Analyse unicellulaire de l’expression des gènes de Pseudomonas syringae dans le tissu végétal

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode qui permet l’analyse de l’expression génique unicellulaire sur des populations de Pseudomonas syringae cultivées dans l’apoplaste végétal.

Résumé

Une pléthore de micro-organismes pathogènes attaquent constamment les plantes. Le complexe d’espèces Pseudomonas syringae englobe des bactéries phytopathogènes à Gram négatif d’une importance particulière pour un grand nombre d’hôtes. P. syringae pénètre dans la plante par la surface des feuilles et se multiplie rapidement dans l’apoplaste, formant des microcolonies qui occupent l’espace intercellulaire. L’expression constitutive des protéines fluorescentes par les bactéries permet de visualiser les microcolonies et de suivre le développement de l’infection au niveau microscopique. Les progrès récents dans l’analyse unicellulaire ont révélé la grande complexité atteinte par les populations bactériennes isogéniques clonales. Cette complexité, appelée hétérogénéité phénotypique, est la conséquence de différences intercellulaires dans l’expression des gènes (non liées aux différences génétiques) au sein de la communauté bactérienne. Pour analyser l’expression des loci individuels au niveau unicellulaire, les fusions transcriptionnelles avec des protéines fluorescentes ont été largement utilisées. Dans des conditions de stress, comme celles qui se produisent lors de la colonisation de l’apoplaste végétal, P. syringae se différencie en sous-populations distinctes en fonction de l’expression hétérogène de gènes clés de virulence (c.-à-d. le système de sécrétion Hrp de type III). Cependant, l’analyse unicellulaire d’une population donnée de P. syringae récupérée à partir de tissus végétaux est difficile en raison des débris cellulaires libérés lors de la perturbation mécanique intrinsèque aux processus d’inoculation et d’extraction bactérienne. Le présent rapport décrit en détail une méthode mise au point pour surveiller l’expression des gènes d’intérêt de P. syringae au niveau unicellulaire pendant la colonisation d’Arabidopsis et de haricots. La préparation des plantes et les suspensions bactériennes utilisées pour l’inoculation à l’aide d’une chambre à vide sont décrites. La récupération des bactéries endophytes à partir de feuilles infectées par extraction de liquide apoplastique est également expliquée ici. Les méthodes d’inoculation bactérienne et d’extraction bactérienne sont optimisées empiriquement pour minimiser les dommages aux cellules végétales et bactériennes, ce qui donne des préparations bactériennes optimales pour la microscopie et l’analyse par cytométrie en flux.

Introduction

Les bactéries pathogènes présentent des différences dans divers phénotypes, ce qui donne lieu à la formation de sous-populations au sein de populations génétiquement identiques. Ce phénomène est connu sous le nom d’hétérogénéité phénotypique et a été proposé comme stratégie d’adaptation lors des interactions bactérien-hôte¹. Les progrès récents dans la résolution optique des microscopes confocaux, la cytométrie en flux et la microfluidique, combinés aux protéines fluorescentes, ont favorisé les analyses unicellulaires des populations bactériennes².

La Pseudomonas syringae à Gram négat....

Protocole

1. Préparation des plantes

1. Préparez les plantes d’Arabidopsis Col-0 en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Remplissez un pot de 10 cm de diamètre avec un mélange de substrat vermiculite-plante de 1:3 (voir le tableau des matières), préalablement arrosé, et couvrez le pot d’un treillis métallique de 15 cm x 15 cm avec des trous de 1,6 mm x 1,6 mm. Ajustez le treillis métallique au sol humide à l’aide d’un élastique (figure 1A).
   2. Avec un cure-dent humide, semez les graines d’Arabidopsis dans les trous du treillis métallique. Placez trois à quatre graines à distance dans le pot (

Résultats

L’expression du système de sécrétion de type III est essentielle à la croissance bactérienne au sein de la plante. L’expression opportune des gènes T3SS est obtenue grâce à une régulation complexe, au centre de laquelle se trouve le facteur sigma de la fonction extracytoplasmique (ECF) HrpL, l’activateur clé de l’expression des gènes liés à T3SS¹¹. Une analyse de l’expression de hrpL a été précédemment réalisée en utilisant une fusion transcriptionnelle située par chromosome vers un gène .......

Discussion

La méthode présentée ici décrit une procédure non invasive qui permet l’infiltration de bactéries dans le tissu foliaire de la plante, permettant l’inoculation rapide de grands volumes tout en minimisant la perturbation tissulaire. L’une des caractéristiques du complexe d’espèces P. syringae est sa capacité à survivre et à proliférer à l’intérieur de l’apoplaste de la plante et à la surface de la plante en tant qu’épiphyte¹⁴. Ainsi, la possibilité que les bactéries extraites à l’aide du p.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
		de 0,17 mm	Pas d’exigences particulières
Maille métallique de 1,6 x 1,6 mm	Grillage	fibre de verre Pots
		de 10 cm de diamètre	Aucune exigence particulière
Boîtes de Pétri de 140 mm Pas			d’exigences particulières
Seringue			Pas d’exigences particulières
Tubes coniques de 50 mL	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicilline sodique	GoldBio
Gélose bactériologique	Roko
Microscope confocal Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Sulfate de gentamycine	Duchefa	G-0124
Monosulfate de kanamycine	Phytotechnologie	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
	Parafilm Pechiney Emballage
Substrat			Aucune exigence particulière
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Cure-dents Pas d’exigences			particulières
Tryptone	Merk
Pince à épiler			Pas d’exigences particulières
Chambre à vide 25 cm de diamètre	Kartell	554
Pompe à vide	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			Aucune exigence particulière
Extrait de levure	Merk

Lamelle en de 20 mL en plastique de l’installation