaxial da lesão medular e ensaios mecânicos

1. Montar a plataforma com uma mesa cirúrgica, um estabilizador vertebral e uma ponta impactadora (Figura 1).
   NOTA: Mantenha as ranhuras de queda de peso e de escape, que impedem que o peso encontre correntes de ar, limpas, porque qualquer sujidade na queda de peso ou na manga pode afetar a precisão da plataforma.
2. Coloque a ponta, que permite a localização precisa da medula espinhal, na manga.
3. Selecione as massas adequadas das gotas de peso para o experimento, que são 1,3 g, 2,0 g e 2,7 g para os grupos leve, moderado e grave, respectivamente.
4. Conecte o pino de tração nos orifícios da queda de peso.
5. Monte a queda de peso na parte superior da manga com o pino de tração encaixado no sulco no braço X-Y-Z para que, uma vez que a localização esteja completa, o peso seja liberado para atingir a ponta do impactor, consequentemente contornando a medula espinhal, e as alterações na medula espinhal sejam observadas ao microscópio.
6. Ajuste o braço X-Y-Z de precisão removível de 0,1 mm para a conveniência do operador para fornecer espaço de trabalho adequado (Figura 1D, E).
   NOTA: Para confirmar a consistência dos resultados do estudo, antes do início do experimento, meça a força gerada quando o peso é derrubado dentro da manga usando um dispositivo de detecção de pressão de pico. Uma repetição da confirmação não é necessária para estudos futuros.
7. Ligue o dispositivo, coloque o receptor de pressão de metal abaixo da ponta, zere o adaptador, solte o pino de tração e registre a força de impacto real.

2. Localização e laminectomia da^9ª vértebra torácica (T9)

NOTA: Fêmeas de camundongos C57BL / 6J de 9-10 semanas de idade foram comprados da Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, China).

1. Autoclave um conjunto de instrumentos cirúrgicos para o experimento e esterilize a mesa de operação com álcool a 75% antes da cirurgia.
2. Injete buprenorfina para analgesia (0,05-2,0 mg/kg, SQ) 30 minutos antes da anestesia para operações de lesão. Em seguida, anestesiar o rato com isoflurano (indução: ~3%-5%, manutenção: ~1,5%-2%). Verifique se o animal está totalmente anestesiado pelos reflexos da cauda ou do beliscão do dedo do pé. Uma vez que a anestesia esteja em vigor, coloque o rato em posição prona em uma parte designada da mesa de operação e cubra a córnea com pomada oftálmica (aplique pomada oftálmica nas córneas para proteger os olhos da secagem durante a cirurgia).
   1. Raspe o cabelo do caudal para o rostral com um barbeador elétrico sobre a coluna toracolombar. Esterilize a pele várias vezes em um movimento circular com iodóforo por 30 s e seguido de álcool a 75%. Aplique uma cortina cirúrgica estéril e faça uma incisão longitudinal de aproximadamente 1,5 cm na pele de aproximadamente T6 a T13 com bisturi e lâmina.
      NOTA: Apalpar ao longo da margem costal até a linha média, onde o espaço interespinhoso T12-T13 está localizado. Faça uma incisão de 1,5 cm no rostral, e a incisão é aproximadamente nivelada com vértebras T6-T13.
3. Explore a 13ª costela de um lado da porção óssea sob o microscópio cirúrgico. Explore o processo espinhoso na linha média tocando levemente a área do ângulo costovertebral e, em seguida, em direção ao rostral para localizar o espaço interespinhoso do T12-T13. Explore o espaço interespinhoso do T9-T10 do espaço do T12-T13 até o lado rostral. (Figura 2A, 3A)
4. Dissecar o músculo paraespinhal ao longo do processo espinhoso do T9 para as facetas anterior e posterior de ambos os lados com micro tesoura (Figura 3B). Retraia os músculos paraespinhais com micro-afastadores e limpe os tecidos moles na lâmina e no espaço interespinhoso do T8-T9 e T9-T10 com micro tesouras.
5. Realizar laminectomia T9, prender o processo espinhoso de T9 com pinça de microcirurgia, levantá-lo levemente, inserir a microtesoura paralelamente ao longo do lado dorsolateral direito da lâmina, evitando danos à medula espinhal, e cortar a lâmina com micro tesoura. Repita no lado esquerdo, e a medula espinhal pode ser exposta (Figura 2B, 3C).
6. Antes de fixar a vértebra, solte o braço universal e aperte lentamente as articulações da 9ª à 10ª faceta em ambos os lados da vértebra com a micropinça do mosquito do estabilizador vertebral. Aperte os parafusos na pinça do micro mosquito e a vértebra é estabilizada. Ajuste a medula espinhal ao plano horizontal, aperte o braço universal e a vértebra fique fixa (Figura 3D).

3. Lesão por contusão T9

1. Uma vez exposta a medula espinhal em nível T9 e fixada a vértebra, aponte para a medula espinhal pela ponta dentro da manga sob o microscópica operacional (Figura 3E).
2. Verifique se a superfície da ponta é paralela à medula espinhal a partir dos aspectos posterior e lateral da medula espinhal, uma vez que é fácil observar a relação entre a medula espinhal e a ponta sob o microscópio, e que a mesa de operação pode ser girada facilmente.
3. Verifique se a superfície da ponta está paralela às bordas bilaterais da lâmina poupada antes que a ponta esteja em contato com a medula espinhal após a laminectomia, uma vez que é um plano de referência natural paralelo à medula espinhal.
4. Depois de localizar o espaço interespinhoso do T12-T13, abaixe a manga até que a extremidade do pêndulo seja consistente com a marca na janela de observação e a altura especificada de 22 mm seja atingida. Puxe o pino de tração para liberar o peso (1,3 g, 2,0 g ou 2,7 g de acordo com o grupo, com cada grupo incluindo 3 camundongos e cada grupo tendo um rato para cada ponto de tempo).
   NOTA: A medula espinhal deve ser paralela ao solo e perpendicular à ponta; mova a mesa de operação para garantir o campo visual microscópico, uma vez que a mesa é muito compacta.
5. Remova o pêndulo quando a contusão for feita e observe o grau de LM sob o microscópio cirúrgico. No grupo leve, uma alteração de cor vermelha clara pode ser observada, enquanto no grupo moderado, o local da lesão exibe vermelho escuro em 3-4 s e, possivelmente, eminência pode ser observada. No grupo grave, as manifestações vermelhas escuras podem aparecer imediatamente, e a eminência óbvia na dura-máter se manifesta, mas a dura-máter ainda está em uma forma consistente (Figura 3F).
6. Suture a fáscia superficial e a pele com suturas (sutura não absorvível de polipropileno, tamanho: 6-0).
7. Depois de completar a sutura, esterilize a área cirúrgica, coloque o rato numa almofada com temperatura controlada até que a plena consciência seja restaurada e, em seguida, coloque o rato nas gaiolas do rato.

4. Cuidados com os animais

1. Coloque o animal na almofada de aquecimento para recuperação e observe o movimento de ambos os membros posteriores.
   NOTA: Os animais que foram submetidos a cirurgia não devem ser devolvidos à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.
2. Coloque uma dieta rica em água no chão da gaiola para que os animais possam alcançar facilmente a comida. Alternativamente, use uma gaiola com uma mesa de alimentação mais baixa.
3. Esvazie as bexigas dos ratos duas vezes por dia após a operação, porque é difícil para os grupos de lesões moderadas e graves recuperarem a função da bexiga. Injete buprenorfina para analgesia (0,05-2,0 mg/kg, SQ) 8-12 h/dia durante 3 dias.

5. Perfusão, coloração e imunocoloração transcárdica

1. No 1º, 28º e 56º dias após a lesão, sacrificar um rato de cada grupo, respectivamente, por perfusão.
   1. Perfundir os camundongos com 60 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 20 mL de paraformaldeído a 4% após anestesia excessiva (isoflurano a 4%-6%).
   2. Coletar a coluna vertebral com micro tesoura, estendendo-se rostral e caudalmente 1 cm, respectivamente, a partir do centro da lesão.
   3. Ressecar o excesso de músculos, reservar segmentos da coluna intactos com costelas parciais para que os instrumentos segurem no passo 5.1.4 e mergulhá-lo em paraformaldeído a 4% por 24 h.
   4. Aperte as costelas com pinça hemostática para fixação e defina o centro da lesão ao microscópio de acordo com a lâmina ressecada e alteração de cor no centro da lesão da medula espinhal.
   5. Ressece todas as lâminas e processos articulares com micro tesouras da caudal.
   6. Corte as raízes nervosas com micro tesoura e retire a medula espinhal.
   7. Coletar 0,5 cm da medula espinhal estendendo-se caudal e rostralmente, respectivamente, do centro da lesão com micro tesoura.
   8. Coloque a medula espinhal em sacarose a 30% a 4 °C por 48 h.
2. Cortar os tecidos em cortes de 6 μm de espessura após o congelamento de acordo com o tipo de exame histológico.
3. Realizar coloração de hematoxilina e eosina (H & E).
   1. Reaqueça as seções à temperatura ambiente e mergulhe as seções de 6 μm de espessura em formaldeído a 4% por aproximadamente 15 min, seguido de imersão em 1x PBS por 1 min quatro vezes para remover OCT residual.
   2. Escorra as seções com hematoxilina por 90 s e enxágue com água duplamente destilada.
   3. Em seguida, lave as seções com água corrente por 3 min.
   4. Escorra com eosina por 4 min e mergulhe em álcool a 95% por 30 s duas vezes para enxaguar o excesso de eosina.
   5. Finalmente, desidrate com álcool gradiente (álcool a 95% e álcool a 50% uma vez, sucessivamente) por 30 s e mergulhe em xileno para transparência por 2 min. Em seguida, sele os corpos de prova com gel de resina (seção do plano coronal: Figura 4; seção do plano sagital: Figura 5).
4. Realizar coloração imunofluorescente.
   1. Reaqueça as seções à temperatura ambiente e mergulhe as seções de 6 μm de espessura em formaldeído a 4% por aproximadamente 2 min.
   2. Lave as seções em TBST por 5 min por três vezes.
   3. Incubar os cortes com solução bloqueadora (soro normal de cabra a 10% em PBS) e bloquear por 1 h para bloquear a ligação inespecífica da imunoglobulina.
   4. Incubar as secções da espinal medula durante a noite a 4 °C com proteína ácida fibrilar anti-glia de rato (GFAP, um marcador para astrócitos reactivos), anticorpo policlonal (1:600) e anticorpo anti-NF200 de coelho (1:2000), um marcador de neurofilamento em 0,4 ml de solução bloqueadora.
   5. Enxaguar as seções com PBS e adicionar 0,4 mL de solução bloqueadora com anticorpos secundários IgG conjugada Alexa 594 (1:1.000) anti-camundongo de cabra (1:1.000) e IgG conjugada Alexa 488 (1:1.000) anti-camundongo por 1 h à temperatura ambiente.
   6. Tire imagens com um microscópio fluorescente a 10x por varredura panorâmica automática em comprimentos de onda de 594 nm e 488 nm, respectivamente (Figura 6).
      1. Ligue o microscópio de fluorescência, coloque a lâmina no estágio do microscópio, mude para o canal de fluorescência, use a tecla de posicionamento para posicionar de três a quatro pontos no tecido e concentre-se para concluir a filmagem. Depois de terminar a filmagem, salve as imagens de diferentes canais no formato desejado e, em seguida, salve a imagem mesclada.

Representative Results

Para testar a precisão do dispositivo, a força que três massas diferentes de pesos fizeram a partir da mesma altura foi medida usando um dispositivo de teste de pressão de pico. Vinte e quatro testes foram realizados com diferentes grupos de pesos, resultando em (média ± DP) 0,323 N ± 0,02 N para pesos de 1,3 g, 0,543 N ± 0,15 N para pesos de 2,0 g e 0,723 N ± 0,26 N para pesos de 2,7g (Figura 7). Estudos anteriores adotaram dyne (dyn) ou Kilodyne (Kdyn) como unidades para medir as intensidades de contusão. Para melhor comparação com estudos anteriores, as conversões entre Newtons (N) e dyne/Kilodyne estão listadas (1 N = 1 kg × 1 m/s 2 = 1 × 10 3 g × 1 × 100 cm/s² = 1 × 10⁵ dyn; 0,323 N = 32,3 Kdyn; 0,543 N = 54,3 Kdyn; 0,723 N = 72,3 Kdyn).

A Tabela 1 e a Figura 4 mostram os dados das lesões dos grupos leve, moderado e grave em cortes coronais. A julgar pela Figura 4, no 28º dia pós-lesão, a continuidade dos limites distinguíveis da substância cinzenta e branca nos grupos leve, moderado e grave diminuiu sucessivamente, com a área do tecido cicatricial crescendo e uma proporção crescente na seção transversal do centro da lesão. Houve diferenças morfológicas óbvias em todos os grupos experimentais em comparação com o grupo normal. Isso comprovou a racionalidade da divisão dos graus de lesão nos grupos experimentais.

A Tabela 2 e a Figura 5 descrevem a lesão medular no 1º e 56º dias pós-lesão em cortes sagitais. Pode-se observar que a área da lesão aumentou significativamente dos grupos leve para grave no 1º dia pós-lesão. Enquanto isso, a continuidade da substância branca em ambos os lados da medula espinhal foi melhor no grupo leve, com pequenos vacúolos redondos observáveis, que são as características do edema intersticial. No grupo moderado, a substância branca apresentou baixa continuidade, e a estrutura da substância branca ventral não foi ordenada. No grupo grave, a substância branca ventral exibiu ruptura mais grave, e uma grande área da cavidade apareceu no centro da lesão. Além disso, o tecido circundante mostrou preenchimento óbvio dos glóbulos vermelhos, e os glóbulos vermelhos perto do canal central se reuniram em tiras. No 56º dia após a lesão, observou-se formação cicatricial no centro de lesão dos três grupos, cuja área aumentou de acordo com a gravidade da lesão.

A integridade do neurofilamento medular no 56º dia pós-lesão também pode ser derivada da análise dos resultados da coloração por imunofluorescência (Figura 6). A figura também mostra que astrócitos formadores de cicatrizes sobrepostos foram visíveis no centro de todos os três grupos de lesões, com o comprimento da área da lesão aumentando com a gravidade da lesão, enquanto o diâmetro da cicatriz diminuiu. Isso sugere a presença de contratura cicatricial, o que pode levar a uma diminuição no diâmetro da medula espinhal.

Figura 1: Uma exposição total e parcial da plataforma coaxial da lesão medular . (A) O braço X-Y-Z e a mesa de operação podem ser separados, o que deixa espaço adequado para o procedimento de operação durante o qual a medula espinhal de um pequeno animal é exposta. A mesa de operação pode ser movida livremente durante a operação, reduzindo a dificuldade operacional potencial atribuída a limitações de posição. O corpo do estabilizador vertebral tem um braço universal de três articulações para assistência de direção, o que aumenta sua flexibilidade. (B) Coloque a ponta do pêndulo na manga e monte esta última no braço X-Y-Z. Coloque a ponta do pino de tração nos orifícios do peso para evitar que o peso caia e coloque o peso na manga. Com as peças montadas, localize a área de lesão alvo sob o microscópio. Em seguida, abaixe o braço X-Y-Z até que o final da ponta do pêndulo seja consistente com o nível inferior da janela de observação, o que indica que uma altura de contusão unificada foi atingida (a altura entre o peso e a ponta do pêndulo é de 22 mm quando a queda começa). Puxe o pino de tração e o impacto será feito. (C) Depois que a área da lesão estiver exposta, use os clipes para prender e fixar a coluna vertebral do rato e o parafuso de aperto para estabilizar o estabilizador vertebral. (D) Funções recomendadas para ranhuras na mesa de operação. O animal experimental deve ser colocado no sulco médio, com a cabeça em direção à parte torácica anterior na encosta. O braço X-Y-Z é separado da mesa de operação. (E) Um visor do SCICP montado. As setas indicam as partes. Com a ponta apontando para a área de contusão alvo, para iniciar a contusão, puxe o pino de tração e o peso cairá sobre a ponta do impactador para contudir a medula espinhal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Um gráfico de imagem do método de localização da vértebra costovertebral T13. (A) A 13ª costela e T13 são estruturas anatômicas relativamente constantes. O ângulo costovertebral T13 pode ser facilmente detectado sob o microscópio, a partir do qual o operador pode sondar em direção ao processo espinhoso e encontrar o espaço interespinhoso T12-T13. Em seguida, sonde em direção ao lado rostral sucessivamente para encontrar a vértebra alvo da lesão (por exemplo, T9). (B) Uma 9ª laminectomia torácica minimamente invasiva pode preservar as articulações lâminas e facetas adequadas entre os corpos vertebrais adjacentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Exposição e contusão da medula espinhal nível T9 em camundongos . (A) Sonda o ângulo costovertebral T13. (B) Com o músculo paraespinhal retraído por micro-afastadores para criar espaço adequado para operação, exponha o T9. (C) Realizar laminectomia T9 com microtesoura. (D) Estabilizar a vértebra com os clipes do estabilizador vertebral. (E) Apontar para a área de contusão alvo com a ponta do impactador. (F) Edema e congestão são observados na área da lesão após a contusão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Cortes representativos no 28º dia após diferentes graus de LM em camundongos (cortes coronais). (A) Medula espinhal torácica normal do camundongo. Barra de escala = 500 μm. (B) Para o grupo leve, uma lesão leve pode ser observada no aspecto dorsal da medula espinhal, enquanto a morfologia da substância branca e da substância cinzenta poupadas é substancialmente preservada. (C) Para o grupo moderado, o tecido cicatricial óbvio é observado na medula espinhal (indicado pelo asterisco vermelho). As características diferenciais entre a substância branca e a massa cinzenta mal podem ser distinguidas. (D) Comparativamente, a medula espinhal do grupo grave quase perdeu sua morfologia original e quase foi substituída por tecido cicatricial. A linha tracejada verde indica a área de dano, e a linha tracejada preta indica o limite da massa cinzenta observável. À medida que a gravidade da lesão aumentava, uma lesão maior e uma estrutura menos poupada apareciam na medula espinhal do rato, com a borda da massa cinzenta quase indistinguível. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Cortes representativos no 1º e 56º dias após lesão da medula espinhal de camundongos (cortes sagitais). (A) Medula espinhal torácica normal do camundongo. (B) B1-B3 representam, respectivamente, a medula espinhal no 1º dia após a lesão nos grupos leve, moderado e grave. Pode-se observar que, à medida que o dano aumentava, uma área maior era interrompida ou liquefeita no centro da lesão. A continuidade da substância branca na medula espinhal ventral diferiu devido a diferentes intensidades de lesão. B1 mostra que a substância branca na medula espinhal ventral tem melhor continuidade com leve edema. B2 mostra pior continuidade da substância branca na medula espinhal ventral e edema mais grave. O tecido no centro da LM B3 perdeu quase toda a continuidade, e há edema extenso na área fora do centro da lesão. (C) C1-C3 representam, respectivamente, a medula espinhal no 56º dia após a lesão nos grupos leve, moderado e grave. Diferentes graus de contratura cicatricial se manifestaram no centro da lesão entre os diferentes grupos, e houve diferença significativa no diâmetro da área da lesão. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Cortes representativos no 56º dia após lesão da medula espinhal em camundongos (cortes sagitais). (A) Seção representativa do grupo leve. NF200 indica o neurofilamento, enquanto GFAP indica astrócitos. Astrócitos sobrepostos são observados no epicentro da lesão, enquanto o neurofilamento na parte ventral da medula espinhal está em boa continuidade. (B) Secção representativa do grupo moderado. Dois centros cicatriciais podem ser observados (indicados por asteriscos vermelhos), além de astrócitos sobrepostos, enquanto o neurofilamento no aspecto ventral tem continuidade. (C) Seção representativa do grupo grave, com uma grande faixa de lesões e astrócitos maciços formadores de cicatrizes. Não há nenhum centro cicatricial óbvio observado, e o neurofilamento tem pouca continuidade. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Força gerada a partir da mesma altura, mas com pesos diferentes. Antes do experimento, a força gerada por diferentes massas de pesos liberadas da mesma altura foi detectada usando um dispositivo de detecção de pressão de pico. Depois que cada grupo completou 24 detecções, dados de gravidade mais confiáveis foram obtidos para a referência da força de ataque. Os dados foram analisados utilizando-se o software estatístico SPSS19.0. Os dados são apresentados como média ± DP, n = 24 em cada grupo. As comparações entre mais grupos foram baseadas em uma análise de variância unidirecional (ANOVA) usada para testar as diferenças; p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

28 dpi
Grupo	GMR (%)	WMR (%)	DR (%)
Normal	35.44	64.57	0
Moderada	11.59	64.88	23.53
Moderado	0	41.14	58.86
Grave	0	0	100

Tabela 1: Taxa de substância branca, massa cinzenta e danos no 28º dia pós-lesão. Abreviaturas: dpi = dias pós-lesão, DA = área danificada; GMR = taxa de massa cinzenta; WMR = taxa de substância branca; DR = taxa de danos.

Grupo	1dpi DA (μm2)	56dpi DA (μm2)
Normal	0	0
Moderada	2391250	666091
Moderado	4383381	1263191
Grave	5118833	1943962

Tabela 2: Comparações entre a lesão em cortes sagitais no 1º e 56º dias pós-lesão.

Discussion

Por meio do procedimento padronizado, dados estáveis podem ser obtidos, principalmente em experimentos in vivo com animais de pequeno porte, o que pode minimizar o desvio de resultados causado por diferenças individuais entre os animais. Com base nas condições acima e nos instrumentos de aplicação convenientes, modelos SCI padronizados, minimamente invasivos, precisos e repetíveis podem ser estabelecidos.

Devido à sua praticabilidade e conveniência, anteriormente, o impactor de queda de peso era usado principalmente³. O impactor introduzido neste estudo compartilha o mesmo princípio com o modelo¹² de Allen. Felizmente, devido às vantagens de fabricação precisas da moderna tecnologia de usinagem, a equipe de pesquisa projetou um impactor de queda de peso com os benefícios de ser fácil de operar, fortemente estável e raramente impreciso. Um dispositivo de detecção de pressão de pico foi usado para medir a gravidade de diferentes pesos. Estudos anteriores^6,10 sobre o impactador Infinite Horizons relataram que uma faixa de força de ±5 Kdyn desviando-se da força pretendida é aceita nos grupos 30 Kdyn, 50 Kdyn e ⁷⁰ Kdyn^, o que fornece uma referência para o presente estudo em termos de divisão de grupos e seleção de grau de contusão. Na presente pesquisa, a possível força dos diferentes grupos foi medida com antecedência, e dados mais precisos foram obtidos.

Mais crítico do que o dispositivo em experimentos de modelos animais é a compreensão e utilização da anatomia do rato. Fazer bom uso da anatomia pode tornar os procedimentos minimamente invasivos. A cirurgia minimamente invasiva afeta diretamente a estabilidade do estado funcional do animal experimental e a consistência da recuperação subsequente do camundongo. Estudos prévios mostraram que o estabelecimento minimamente invasivo de modelos de LM aumenta a estabilidade da estrutura vertebral e evita danos adicionais causados pela instabilidade espinhal durante a recuperação em ratos¹. A premissa da cirurgia minimamente invasiva é o uso razoável de estruturas anatômicas naturais. Portanto, a localização rápida e precisa dos segmentos da medula espinhal deve ser feita de acordo com a estrutura anatômica dos camundongos. Conforme relatado, o método de imagem foi utilizado para encontrar a vértebra¹³. Embora tenha alta precisão, no processo de operação experimental real, o método de imagem para localização tem as desvantagens de operação inconveniente, longo tempo de operação, aquisição complexa de equipamentos e altos requisitos de precisão do equipamento. McDonough et al. descreveram a localização do T7 através dos ângulos inferiores das escápulas¹⁴, enquanto os camundongos agem em uma prostrada deitada, de modo que os ângulos inferiores mencionados devem ser ângulos posteriores. Além disso, o uso das pontas escapulares inferiores para encontrar o T7 é um método de localização para uma posição específica na anatomia humana¹⁵, o que não é adequado para camundongos. Finalmente, os dados da Micro-TC também validaram a hipótese de que os ângulos posteriores das escápulas não estão nivelados com T7, independentemente de o rato estar em sua posição corporal natural ou específica. McDonough et ^al.14 também mencionaram localizar o ponto mais alto das costas quando o rato está arqueado e definir o ponto mais alto como T12. Comparativamente, na presente pesquisa, o T9 localiza-se com o auxílio do espaço interespinhoso T12-T13, que não está associado nem é afetado pela postura do rato. Além disso, com este método, a vértebra alvo pode ser facilmente localizada e operada. Deve-se sondar a 13ª costela sob o microscópio, tocar suavemente a área do ângulo costovertebral, desenhar uma linha em direção ao processo espinhoso e, em seguida, sondar o espaço entre os processos espinhosos do T12-T13 em direção à cabeça. A equipe de pesquisa usou o espaço interespinhoso T12-T13 para localizar o T9 de 12 camundongos. Finalmente, 12 camundongos fêmeas C57BL/6J tiveram uma Micro-TC após a localização T9 e laminectomia. O resultado da Micro-TC indicou que as lâminas removidas em todos os 12 camundongos eram T9. Os resultados da Micro-TC mostraram que todos os T9 foram localizados com precisão, e a acurácia foi significativamente maior do que o método de localização da escápula. Este método nos fornece uma maneira rápida e precisa de localizar, o que contribui para a consistência do modelo de lesão.

A invasividade mínima do presente protocolo é pronunciada principalmente em três aspectos. Em primeiro lugar, após a localização, os músculos paraespinhais no nível T9 são apenas retraídos por micro-retratores, sem danificar os músculos nos níveis T8 ou T10. Além disso, a exposição da lâmina pelos micro-afastadores não interfere no campo visual. Em segundo lugar, a perda de sangue, que é principalmente de laminectomia, que pode causar fluxo sanguíneo do osso esponjoso, é muito baixa no procedimento de operação, quase não mais do que o volume para manchar um pedaço triangular de algodão de 2 mm x 2 mm x 3 mm. Em terceiro lugar, a laminectomia foi realizada limitada à área necessária em grande medida, mantendo a continuidade da parte lateral da lâmina e atenuando grandemente a instabilidade da vértebra. Comparado aos protocolos anteriores^16,17, o presente protocolo reduz muitos danos desnecessários.

Para avaliar os diferentes graus de LM, os resultados entre todos os grupos em histopatologia foram comparados com o que estudos anteriores já demonstraram 9,11,18. Esses resultados são suficientes para completar um estudo observacional de diferentes graus de lesão e alterações em diferentes períodos. A HE e a imunofluorescência mostraram que, com o aumento da gravidade da LME, uma morfologia mais anormal apareceu no tecido medular, e o aumento do grau de dano também levou a um aumento no grau de distúrbio estrutural da medula espinhal. Do ponto de vista da observação da morfologia tecidual, o grau e a regularidade das alterações morfológicas teciduais em cada grupo experimental deste estudo são altamente consistentes com estudos anteriores.

De acordo com os resultados dos testes histológicos atuais, são indicadas mudanças claras em vários indicadores após diferentes graus de LM traumática, o que confirma ainda mais a confiabilidade do modelo estabelecido neste estudo.

Por mais precisa e eficaz que seja a técnica, podem existir limitações potenciais para os métodos. Em relação à laminectomia, o operador deve ser hábil com operações ao microscópio para evitar que a medula espinhal seja danificada por engano. Além disso, a configuração de toda a plataforma é baseada em estruturas mecânicas, estabelecendo uma demanda maior para o operador em comparação com equipamentos automatizados. De fato, todos os problemas mencionados podem ser melhorados pelo treinamento repetido da operação.

Pode-se observar que a modelagem minimamente invasiva e padronizada é benéfica para tornar os resultados mais uniformes, estáveis e repetíveis, avaliando a eficácia de vários planos de tratamento com precisão e otimizando o plano de pesquisa para LME traumática.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% fixative solution	Solarbio	P1110	4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody	abcam	ab8135	Dilution ratio (1: 2000)
Eosin Staining Solution (water soluble)	biosharp	BL727B
Ethanol	Fuyu Reagent	64-17-5
Fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X800
Frozen Slicer	leica	CM3050 S
GFAP (GA5) Mouse mAb	Cell Signaling TECHNOLOGY	#3670	Dilution ratio (1: 600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32723TR	Dilution ratio (1: 1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32740	Dilution ratio (1: 1000)
Hematoxylin Staining Solution	biosharp	BL702A
Mice	Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany	C57BL/6J
Microsurgery apparatus	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	All the surgey instruments are custom-made	Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution)	Zhong Shan Jin Qiao	ZLI-9022	working solution
O.C.T. Compound	SAKURA	4583
PBS (phosphate buffered solution)	Solarbio	P1020	pH 7.2-7.4
RWD Laboratory inhalation anesthetic station	RWD Life Science Co., Ltd	R550
Small animal in vivo microCT imaging system	PerkinElmer	Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Custom-made(Feng's standard)	(https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1)
Surgery microscope	Zumax Medical Co., Ltd.	zumax, OMS2355
TBST (Tris Buffered Saline+Tween)	Solarbio	T1082	Dilution ratio (1: 19)
Xylene	Fuyu Reagent	1330-20-7