Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dyrking, frysing, prosessering og avbildning av hele organoider og sfæroider mens de fortsatt er i en hydrogel

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64563
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1, 3,5, 6, 2,3,4
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

Summary

Denne studien beskriver metoder for dyrking, frysing, tining, prosessering, farging, merking og undersøkelse av hele sfæroider og organoider under forskjellige mikroskoper, mens de forblir intakte i en hydrogel i en flerbruksenhet.

Abstract

Organoider og sfæroider, tredimensjonale voksende strukturer i cellekulturlaboratorier, blir stadig mer anerkjent som overlegne modeller sammenlignet med todimensjonale kulturmodeller, siden de etterligner menneskekroppen bedre og har fordeler i forhold til dyreforsøk. Imidlertid står disse studiene ofte overfor problemer med reproduserbarhet og konsistens. Under de lange eksperimentelle prosessene - med overføringer av organoider og sfæroider mellom forskjellige cellekulturbeholdere, pipettering og sentrifugering - blir disse følsomme og skjøre 3D-voksende strukturer ofte skadet eller tapt. Til syvende og sist påvirkes resultatene betydelig, siden 3D-strukturene ikke kan opprettholde de samme egenskapene og kvaliteten. Metodene beskrevet her minimerer disse stressende trinnene og sikrer et trygt og konsistent miljø for organoider og sfæroider gjennom hele behandlingssekvensen mens de fortsatt er i en hydrogel i en flerbruksenhet. Forskerne kan vokse, fryse, tine, behandle, flekke, merke og deretter undersøke strukturen til organoider eller sfæroider under ulike høyteknologiske instrumenter, fra konfokale til elektronmikroskoper, ved hjelp av en enkelt flerbruksenhet. Denne teknologien forbedrer studienes reproduserbarhet, pålitelighet og validitet, samtidig som den opprettholder et stabilt og beskyttende miljø for de 3D-voksende strukturene under prosessering. I tillegg minimerer eliminering av stressende tiltak håndteringsfeil, reduserer tiden som tas og reduserer risikoen for forurensning.

Introduction

Fremtiden for celleforskning og terapi ligger innenfor 3D-cellekulturer 1,2,3. Organoid- og sfæroidmodeller lukker gapet mellom in vitro-eksperimenter og dyremodeller ved å skape bedre modeller som etterligner menneskelig kroppsutvikling, fysiologi og sykdommer 4,5,6,7,8,9. Reproduserbarheten og repeterbarheten til disse modellene er imidlertid fortsatt utfordrende. Videre resulterer håndtering, høsting, overføring og sentrifugering av disse strukturene med dagens teknologi i tap eller skade på organoider og sfæroider under mange forhold, noe som påvirker resultatene betydelig.

Til tross for mange protokoller for histologisk farging, immunhistokjemisk farging, immunfluorescensmerking og kryopreservering, er det ingen universell tilnærming knyttet til standardisering av eksperimentelle forhold, håndtering og behandling av disse delikate strukturer uten å miste eller skade dem. Nåværende protokoller er også utrolig lange, vekslende fra noen dager til flere uker, og inkluderer komplekse prosedyrer med forskjellige reagenser 10,11,12,13,14. I tillegg forårsaker høsting, pipettering, sentrifugering og overføring av 3D-voksende strukturer mellom cellekulturbeholdere og kryovialer endringer i posisjoneringen av strukturer og mekaniske krefter, og til slutt påvirker differensiering og modning av organoider og sfæroider. Det har blitt rapportert at vevstopologi, posisjonering av cellene og mekaniske krefter betydelig påvirker celledifferensiering og modning 6,15,16,17.

Derfor er det ønskelig å forbedre dagens konvensjonelle teknologier for å generere organoider og sfæroider med stabil kvalitet. En metode / enhet som vil hoppe over sentrifugering og andre trinn beskrevet ovenfor og gi materialet i et enkelt trygt miljø fra begynnelsen til slutten av de mange prosessene, vil være gunstig for å nå de mest konsistente og pålitelige dataene. I tillegg vil dette redusere tids-, arbeids- og kostnadsbegrensninger.

Multifunksjonsenheten (MD) beskrevet her gir et enkelt trygt miljø for flere prosesser av organoider og sfæroider (supplerende figur 1). Denne enheten og komplementeringsprotokollene eliminerer høstings-, pipetterings-, overførings- og sentrifugeringstrinnene. Organoider og sfæroider forblir i deres in vitro-miljø under sekvensielle prosesser. Dette miljøet består hovedsakelig av naturlige eller syntetiske ekstracellulære matrikskomponenter, som kommersielt tilgjengelige hydrogeler. Med andre ord, metodene beskrevet her tillater en helmontert prøve av organoider / sfæroider som skal behandles, undersøkes og fryses mens de fortsatt er i en hydrogeldråpe.

Den biokompatible enheten er motstandsdyktig mot temperaturer mellom 60 ° C og -160 ° C, noe som gjør det mulig å gjenopprette organoider / steroider i en flytende nitrogentank ved -160 ° C eller å forberede harpiksblokker for elektronmikroskopi ved 60 ° C. Nisjen i enheten er designet for å definere en begrenset plass for 3D-voksende strukturer og stimulere dannelsen av sfæroider eller organoider basert på tidligere studier 18,19,20,21,22,23. Den delen av enheten er gjennomsiktig og inneholder en spesifikk plast som gir høy optisk kvalitet (brytningsindeks: 1,43; abbeverdi: 58; tykkelse: 7,8 mil [0,0078 tommer eller 198 μm]). Både nisje og den omkringliggende "side" -delen forårsaker autofluorescens. Den gjennomsiktige nisje i midten har et 80 mm 2 område, mens sidedelen er 600 mm2. Beholderens dybde er 15 mm, og tykkelsen er 1,5 mm. Disse funksjonene, i tillegg til størrelsen og utformingen av enheten, gjør det mulig å gjøre observasjoner under ulike typer høyteknologisk mikroskop og forberede prøvene for elektronmikroskopiske undersøkelser (figur 2). Lukkesystemet til enheten gir to posisjoner, en forseglet i fryseren og den andre tillater gasstrøm i inkubatoren. CCK8-proliferasjons- og cytotoksisitetsanalyser viser lignende effekter på celler sammenlignet med de tradisjonelle cellekulturrettene (supplerende figur 2). Trypan blå eksklusjonstest viser høy celle levedyktighet (94%) under cellekulturen i MD (figur 3).

Prosessene som kan utføres for en prøve i den enkelte enheten omfatter (1) dyrking, (2) histologisk farging, (3) immunostaining, inkludert immunhistokjemisk og immunfluorescensmerking, (4) frysing, (5) tining, (6) undersøkelse under optiske mikroskoper, for eksempel brightfield, darkfield, fluorescens, konfokale og superoppløsningsmikroskoper, (7) belegg og undersøkelse direkte under et skanningelektronmikroskop, eller (8) forberedelse til transmisjonselektronmikroskopi ( Figur 2).

Ulike metoder finnes for histologisk farging, immunhistokjemisk merking eller fluorescerende merking av organoider og sfæroider 10,11,12,13,14,24,25. Høsting av dem fra hydrogelen er det første og viktigste trinnet i dagens teknologi. Etter dette trinnet tillater noen metoder helmontert immunmerking. De høstede organoider er innebygd i paraffin, seksjonert og merket for farging og immunostaining i andre. Seksjonene kan imidlertid ikke presentere hele prøven og gir bare begrensede data relatert til 3D-arkitekturen til strukturen. Videre er skade på disse 3D-strukturene og tap av antigenisitet velkjente bivirkninger av disse teknologiene.

De komplementerende nye protokollene for mikroskopiske undersøkelser i denne artikkelen tillater en analyse av hele monteringsprøver som fortsatt er i en hydrogel. Protokollene som er beskrevet her inkluderer to nyutviklede formuleringer: løsning for immunhistokjemi (S-IHC) og løsning for immunfluorescensmerking (S-IF). Metodene med disse løsningene gjør det mulig for forskere å få mer nøyaktige data, siden det ikke er noen skadelige effekter av tradisjonelle arbeidsflyter, for eksempel sentrifugering, pipettering og overføring av de delikate strukturene. Protokollen beskrevet her eliminerer også behovet for høsting, blokkering, rydding og antigeninnhentingstrinn, og forkorter hele prosedyren til 6-8 timer. Videre tillater metodikken samtidig å legge til ett til tre antistoffer til samme S-IF. Derfor er det mulig å få resultatene samme dag selv etter de mange merkingseksperimentene, noe som er en annen fordel med protokollen beskrevet her; Tradisjonelle helmonterte immunfluorescensmerkingsprotokoller tar vanligvis mellom 3 dager og flere uker 10,11,12,13,14.

Parafininnbygging, et annet skadelig skritt som reduserer antigenitet, er også utelatt. 3D-strukturen forblir i sitt in vitro-miljø fra begynnelsen til slutten av den mikroskopiske undersøkelsen. Siden 3D-strukturen forblir i vekstforholdene, etterligner proteinuttrykks- og lokaliseringsdataene in vivo-forholdene bedre. Mer nøyaktige resultater forventes, siden metoden eliminerer trinnene som påvirker prøvens antigenuttrykk. Tabell 1 og tabell 2 viser hvordan disse nye protokollene eliminerer trinn, sparer tid og arbeidskraft i laboratoriet, og reduserer kostnader og avfallsprodukter sammenlignet med tradisjonelle arbeidsflyter.

I tillegg til de avgjørende trinnene som er beskrevet ovenfor, er et annet problem å gi et kryopreserveringsmedium og metode for å bevare 3D-strukturen til prøven med høyere celle levedyktighetshastigheter 26,27,28,29,30,31. Kryopreservering er avgjørende for å skape et stabilt modellsystem og muliggjøre biobanking av organoider og sfæroider32,33. Biobanking hele den opprinnelige 3D-strukturen vil muliggjøre en mer trofast rekapitulering av den naturlige tilstanden av helse eller sykdom. De viktigste hensynene er bekvemmeligheten og påliteligheten av kryopreservering og tining av organoider / sfæroider. Post-tine organoid utvinning er svært lav i de fleste nåværende teknologier, ofte mindre enn 50%. Nylige studier har imidlertid vist lovende resultater med forbedrede overlevelsesrater26,27,28,29. Lee og medarbeidere viste at 78% av sfæroidcellene overlevde etter kryopreservering når de brukte University of Wisconsin-løsningen som inneholdt 15% DMSO28. Celleoverlevelsesforholdet økte til 83% i studien av Arai et al.29. Resultatene etter kryopreservering påvirkes imidlertid betydelig siden 3D-strukturene ikke kan opprettholde de samme egenskapene og kvaliteten. I tillegg er serumfrie reagenser nødvendig for god produksjonspraksis i farmasøytiske og diagnostiske innstillinger. Tradisjonelle arbeidsflyter bruker et medium som inneholder føtalt bovint serum (FBS) og dimetylsulfoksid (DMSO) for langsom frysemetode, som begge er forbundet med handikap. FBS er et animalsk avledet produkt og kan ha batchvariasjoner. DMSO er et svært vellykket kryobeskyttende middel, men langvarig eksponering, spesielt under tining, kan forårsake cytotoksiske effekter30,31.

Denne artikkelen beskriver også fryse-/tinemetoden til hele organoider eller sfæroider mens de fortsatt er i en hydrogel. To formler for frysing av organoider og sfæroider brukes i studien: (1) 10 % DMSO som inneholder tradisjonell fryseløsning (FS) og (2) et serum- og DMSO-fritt kryopreserveringsmedium. Dette kryopreserveringsmediet inneholder ekstracellulære matrisekomponenter, som er forskjellige fra nåværende formler. Den ekstracellulære matrisen består av to hovedklasser av makromolekyler, proteoglykaner og fibrøse proteiner, som er essensielle for fysisk stillas for de cellulære bestanddelene, men også initierer prosesser som kreves for vevsmorfogenese, differensiering og homeostase 34,35,36,37,38,39,40 . Kollagener gir strekkfasthet, regulerer celleadhesjon, støtter kjemotaksis og migrasjon, og direkte vevsutvikling37. I tillegg gir elastinfibre rekyl til vev som gjennomgår gjentatt strekk38. Et tredje fibrøst protein, fibronektin, styrer organisasjonen av den interstitielle ekstracellulære matrisen og har en avgjørende rolle i å formidle cellefeste og fungerer som en ekstracellulær mekanoregulator39. Du og medarbeidere har vist den kryobeskyttende effekten av kyllingkollagenhydrolysat på det naturlige actomyosinmodellsystemet41. Resultatene deres tyder på at kollagenhydrolysat kan hemme iskrystallvekst, redusere proteinfrysedenaturering og oksidasjon på samme måte som kommersielle kryobeskyttende midler, og gi en bedre gelstruktur etter fryse-tine-sykluser. Derfor gir tilsetning av ekstracellulære matrikskomponenter til kryopreserveringsmediet et sikrere og beskyttende miljø for prøven og støtter de levende strukturene til å helbrede etter frysing-tining.

I tillegg beskriver denne studien en enkel protokoll for å merke cytoplasmatiske membraner og kjerner av levende organoider og sfæroider mens de fortsatt er i hydrogelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dyrking av organoider og sfæroider

  1. Legg hydrogelen på is over natten (i kjøleskap eller kjølerom) for å tine.
  2. Plasser det kommersielt tilgjengelige flerbruksutstyret (MD; se Materialfortegnelse) i inkubatoren 1 dag før eksperimentet (37 °C, 5 % CO2) for å varmes opp.
  3. Plasser sterile, brede pipettespisser i kjøleskapet ved 4 °C.
    MERK: Trinn 1.1-1.3 skal utføres på dag 0, og trinn 1.4-1.11 skal utføres på dag 1.
  4. Legg hydrogelen på is i en laminær strømningshette i 15 minutter.
    1. Valgfritt: Fortynn hydrogelen i kaldcellekulturmedium i henhold til produsentens anbefaling.
  5. Plasser røret som inneholder en pellet av HepG2-celler (kommersielt oppnådd hepatocellulært karsinomcellelinje; se Materialtabell) på is.
  6. Plate 30-35 μL 100% hydrogel innenfor nisje av den forvarmede enheten for å skape en geldråpe.
  7. Plasser 10 000 HepG2-celler midt på toppen av hver hydrogeldråpe (figur 2), og inkuber i 15 minutter ved 37 °C.
  8. Dekk hydrogeldråpen med 200 μL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% Fetal Bovine Serum.
  9. Dekk lokket på MD i riktig posisjon for å tillate gasstrøm, og plasser enheten i inkubatoren.
  10. Fôr cellene med 200 μL DMEM med 10% FBS annenhver dag.
  11. Kontroller veksten av sfæroidene under et omvendt mikroskop (figur 3). Sfæroiddannelse starter etter den 3. Video 1 viser plasseringen av sfæroider på forskjellige nivåer i en hydrogelkuppel.
    MERKNADER: Det anbefales sterkt å forsiktig aspirere væsken som omgir hydrogelen og sakte legge den nye væsken til miljøet for å forhindre skade på hydrogeldråpene.

2. Hematoksylin og Eosinfarging av helmonterte organoider / sfæroider i en hydrogel

  1. Varm fikseringsmiddelet (4% paraformaldehyd; PFA), PBS og hematoksylin (se materialfortegnelse) til 37 °C.
  2. Aspirer mediet som omgir hydrogeldråpen med en pipette, tilsett 100-200 μL 4% PFA for å fikse, og inkuber i 15-20 minutter ved 37 ° C.
  3. Aspirer 4% PFA og tilsett 200 μL PBS for å vaske 3x i 5 minutter hver ved 37 °C. Deretter aspirerer PBS og inkuberer med 200 μL hematoxylinoppløsning i 15-20 minutter ved 37 ° C.
  4. Aspirer hematoksylin og tilsett 200 μL dH2O for å vaske 3x i 10 minutter hver ved 37 °C. Aspirer dH2O og inkuber med 200 μL etanol i 5-10 minutter ved 37 °C.
  5. Aspirer etanolen og inkuber med 200 μL Eosin (se materialfortegnelse) i 10 minutter ved 37 °C. Aspirer Eosin og tilsett 200 μL dH2O for å vaske i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
  6. Aspirer dH2O og tilsett 100 μL glyserol for å dekke hydrogelfallet som monteringsmedium.
  7. Valgfritt: Monter nisjen med et deksel. Dette trinnet kan utelates for å unngå å klemme organoider / sfæroider av betydelig størrelse.
  8. Lukk lokket på MD fast for å unngå tørking til undersøkelse. Prøven er stabil for undersøkelse i minst 6 måneder.

3. Immunhistokjemi av helmonterte organoider/sfæroider i en hydrogel

  1. Varm den kommersielt oppnådde løsningen for immunhistokjemi (S-IHC; se materialfortegnelse) til 37 °C.
  2. Inkuber organoider eller sfæroider i hydrogelen med 3% hydrogenperoksid (H 2 O 2) i 200 μL dH2O i 5 minutter ved 37 °C.
  3. Aspirer hydrogenperoksidoppløsningen og vask i dH2O i 5 minutter ved 37 °C. Aspirer dH2O og inkuber to ganger med 100 μL S-IHC ved 37 °C i 10 minutter hver.
  4. Aspirer S-IHC og inkuber med 100 μL primært antistoff (se materialtabell) fortynnet i S-IHC i 1-2 timer ved 37 °C (etter produsentens anbefalinger angående arbeidsfortynning).
  5. Aspirer den primære antistoffløsningen og inkuber med 100 μL S-IHC 3x i 5 minutter hver ved 37 °C.
  6. Aspirer 100 μL S-IHC og inkuber med et biotinylert sekundært antistoff (se materialtabell) i 10 minutter ved 37 °C.
  7. Aspirer den sekundære antistoffløsningen og inkuber med 100 μL S-IHC 3x i 5 minutter hver ved 37 °C. Aspirer S-IHC og inkuber med 100 μL pepperrotperoksidase (HRP) merket streptavidin (se materialtabell) i 10 minutter ved 37 °C.
  8. Aspirer HRP merket streptavidin og inkuber med 100 μL S-IHC 3x i 5 minutter hver ved 37 °C.
  9. Aspirer S-IHC og inkuber med 100 μL DAB/AEC kromogenoppløsningsblanding (se materialfortegnelse) i 5-10 minutter ved 37 °C.
  10. Overvåk intensiteten av fargingen under et lysmikroskop.
  11. Vask med dH 2 O 3x i2minutter hver.
  12. Valgfritt: Inkuber med 100 μL hematoksylin (se materialtabell) for kjernefysisk motfarging i 5 minutter ved 37 °C.
  13. Aspirer hematoksylin og vask i dH2O i 5 minutter.
  14. Aspirer dH2O og dekk hydrogeldråpen med 100 μL glyserol som monteringsmedium.
  15. Lukk lokket på MD fast til mikroskopisk undersøkelse.
    MERKNADER: Antigeninnhenting og proteinblokkeringstrinn er utelatt i denne protokollen siden S-IHC eliminerer disse trinnene.

4. Immunfluorescensmerking av helmonterte organoider / sfæroider i en hydrogel

  1. Varm opp følgende materialer til 37 °C: 4 % PFA, PBS, S-IF, primær antistoffløsning i S-IF, sekundær antistoffløsning i S-IF, kjernefysisk flekk og glyserol (se materialfortegnelse).
  2. Aspirer cellekulturmediet og fest med 200 μL 4% PFA i 15-30 minutter ved 37 °C. Aspirer fikseringsmiddelet og vask i S-IF 3x i 10 minutter hver ved 37 °C.
  3. Legg dH2O til siden rundt nisjen for å gi fuktighet under de følgende trinnene.
  4. Aspirer S-IF som omgir hydrogeldråpen og inkuberer hydrogeldråpen med 100 μL primær antistoffløsning (se materialfortegnelse) i S-IF i 30-60 minutter ved 37 °C.
  5. Aspirer den primære antistoffløsningen og vask i S-IF 3x i 10 minutter hver ved 37 °C.
  6. Aspirer S-IF og inkuberer med 100 μL sekundær antistoffløsning (se Materialtabell) i S-IF i 30-60 minutter ved 37 °C i mørket.
  7. Aspirer den sekundære antistoffoppløsningen og vask med PBS 3x i 10 minutter hver ved 37 °C i mørket.
  8. Aspirer PBS og inkuber med 100 μL nukleær-DNA-flekker som inneholder monteringsmedium eller glyserol ved 37 ° C i mørket.
  9. Fyll nisje med glyserol for å unngå tørking.
  10. Valgfritt: Dekk nisjen med et deksel. Dette trinnet kan utelates for å unngå å klemme organoider / sfæroider.
  11. Lukk MD tett. Prøver i MD kan lagres ved 4 ° C i mørket i minst 6 måneder med minimalt tap av fluorescens.
  12. Bruk følgende innstillinger for konfokal mikroskopisk undersøkelse: sett nålehullsverdien for alle kanaler til 20,1, hold forsterkningsmasterkonstanten ved 550 for 488 nm, 485 for 550 nm og 450 for 594 nm, hold lasereffekten konstant for alle eksperimenter, og den laveste prosentandelen ved 2,0.
    MERKNADER: Primære antistoffer: Anti-Na-K ATPase (1:100), Anti-Arginase (1:50), Anti-Albumin (1:50), Anti-Beta-galaktosidase (1:25), Antimitochondrial antistoff (1:100), Anti-Golgi antistoff (1:50), Anti-Cytokeratin 5 (1:100), Ov6 antistoff (1:100). Sekundære antistoffer: Geit anti-Kanin IgG (H+L)- 488, Geit anti-Kanin IgG (H+L)-550, Geit anti-Mus IgG (H+L)-488, Geit anti-Mus IgG (H+L)-550, Geit anti-Kylling IgY(H+L)-647. Fortynningen for alle sekundære antistoffer er 1:100. I tillegg brukes FITC-Phalloidin (1:100), et konjugert antistoff, også (se Tabell over materialer).

5. Plasmamembran og kjernemerking av levende organoider og sfæroider i en hydrogel

  1. Forbered merkeløsning som inneholder Alexa fluor hvetekimagglutinin (5,0 μg / ml) og Hoechst (2 μM) i Hanks balanserte saltløsning (HBSS), i henhold til produsentens anbefalinger (se materialfortegnelse), og varm opp til 37 ° C.
  2. Aspirer cellekulturmediet og tilsett 100 μL merkeløsning for å dekke hydrogeldråpen. Inkuber i 15-30 minutter ved 37 °C.
  3. Fjern merkeløsningen og vask to ganger i PBS 2x i 10 minutter hver ved 37 °C. Valgfritt: Fest med 200 μL 4% formaldehyd i 15 minutter ved 37 °C.
  4. Dekk hydrogeldråpen med glyserol som monteringsmedium. Valgfritt: Monter nisjen med et dekselglass.
  5. Lukk lokket på MD tett og hold det nedkjølt i mørket til fluorescens / konfokal mikroskopisk undersøkelse. Den er stabil i minst 6 måneder.

6. Frysing og tining av helmonterte organoider/sfæroider i en hydrogel

  1. Frys organoidene ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Varm opp den kommersielt oppnådde fryseoppløsningen (FS; se materialfortegnelse) til 37 °C.
    2. Aspirer cellekulturmediene rundt hydrogelkuppelen forsiktig.
    3. Tilsett 200 μL FS forsiktig. Inkuber prøven med FS ved 37 °C i 1 time.
    4. Lukk enhetens lokk tett og legg det i en skumboks. Legg denne skumboksen i en annen skumboks, som vist i figur 3. Lukk begge skumboksene tett. To skumbokser inni hverandre gir et temperaturavkjølingsgradientområde på 1 til 2 ° C / min av prøven i en fryser på -20 ° C.
    5. Plasser esken ved -20 °C i 2 timer. Overfør esken til en fryser på -80 °C og la den stå over natten.
    6. Ta ut prøven fra boksene. Prøven i MD kan oppbevares i fryseren -80 °C i 6 måneder.
    7. Overfør MD som inneholder prøven til tanken med flytende nitrogen for langtidslagring.
  2. Tine organoidene ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Ta ut MD som inneholder prøven fra fryseren / nitrogentanken og legg den direkte inn i en inkubator ved 37 ° C. Inkuber i 1 time ved 37 °C.
    2. Tilsett 200 μL varmt kulturmedium til nisje (forholdet mellom FS og cellekulturmedium er 1: 1) og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
    3. Legg til mer varmt kulturmedium til nisjen (forholdet mellom FS og cellekulturmedium er 1: 2) og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
    4. Aspirer mediet og FS-blandingen forsiktig. Fortsett til skanning elektronmikroskopi (trinn 7) og transmisjonselektronmikroskopi (trinn 8) avbildning av helmonterte organoider / sfæroider i hydrogelen.

7. Skanning elektronmikroskopi av helmonterte organoider / sfæroider

  1. Varm opp Karnovskys fiksative og postfiksative løsning (se materialtabell) til romtemperatur (RT).
  2. Aspirer cellekulturmediet som omgir hydrogelen i MD. Legg prøven i MD på is i den laminære strømningshetten i 15 minutter.
  3. Aspirer den flytende hydrogelen som omgir organoidene / sfæroidene veldig forsiktig. En begrenset mengde matrigel kan holde seg i nisje for å unngå å skade og miste prøven.
  4. Fiks med Karnovskys fikseringsmiddel (2% PFA, 2,5% glutaraldehyd i 0,15 M Cacodylate buffer og 2 mM CaCl2; se Materialtabell) ved RT i 1 time.
  5. Aspirer fikseringsmiddelet forsiktig og vask med destillert vann (dH2O) 3x i 15 minutter hver.
  6. Aspirer dH2O forsiktig og fest med postfiksativ oppløsning (1% vandig osmiumtetroksid [OsO4]; se materialtabell) ved RT i 1 time.
  7. Aspirer etterfikseringsmiddelet forsiktig og vask med destillert vann (dH2O) 3x i 15 minutter hver.
  8. Dehydrer i en gradert serie etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), blanding av etanol / aceton (1: 1; 1: 2) og absolutt aceton ved RT i 15 minutter hver.
  9. Tørk med en tørketrommel med kritisk punkt.
  10. Belegg prøven i enheten med 6 nm gull / palladium ved hjelp av en sputterbelegg (se materialtabell) i 90 s.
  11. Observer under et skanningelektronmikroskop med en sekundær elektrondetektor i linsen ved 2-3 kV i vakuummodus (5 x 10-6 mA). Ta bilder med en arbeidsavstand på 8,1–8,2 mm og med 675x, 1050x og 1570x forstørrelser.
    MERKNADER: Alle trinn utføres i MD. Bruk 200-250 μL oppløsning for hvert trinn.

8. Transmisjonselektronmikroskopi av helmonterte organoider/sfæroider i en hydrogel

  1. Varm opp Karnovskijs fikseringsmiddel til 37 °C. Aspirer cellekulturmediet som omgir hydrogelen i MD.
  2. Fest prøven med Karnovskys fikseringsmiddel ved RT i 1 time. Vask med dH2O 3x i 15 min hver.
  3. Post-fix med 2% vandig OsO4 og 2,5% kaliumferrocyanid ved RT i 45 min. Vask med dH2O 3x i 10 minutter hver.
  4. Inkuber i 0,5% tiokarbohydrazid (TCH; se Materialtabell) ved RT i 30 min. Vask med dH2O 3x i 10 minutter hver.
  5. Inkuber i 2% vandig OsO4 ved RT i 30 min. Vask med dH2O 3x i 10 minutter hver.
  6. Inkuber i 2% uranylacetatoppløsning (se materialfortegnelse) ved RT i 1 time.
    MERK: I dette trinnet kan sfæroider holdes ved 4 °C over natten.
  7. Inkuber i blyaspartatoppløsning (se materialfortegnelse) ved 60 °C i 45 minutter. Vask med dH2O 3x i 10 minutter hver.
  8. Dehydrer i en gradert serie etanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) og absolutt aceton ved RT i 15 minutter hver.
  9. Behandle med en blanding av (1: 1; 1: 2) aceton / Epon harpiks og ren Epon harpiks (se Tabell over materialer) ved RT i 2 timer hver.
  10. Polymeriser harpiksen ved 60 °C over natten (minimum 16 timer). Etter polymerisasjonen, fjern harpiksblokken fra MD, som vist i tilleggsfigur 4.
  11. Fest harpiksblokken til en større med harpikslim. Trim blokken og nå plasseringen av organoider eller sfæroider.
  12. Få halvtynne (1000 nm) og ultratynne seksjoner (60 nm) ved hjelp av en ultramikrotom (se Materialfortegnelse).
  13. Plasser de ultratynne seksjonene på 100 mesh kobbergitter og observer under et skanningelektronmikroskop med en STEM-detektor ved en akselererende spenning på 30 kV. Ta bilder med en arbeidsavstand på 44 mm og ved 2580x, 5020x og 6060x forstørrelser.
    MERKNADER: Bruk 200-250 μL løsning for hvert trinn. Trinn 8.1-8.10 utføres i MD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne artikkelen representerer en flerbruksenhet (MD) og komplementerende metoder for dyrking, frysing, tining, histologisk farging, immunhistokjemisk farging, immunfluorescensmerking, belegg og behandling av hele organoider eller sfæroider mens de fortsatt er i en hydrogel i et enkelt unikt designet miljø. Den nåværende studien ble designet for å forberede HepG2 leverkreft sfæroider i 35 hydrogeldråper i 35 MD. Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer for å sikre nøyaktighet. I tillegg var lungeorganoider i MD immunfluorescerende merket som et eksempel for å demonstrere resultatene av dagens metoder for organoidstudier.

Figur 1 viser en nærmere titt på enheten som inneholder en hydrogelkuppel. Nisjens størrelse og form er designet for å gi et beskyttende miljø for hydrogelen som inneholder organoider / sfæroider og lagre reagensene som brukes under ulike prosesser. I tillegg kan sidedelen av enheten som omgir nisje brukes som fuktighetskammer under immunostaining-eksperimenter. Mediet for å mate prøven kan variere mellom 100-200 μL, avhengig av høyden på hydrogeldråpen. Den nåværende studien fokuserer på kuppelbasert metode siden mange hydrogeler, kommersielle ekstracellulære matrisekomponenter og kjellermembranekstrakter tillater brukeren å forberede dråper. Det er imidlertid også mulig å fylle nisjen til MD med hydrogelen og deretter frø cellene inne i den for å generere organoider / sfæroider. Denne metoden kan foretrekkes hvis viskositeten til matrisen ikke tillater fremstilling av kupler eller hvis eksperimentet inneholder store mengder organoider. Hydrogeltypen og hydrogel / medium-forholdet for fremstilling av dråper kan variere i henhold til celletype, eksperimentell design og medium. Figur 1  representerer også enhetens design som gjør det mulig å undersøke organoider / sfæroider under brightfield, confocal og skanning elektronmikroskoper mens organoider / sfæroider fortsatt er i sitt opprinnelige in vitro-miljø .

Figur 2 viser hvordan man kan så celler i en hydrogel og undersøke utviklingen av sfæroider eller organoider. Utformingen og dimensjonene til flerbruksenheten er også presentert i den figuren. Video 1 demonstrerer plasseringen av 3D-voksende sfæroider i en hydrogel. Figur 3 viser levende bilder av voksende sfæroider fra dag 3 til dag 21. Tiden for dannelse av sfæroider og organoider kan variere i henhold til prøvens art. For eksempel dannet sfæroider fra HepG2-celler og HEK-celler innen 3 dager, mens dannelsen av lever- og galdeorganoider varte i 2 uker under forsøkene.

Hematoksylin og Eosin-fargede sfæroider ses i figur 4. Bildet representerer godt bevarte og homogent fargede sfæroider i forskjellige størrelser og fusjoner av sfæroider. Levende celler i midten av sfæroidene er bemerkelsesverdige. Bildet demonstrerer også de delikate forbindelsene mellom cellene fra forskjellige sfæroider. Disse skjøre forbindelsene kunne ikke visualiseres etter tradisjonelle arbeidsflyter siden overføring, pipettering eller sentrifugering ville skade dem. Figur 5  demonstrerer immunostaining av sfæroider med antistoffet spesifikt for arginase, en av de vanligste markørene for diagnose og prognose av hepatocellulært karsinom42,43. Mikrografiene avslører differensierte og udifferensierte leverkreftceller i de samme sfæroidene. Denne figuren inneholder bilder med og uten motfarge med Hematoxylin. Forskere kan velge å utelate counterstaining med Hematoxylin i tilfeller der det ville være vanskelig å skille merkede områder i en 3D-struktur.

Figur 6 representerer en annen enkel protokoll for helmontert visualisering av levende organoider / sfæroider i en hydrogel: levende cellemembran og kjernefarging. Metoden tillater samme merketetthet i periferien og midten, og viser fullstendig reagenspenetrasjon. Figur 7, figur 8 og figur 9 viser representative bilder av sfæroider merket med henholdsvis ett, to eller tre antistoffer. En til tre primære antistoffer fortynnes i S-IF samtidig. På samme måte fortynnes en til tre matchende sekundære antistoffer egnet for eksperimentet samtidig i S-IF. Immunmerkingsprotokollen gjør det mulig for forskere å markere 3D-strukturene innen 4-6 timer uten å miste eller skade dem. Bakgrunnen er gjennomsiktig, og teknologien som brukes her krever ikke ytterligere clearing, antigeninnhenting eller blokkeringsmetoder / løsninger. Metoden gjør det også mulig for forskere å merke prøven med flere antistoffer i ett enkelt trinn. Med andre ord forbereder brukeren en løsning som inneholder en til tre primære antistoffer og en annen løsning som samsvarer med ett til tre sekundære antistoffer. Protokollen beskrevet her eliminerer sekvensielle merkingstrinn med forskjellige antistoffer i konvensjonelle metoder.

Figur 10 representerer skanning og transmisjonselektronmikroskopiske bilder av sfæroidene. Den første raden demonstrerer bilder av hele sfæroider i MD under et skanningelektronmikroskop. Den andre raden inneholder transmisjonselektronmikroskopiske bilder av sfæroider etter fremstilling av harpiksblokkene som inneholder helmonterte sfæroider i MD, samt bilder av seksjonerte og fargede sfæroider. Godt bevarte cytoplasmatiske organeller og andre ultrastrukturelle egenskaper av cellene demonstrerer effektiviteten av denne enkle protokollen, som beskytter 3D-strukturen til hele prøven. MD tillater også forskerne å fryse og tine de hele monterte prøvene i en hydrogel. Figur 11  demonstrerer hydrogelkupler og sfæroider ved høyere forstørrelse før og etter frysing. Uregelmessigheten ved grensene til hydrogelkuppelen er bemerkelsesverdig. Imidlertid er rundheten til de kryopreserverte sfæroidene nesten stabil etter tining sammenlignet med sfæroidene før frysing. Levende cellemembran og kjernemerkingsmetoder brukes også 48 timer etter tining for å demonstrere hvordan fryse- / tiningsprosedyren påvirket 3D-arkitekturen, cellemembranen og cellens levedyktighet. Den tradisjonelle fryseløsningen som inneholder dimetylsulfoksid og den nåværende nylig formulerte løsningen, SF, viser lignende resultater. Mer enn 75% av 3D-strukturene kunne overleve i denne protokollen. Imidlertid er det behov for ytterligere eksperimenter for å avsløre de langsiktige bivirkningene av hver formulering på organoider og sfæroider.

Tabell 1 og tabell 2 sammenligner de tradisjonelle arbeidsflytene med de som er beskrevet her basert på trinnnummer, varighet og avfallsproduksjon (dvs. totalt antall plasthansker, pipettespisser, serologiske pipetter, sentrifugerør, mikrosentrifugerør, cellekulturbeholdere, kryodiver, etc. for hver arbeidsflyt).

Supplerende figur 1 representerer sekvensielle trinn som kan utføres i en enkelt MD skjematisk. Supplerende figur 2 viser resultatene av forsøkene designet for å sammenligne cellens levedyktighet, toksisitet og spredningshastigheter for HepG2-celler i en MD eller en tradisjonell glassbunnet tallerken. Supplerende figur 3 viser skumboksene som har blitt brukt til frysing av prøvene i MD. Supplerende figur 4 oppsummerer trinnene for å ta ut en harpiksblokk fra en MD. Supplerende figur 5 inkluderer bilder av luftveisorganoider som var immunfluorescerende merket og deretter visualisert mens de fortsatt var i MD. På samme måte demonstrerer Video 2 to immunfluorescerende merkede luftveisorganoider i en MD. Til slutt er supplerende figur 6 en graf som sammenligner gjennomsnittlig intensitet av cellemembranmerkingsintensitet i levende sfæroider før og etter frysing ved hjelp av tradisjonell arbeidsflyt og arbeidsflyten beskrevet her. Image J-programvare har blitt brukt til analyse.

Figure 1
Figur 1: Multifunksjonscellekulturenheten (MD). (A) Nisje (N), den sentrale delen av enheten, er utformet for å skape et beskyttende miljø for organoider / sfæroider dyrket i en hydrogeldråpe (D) under sekvensielle prosesser. Siden (S), den omkringliggende delen av nisjen, kan brukes som et luftfukterkammer under immunostaining-eksperimenter. (B) Det gjennomsiktige senteret i lokket lar brukeren observere organoider / sfæroider når enheten er lukket. (C) Hydrogelkuppelen som inneholder organoider i MD kan farges eller innebygd i en harpiksblokk for transmisjonselektronmikroskopi. Lokket inneholder også nisje (N) for hengende slippmetodikk. Størrelsen og utformingen av enheten tillater brukeren å undersøke organoider / sfæroider under (D) brightfield, (E) confocal, og (F) skanning elektronmikroskoper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Såceller inne i en hydrogel. (A) Cellepelleten i pipetten settes inn i toppen av kuppelen. Etter 3-5 dager blir sfæroider synlige i kuppelen, spesielt i periferien av dråpen. (B) Fire levende bilder av voksende sfæroider fra hvert kvartal i en kuppel ble tatt og slått sammen. Skala bar = 200 μm. (C) Utformingen og dimensjonene (i centimeter) til flerbruksenheten (MD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Utvikling av sfæroider i et hydrogelfall fra dag 3 til dag 21. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Hematoxylin og Eosin-farget helmonterte sfæroider i MD. Visualisering av forbindelsene mellom cellene som ligger i tilstøtende eller fusjonerende sfæroider. De delikate prosessene mellom cellene (pilene) er synlige siden hele monteringsprøven i hydrogelen er festet, farget og undersøkt uten å skade de 3D-voksende strukturene. Skala bar: dag 3, dag 9 = 50 μm; dag 7, dag 17 = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Immunhistokjemisk farging av helmonterte sfæroider i hydrogelen i MD. Prøvene ble immunisert med et antistoff spesifikt for arginase. Arginasepositive (røde piler) og negative (svarte piler) celler ses i sfæroidene. Bildene er fra to eksperimenter: (A-C) uten og (D-F) med motbetoning med Hematoxylin. Skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Konfokalt bilde av en levende organoid i hydrogelen. De levende organoidene ble merket med levende cellemembran (WGA) og kjerneflekker (Hoechst). Skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Immunfluorescensmerking av helmonterte sfæroider i en hydrogel med ett antistoff og en nukleær flekk (Hoechst). (AC) Det øvre panelet viser en sfæroid merket med et antistoff spesifikt for Na-K ATPase i cellemembranen. (D-F) Bunnpanelet demonstrerer plasseringen av et annet antistoff som er spesifikt for arginase, et cytosolisk protein spesifikt for hepatocellulært karsinom, i leverkreftsfæroider. Varighet av fargingsprotokoll: 6 timer. Skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: Immunfluorescensmerking av helmonterte sfæroider i en hydrogel med to antistoffer og en nukleær flekk (Hoechst). (A-C) Det øvre panelet viser en sfæroide merket med to antistoffer som er spesifikke for albumin og Ov6. Skala bar = 5 μm. (D-F) Bunnpanelet demonstrerer plasseringen av alfa feto protein og Ov6 i leverkreft sfæroider. Skala bar = 20 μm. Varighet av farging protokollen: 6 h. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Immunfluorescensmerking av helmonterte sfæroider i en hydrogel med tre antistoffer og en nukleær flekk (Hoechst). (A-E) Sfæroiden i det øvre panelet er merket med antistoffer som er spesifikke for arginase, Na-K ATPase og beta-galaktosidase. Skala bar = 10 μm. (F-J) Det midterste panelet demonstrerer en sfæroid merket med Ov6, beta-galaktosidase og alfa-feto protein. Skala bar = 20 μm. (K-O) Sfæroiden i nedre panel er merket med FITC-phalloidin, anti-mitokondrielt antistoff og anti-Golgi-antistoff. Skala bar = 20 μm. Legg merke til den høye merkingspesifisiteten og redusert bakgrunn. Varighet av farging protokollen: 6 h. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Elektronmikroskopi bilder. (AC) Skanning elektronmikroskopiske bilder av hele sfæroider i hydrogelen i MD. Skala bar = 10 μm. (D-F) Ultrastrukturelle egenskaper av cellene i en sfæroid har også blitt visualisert under et transmisjonselektronmikroskop. Skala barer: (D) = 4 μm; (E,F) = 2 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: Levende bilder av sfæroider før og etter frysing. (A-F) Uregelmessigheten av grensene til hydrogelkuplene er tydelig etter frysing. Imidlertid forblir størrelsen og rundheten til sfæroider lik. (F) Cellemigrasjon på kulturoverflaten kan ses etter tining. (G-L) Den levende cellemembranen (WGA) og kjernefargingen (Hoechst) viser lignende celle levedyktighet og intakte cellemembraner før og etter frysing av hele sfæroider i en hydrogel i MD. Skala basr: (A, B, D, E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tradisjonell arbeidsflyt Arbeidsflyt med flerbruksenhet (MD)
Trinn 22 6
Tid 9 dager 4 dager
Avfallsprodukter 26 9

Tabell 1: Sammenligning av trinnnummer, tid og avfallsproduksjon mellom tradisjonelle og nye arbeidsflyter under et kortsiktig eksperiment.

Tradisjonell arbeidsflyt Arbeidsflyt med løsning for immunfluorescens (S-IF)
Trinn 25 7
Tid 120 timer 6-8 timer
Avfallsprodukter 28 10

Tabell 2: Sammenligning av konvensjonell immunmerking og den nye immunmerkingsprotokollen.

Video 1: Tidsserier av bilder på forskjellige nivåer av en hydrogel som inneholder sfæroider under et omvendt fasekontrastmikroskop. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: 3D-struktur av to luftveisorganoider merket med antistoffer for Cytokeratin 5 og DAPI. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende figur 1: Oversikt over forsøket. Dette skjemaet viser de sekvensielle eksperimentelle trinnene for å dyrke og undersøke hele organoider i en hydrogel. Teknologien beskrevet her gjør det mulig å dyrke, fryse, tine, merke og undersøke organoider under forskjellige mikroskoper. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Sammenligning av cellens levedyktighet, toksisitet og proliferasjonshastigheter for HepG2-celler i en tradisjonell glassbunnet tallerken eller en MD. HepG2-celler ble dyrket på (A) en tradisjonell glassbunnet cellekulturskål eller (B) i en MD for å sammenligne cellens levedyktighet og toksisitet. (C) Trypan blå eksklusjonstest ble brukt for å demonstrere levedyktigheten. Skala bar = 20 μm. Resultatene ble sammenlignet ved bruk av (D-E) CCK8 cytotoksisitet og (F) celleproliferasjonsanalyser. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: Arrangement av de to skumboksene. En skumboks er plassert inne i den andre under den langsomme fryseprosessen av hele organoider eller sfæroider i MD. * betegner de to boksene. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 4: Trinn som viser hvordan du fjerner harpiksblokken fra MD etter polymerisering av harpiksen. (A) Harpiksblokken som omgir sfæroider eller organoider fremstilles inne i MD-nisjen og polymeriseres deretter. (B-D) Deretter, med en passende tynn stang, skyves harpiksblokken for å fjerne den fra nisje. (E) Deretter fjernes harpiksblokken, med plasten under. (F-G) Til slutt brukes et par pinsett for å skille dem hvis blokken fortsatt er festet til plasten. (H) Blokken er klar for tynn seksjonering. De helmonterte organoider eller sfæroider i harpiksblokken (*) er klare for seksjonering for transmisjonselektronmikroskopi. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 5: Luftveisorganoider som var immunfluorescerende merket og deretter visualisert mens de fortsatt var i MD. (AC) Det øvre panelet viser sirkulære luftveisorganoider med et sentralt lumen. Grønn representerer luftveisprogenitorceller som uttrykker Cytokeratin 5 i den ytterste ringen av organoiden, og blå representerer kjernene. Skalalinje = 50 μm. (D-F) Det nederste panelet viser det tredimensjonale bildet av de to side-ved-side-organoidene i (D) DAPI- og (E) Alexa 488-filtrene, samt (F) sammenslåtte bildet. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 6: Sammenligning av merketettheten på cellens levende cellemembraner. Grafen sammenligner sfæroidene før og etter frysing ved hjelp av den tradisjonelle og nåværende vedtatte arbeidsflyten. Analysen ble utført ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren Image J. Forkortelser: IntDen = Integrated Density (fluorescensintensitet i de valgte sfæroidene). CTCF = Korrigert total cellefluorescens. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MD, som utfyller formuleringer og protokoller beskrevet her, letter rask og spontan 3D-vekst av organoider og sfæroider i et mer kontrollert miljø og fortsetter eksperimentet under de samme forholdene. Prøven forblir i samme miljø under hele prosessen, og nesten 100% av de 3D-voksende arkitekturene forblir intakte i beholderen. Dette forbedrer homogeniteten under sekvensielle eksperimenter og gir mulighet for en utvidet kulturperiode. I tillegg reduseres antall trinn under organoider og sfæroidbehandling drastisk sammenlignet med tradisjonelle arbeidsflyter (figur 4), noe som igjen minimerer håndteringstid og menneskelige feil og reduserer forurensningsrisikoen. Videre forbedrer dette påliteligheten og gyldigheten siden eksperimentelle forhold forblir stabile samtidig som de beskytter 3D-voksende strukturer i et enkelt miljø. Det bidrar til å spare tid og arbeid i laboratoriet samtidig som nøyaktigheten, påliteligheten og gyldigheten forbedres. I tillegg tillater det sporing av individuelle 3D-voksende strukturer under hele sekvensiell prosess. Undersøkelse av størrelse og posisjonsendringer under kulturen og deres respons på forskjellige forbindelser er mulig i enheten. Dette gir en utmerket in vitro eksperimentell modell for rekapitulering av utviklingen av menneskekroppen og sykdommer. Forskere kan undersøke stadiene under fusjonen av sfæroider og organoider, en viktig mekanisme for migrasjon i sykdommer og normal utvikling44,45,46,47. Nylige studier som tar sikte på modellering av fusjon i laboratoriet foretrekker å bruke organoid- og sfæroidmodeller44,45,46,47.

Denne enheten tillater også forskere å stoppe undersøkelsen i en presserende situasjon ved å fryse dem i sin nåværende tilstand og deretter fortsette uten tap når forholdene tillater nye eksperimenter. For eksempel, på grunn av COVID-pandemien, måtte forskere stoppe eksperimenter umiddelbart, og miste sine dyrebare materialer og data. Det er ingen nåværende løsning for å sikre et eksperiment hvis det er en plutselig avbrudd i studiene på grunn av endring av omstendigheter.

Begrensninger av teknikken
Teknikkene beskrevet her er utviklet for å undersøke spontan utvikling av organoider og sfæroider, en modell for å forstå utviklingen av den normale menneskekroppen og sykdommene. Derfor kan den nåværende enheten og metodene ikke brukes til å utvikle ensartede sfæroider eller organoider som har blitt foretrukket for narkotikascreeningstester. En annen begrensning er relatert til størrelsen på sfæroider og organoider. Full organoider og sfæroider kan være svært tette, med flere cellelag som krever reagenser som bevarer eller merker prøvene for å trenge inn i kjernen. Inkubasjonsperioder for alle protokoller, inkludert farging, merking og frysing, varierer imidlertid i henhold til prøvens størrelse og mikromiljøgelen som omgir prøven. For eksempel krever større organoider og stivere geler mer utvidede inkubasjonsperioder for å tillate penetrasjon i midten av prøven.

Fremtidige applikasjoner
Enheten og disse metodene tillater langsiktig undersøkelse av 3D-voksende organoider og sfæroider for å forstå organogenese, vevmorfogenese og sykdommer samtidig som reproduserbarhet, pålitelighet og nøyaktighet forbedres. Organoider eller sfæroider merket i MD kan undersøkes ved hjelp av høyteknologiske mikroskopiteknologier, inkludert multiphoton laserskanning og lysarkfluorescensmikroskopi. I tillegg kan forskere undersøke den samme prøven i en enkelt enhet under både et konfokalt og skanningelektronmikroskop for å lage en korrelativ studie, CLEM (Korrelativ lyselektronmikroskopi). Enheten og metodene kan også brukes til biobankorganoider og sfæroider samtidig som 3D-arkitekturer beskyttes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ranan Gulhan Aktas eier MD, S-IHC, S-IF og FS patentsøknader. Olgu Enis Tok var involvert i utviklingen av disse produktene. Olgu Enis Tok og Gamze Demirel er FoU-teammedlemmer i selskapet som heter Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut og Ozgecan Kayalar har ingen interessekonflikter å erklære.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til Dale Mertes fra University of Chicago for utarbeidelse av diagrammer, til Dr. Mehmet Serif Aydin for hans tekniske støtte ved Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies, og til Dr. Rana Kazemi fra Maltepe University for redigering av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol (EtOH) Merck 8187602500 Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
Acetone Merck 8222512500 Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)   Invitrogen I34406 Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody Biocare Medical CP 028 A Store at +4 °C
Anti-albumin antibody Abcam EPR20195 Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal Abcam 134435 Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5 Abcam 53121 Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody Biocare Medical ACI 3058 A, B Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2) Sigma C1016-500G Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) Abcam ab228554
Centrifuge tubes, 15 mL  Nest 601051
Centrifuge tubes, 50 mL  Nest 602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus Telstar EN12469
CO2 Incubator Panasonic KM-CC17RU2
Copper Grids Electron Microscopy Sciences G100-Cu Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point Dryer Leica EM CPD300 For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture   Sigma Aldrich AEC101 Store at +4 °C
Diamond knife Diatome Ultra 45°, 40-US Use for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biology Biofroxx 67-68-5
Disposable Plastic Pasteur Pippettes Nest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 41966-029 Store at +4 °C
Eosin Y Solution Alcoholic Bright Slide 2.BS01-105-1000
Epon resin  Sigma 45359-1EA-F Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier Pan Biotech P30-3304 Store at +4 °C
Freezing Solution (FS) Cellorama CellO-F Store at +4 °C
Glass knife maker Leica EM KMR3 For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) Leica 7890-08 Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%  Electron Microscopy Sciences 16210 Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solution Sigma Aldrich 56-81-5 Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 Invitrogen A32933 Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35502 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84540 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35552 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84541 Store at +4 °C
Hematoxylin Harris  Bright Slide 2.BS01-104-1000
HepG2 cells ATCC HB-8065 Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 R&D Systems MAB2020 Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354248 Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354234 Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel ThermoFischer Scientific A1413201 Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
Hydrogel Biotechne, R&D Systems BME001-01 Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acid Sigma 11189-100G Store at RT
Lead aspartate solution Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrate Electron Microscopy Sciences 17900 Store at RT
Leica Confocal Microscope Leica DMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss
Microplate reader Biotek Synergy
Multipurpose Device (MD) Cellorama CellO-M
Nuclear-DNA stain Invitrogen H3569 Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stain ThermoFischer Scientific 62248 DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% Electron Microscopy Sciences 19190 Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibody R&D systems MAB2020 Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%  Sigma 1.04005.1000 Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets MP Biomedicals, LLC 2810305
Post-fixative solution %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%  Electron Microscopy Sciences 26603-01 Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS Zeiss Item no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL Nest 620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachment Zeiss GeminiSEM 500 We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack ScyTek Laboratories SHP125 Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 Electron Microscopy Sciences 11655 Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] GeneTex GTX22871 Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) Cellorama CellO-IF Store at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) Cellorama CellO-P Store at +4 °C
Specimen trimming device Leica EM TRIM2 For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coater Leica EM ACE200 Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH) Sigma 223220-5G Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Ultra gel super glue Pattex PSG2C For glue polymerized epon block with sample to holder epon block
Ultramicrotome Leica EM UC7 For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µL Nest 171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µL Isolab L-002
Universal Pipette Tips, 200 µL  Nest 110919HA01
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  4. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  6. Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
  7. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
  8. Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
  9. Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
  10. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  11. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  12. Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
  13. Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208 (2020).
  14. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578 (2021).
  15. Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
  16. Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
  17. Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  18. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  19. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  20. Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
  21. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  22. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  23. Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
  24. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
  25. Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907 (2021).
  26. Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
  27. Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), Elsevier. 1015-1017 (2012).
  28. Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
  29. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
  30. Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
  31. Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
  32. De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
  33. Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
  34. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
  35. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
  36. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
  37. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
  38. Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
  39. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
  40. Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
  41. Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
  42. Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159 (2020).
  43. Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149 (2012).
  44. Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133 (2020).
  45. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  46. Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614 (2020).
  47. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248 (2020).

Tags

Biologi utgave 190
Dyrking, frysing, prosessering og avbildning av hele organoider og sfæroider mens de fortsatt er i en hydrogel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., … More

Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., Akbulut, Z., Kayalar, O., Aktas, R. G. Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel. J. Vis. Exp. (190), e64563, doi:10.3791/64563 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter